周詩晨 儀治本 王馨翊 楊曉穎 孫麗娜 欒維江 梁閃閃

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗室，天津300387；2.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，太原 030051）

高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］是世界第五大谷類作物，包括谷物高粱、飼用高粱和生物質(zhì)/甜高粱等，用途廣泛。與其他作物相比，高粱具有更高的抗逆性，能適應(yīng)干旱、鹽堿化和高溫。此外，由于高粱基因組相對較小（約800 Mb），且已完成測序，使它成為玉米、甘蔗等基因組復(fù)雜的C4生物的遺傳模型［1］。穗粒數(shù)是高粱等禾本科作物最重要的產(chǎn)量構(gòu)成因素之一，高粱花器官發(fā)育不僅是植株形態(tài)建成的重要事件，也可能直接影響穗粒數(shù)，進(jìn)而影響作物產(chǎn)量［2］。因此，鑒定和克隆高粱花器官發(fā)育新基因?qū)ε嘤弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)的高粱品種具有重要意義。

目前，在擬南芥和水稻等禾本科植物中已鑒定和克隆了多個與花器官發(fā)育相關(guān)的基因，如水稻花器官突變體 fon1（floral organ number 1）、fon2、fon3、fon4、fon5、fon6均表現(xiàn)出多花器官或多籽粒性狀，除FON5與FON6，其他基因均已被克隆，并在調(diào)控和維持水稻的花分生組織中起重要作用［3-10］。高粱多粒突變體國內(nèi)外研究較少，研究結(jié)果尚不統(tǒng)一。早在1916年，Cron［11］在一個雜交種中發(fā)現(xiàn)了幾個三粒種子和大量雙粒種子小穗，將三粒小穗的種子種植以后，發(fā)現(xiàn)這種異常得到遺傳，并且三粒小穗的種子除了稍扁平外，與正常單粒小穗的種子沒有差別；1936年，Karper等［12］發(fā)現(xiàn)幾個高粱突變體植株，主要表現(xiàn)為小花內(nèi)沒有花藥，在中心子房周圍有1-6個數(shù)目不等的次級子房，次級子房數(shù)3個居多，它們通常有1個或2個柱頭，極少數(shù)情況下有3個柱頭，產(chǎn)生的種子數(shù)目和大小受子房數(shù)、營養(yǎng)、環(huán)境等因素影響，且為隱性遺傳；1935年，在feterita×Sudan雜交的F3代植株中發(fā)現(xiàn)有些植株有梗小穗正常發(fā)育并結(jié)實(shí)，只是種子略小于無梗小穗的種子。Jiao等［13］報道由EMS誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變體msd1，其有梗小穗和無梗小穗都可以產(chǎn)生正常的種子，經(jīng)鑒定，該突變體是由MSD1的堿基突變，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變，且突變性狀為隱性遺傳。對其機(jī)制進(jìn)行探究表明，MSD1編碼TCP轉(zhuǎn)錄因子，通過激活JA的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制有梗小穗的發(fā)育［14］；Casady等［15］對高粱雙粒性狀進(jìn)行報道，表明雙粒是顯性性狀，但是基因型和環(huán)境均顯著影響雙粒形成的比率；梁小紅等［16］對高粱TW960雙粒結(jié)實(shí)特性進(jìn)行遺傳分析，表明TW960雙粒特性是單基因控制的顯性遺傳，受環(huán)境影響較小。復(fù)粒高粱材料SZ0和10個國內(nèi)外高粱雙粒品種分別與普通單粒品種雜交，遺傳分析發(fā)現(xiàn)不同的品種的雙?；蝻@隱性不同，且不同的品種復(fù)粒率的差距較大［17］。

迄今為止，國內(nèi)外對雙粒高粱的研究大部分集中在遺傳分析，而在雙粒高粱基因定位和克隆方面的研究相對較少。天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗室前期在田間發(fā)現(xiàn)1個雙粒高粱突變體（double-grain，Dgs），該突變體花器官數(shù)目異常、結(jié)雙籽粒。

本研究利用Dgs雙粒突變體材料與單粒高粱品種晉粱5號組配雜交組合，獲得F2分離群體，對目標(biāo)性狀進(jìn)行遺傳分析，并采用BSA-seq測序與圖位克隆相結(jié)合的方法對控制高粱雙粒的目的基因進(jìn)行定位，為進(jìn)一步分離克隆目的基因以及研究其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

高粱雙粒突變體Dgs是田間自然突變體，經(jīng)過連續(xù)多代套袋自交種植，確定突變性狀能穩(wěn)定遺傳。野生型材料是晉粱5號。用晉粱5號與高粱雙粒突變體Dgs組配雜交組合，獲得F1植株，將F1種子種植得到F2群體。2個親本和F2群體共同種植于天津師范大學(xué)試驗田用于遺傳分析和基因定位。試驗田進(jìn)行常規(guī)的田間管理。

1.2 方法

1.2.1 突變體表型觀察 在高粱的開花期，從突變體材料和野生型材料中隨機(jī)選取小花在體視顯微鏡下進(jìn)行觀察，主要觀察其雄蕊數(shù)目和雌蕊數(shù)目以及形態(tài)變化。籽粒灌漿后期，分別觀察兩親本材料的每個小花上的籽粒數(shù)目及形態(tài)變化。

1.2.2 遺傳分析 種植雜交種，獲得F1植株，田間觀測植株的花器官及籽粒的表型。種植F1種子獲得F2分離群體，在種植F1和F2時，同時種植雙粒突變體和野生型晉粱5號。對F2群體中雙粒表型植株和單粒表型植株的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，計算二者分離比，利用卡方測驗，檢驗其分離比是否符合孟德爾遺傳規(guī)律。并根據(jù)分離情況，分析該基因的遺傳特征。

1.2.3 BSA-seq分析 利用混合群體分離分析法（bulked segregant analysis，BSA）進(jìn)行基因初步定位，在F2群體雙粒型單株和野生型（單粒）單株分別選取60株，采用CTAB法提取DNA，等量混合所選單株的DNA，構(gòu)建單粒表型和雙粒表型的DNA混池（S池和D池），和2個親本一起送至百邁客生物科技公司，利用Illumina HiSeq PE150平臺進(jìn)行全基因組重測序，測序平均深度為30×。測序后的數(shù)據(jù)通過BWA 0.7.10軟件的mem方法［18］比對到高粱的參考基因組［19］；比對結(jié)果利用軟件 SAMtools 0.1.19［20］去除重復(fù)數(shù)據(jù)（參數(shù)為rmdup），并進(jìn)行SNP檢測；利用BCFtools軟件對檢到的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，親本中的SNP過濾標(biāo)準(zhǔn)是Q＜10，DP＜5，多等位，或者雜合型。最后篩選出在雙粒突變體和晉粱5號2個親本間有多態(tài)的SNP，利用QTLseqr［21］R數(shù)據(jù)包進(jìn)行基因的定位分析。使用滑動窗口策略來繪制2個混池的SNP-index圖（以1 Mb為窗口，100 kb為步長）。得到2個混池的SNP-index圖后，計算分離位點(diǎn)在2個極端池中基因頻率的差值（△SNP-index），并過濾掉＜0.1的位點(diǎn)，然后計算每個SNP的G'值，并采取滑動窗口的策略繪圖，滑動窗口以1 Mb的窗口大小和100 kb的步長繪制平均G'值。

1.2.4 目的基因的連鎖分析 在初步定位的候選區(qū)間內(nèi)，根據(jù)兩親本的重測序結(jié)果和已公布的高粱參考基因組序列，設(shè)計Indel和SSR分子標(biāo)記，利用 NCBI的 Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?link_loc=blasthome）進(jìn)行引物設(shè)計。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，然后對F2代隱性單株個體進(jìn)行連鎖分析，進(jìn)一步縮小定位區(qū)段。PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 1 μL、10×buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL、5 μmol/L 引物各 1 μL、5 U/μL DNA 聚合酶 0.2 μL，以ddH2O 補(bǔ)足至 20 μL。反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55-60℃ 30 s（依據(jù)引物的不同退火溫度進(jìn)行調(diào)整）；72℃ 30 s（不同長度的產(chǎn)物延伸時間不同，按照1 kb/min進(jìn)行調(diào)整）；35個循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。DNA Taq酶采購自大連TaKaRa公司，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%-4%的瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后于紫外下觀察拍照并進(jìn)行條帶分析。

2 結(jié)果

2.1 雙粒突變體的表型特征

正常情況下，野生型晉粱5號的小花有3個雄蕊、1個子房以及1對羽狀柱頭，相應(yīng)的，1對穎殼內(nèi)只結(jié)一粒種子。與野生型相比，突變體Dgs的小花有4-7個雄蕊，2個子房，每個子房上各有1對羽狀柱頭，這兩個子房均可育，結(jié)實(shí)后形成一殼兩粒的表型，同一穎殼的2個籽粒的形態(tài)大小并無顯著差異，而且均具有發(fā)芽能力（圖1）。突變體Dgs的小花偶爾出現(xiàn)4個或5個雄蕊，2個雌蕊；或者6個或7個雄蕊，3個雌蕊，形成一殼三籽粒。此類一殼多籽粒的植株所占比例不足1‰。

圖1 野生型晉粱5號和突變體Dgs小花及籽粒的表型Fig.1 Phenotype of the floret and grain of wild-type S.bicolor Jin 5 and mutant Dgs

2.2 遺傳分析

將野生型晉粱5號與雙粒突變體Dgs雜交，F(xiàn)1代植株所結(jié)的籽粒均表現(xiàn)為雙粒性狀，表明該突變性狀表現(xiàn)顯性遺傳。F2代群體植株的小花出現(xiàn)1個雌蕊3個雄蕊和2個雌蕊6個雄蕊，相應(yīng)植株所結(jié)的籽粒，出現(xiàn)一殼單粒和一殼雙粒2種表型，表現(xiàn)出明顯的分離，雙粒表型植株313個，單粒表型植株117個，經(jīng)卡方檢驗發(fā)現(xiàn)（表1），表型符合3∶1分離比例，表明該突變體性狀受1對顯性基因控制。

表1 晉粱5號×Dgs F2群體表型統(tǒng)計分析Table 1 Statistical analysis of phenotype of F2 population from S.bicolor Jin 5×Dgs

2.3 Dgs定位

2.3.1 親本及F2群體單雙粒單株BSA混池測序 測序共獲得約383.21 M初始測序reads數(shù)，為保證信息分析質(zhì)量，對初始測序reads進(jìn)行過濾，得到Clean reads，用于后續(xù)信息分析。數(shù)據(jù)過濾的主要步驟如下 ：（1）去除帶接頭（adapter）的 reads；（2）過濾N含量超過10%的reads；（3）去除質(zhì)量值低于10的堿基超過50%的reads。最后獲得過濾后的堿基數(shù)為114.73 Gb，Q30平均達(dá)到93.36%。平均每個親本產(chǎn)生數(shù)據(jù)量為11 Gb Clean data，每個混池產(chǎn)生數(shù)據(jù)量為44 Gb Clean data，保證Q30達(dá)到80%。GC含量在43.25%-43.86%（表2）。綜上所述，親本和2個混池樣本的數(shù)據(jù)量足夠，測序質(zhì)量合格，GC含量分布正常，建庫測序成功。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況Table 2 Statistics from the qualities of the sequencing

2.3.2 BSA-seq分析 對上述獲得的過濾后測序數(shù)據(jù)與已發(fā)布的高粱基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對組裝，參考基因組大小為 655.2 Mb（V3）［19］。然后進(jìn)行 SNP calling和篩選，最后篩選出在雙親之間有多態(tài)性的有效SNP位點(diǎn)共3 894 375個。利用這些多態(tài)性SNP進(jìn)行突變基因定位（BSA-seq）。利用QTLseqr R數(shù)據(jù)包計算各個SNP位點(diǎn)的△SNP-index，同時計算G'值，并采取滑動窗口的策略繪圖?？梢悦黠@檢測到位于高粱的第6染色體末端有一個峰值（圖2），物理區(qū)間約為10.01 Mb，表明該突變性狀與高粱第6染色體上這個區(qū)段的SNP標(biāo)記具有明顯的連鎖效應(yīng)。

2.3.3 隱性個體驗證候選區(qū)段內(nèi)的連鎖標(biāo)記分析 為了驗證BSA-seq定位結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)兩親本間序列差異，在候選關(guān)聯(lián)區(qū)間及其鄰近位置的變異位點(diǎn)處設(shè)計了15對Indel分子標(biāo)記，并對2個親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Indel2930和Indel6958顯示多態(tài)性，引物信息見表3。然后用這兩個標(biāo)記對F2代群體中的純合隱性單粒單株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩個分子標(biāo)記明顯與目標(biāo)性狀表現(xiàn)連鎖（圖3），117個隱性單株在Indel2930和Indel6958標(biāo)記處分別有9個和10個重組個體，因此，將Dgs定位于Indel2930和Indel6958之間，物理距離為680 kb。為了進(jìn)一步縮小定位區(qū)段，又在該區(qū)段內(nèi)設(shè)計了9對Indel引物和26對SSR引物，其中有5對引物在雙親之間有多態(tài)性，引物信息見表3。用這些標(biāo)記對隱性純合單粒單株進(jìn)行連鎖分析，最終將突變基因定位在Indel2930和SSR7060之間，物理距離為404 kb（圖4）。

圖4 Dgs的遺傳連鎖圖譜Fig.4 Genetic linkage map of the Dgs gene

表3 Dgs連鎖分析的主要引物信息Table 3 Information of primers used for linkage analysis of Dgs

圖3 部分F2代隱性單株的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 PCR agarose gel electrophoresis of partial F2 recessive individuals

3 討論

小穗是禾本科植物各種類型花序結(jié)構(gòu)的構(gòu)成單位。高粱小穗根據(jù)其與花序分枝的連接方式分為2種類型：無梗小穗（sessile spikelet，SS）直接連接到花序分支上，而有梗小穗（pedicellate spikelet，PS）通過稱為花梗的短葉柄連接到花序分支上［2］。一般情況下，只有SS能產(chǎn)生可育的花和籽粒，SS上著生的小花內(nèi)有3個雄蕊和1個雌蕊，所產(chǎn)生的籽粒也是一殼一粒；而PS能產(chǎn)生雄花器官或根本沒有花器官。本研究發(fā)現(xiàn)一個突變體Dgs，其無柄小穗上的小花中有2個雌蕊，6枚雄蕊，最終導(dǎo)致了一殼雙籽粒的性狀。之前報道的研究較為深入的高粱有柄小穗突變導(dǎo)致多籽粒性狀的突變體msd1，其有柄小穗（PS）能正常發(fā)育，產(chǎn)生有活力的種子［14］。本研究所發(fā)現(xiàn)的雙籽粒突變體與msd1突變體屬于不同的突變類型。

本研究利用單粒和雙粒突變體雜交產(chǎn)生的F2分離群體進(jìn)行遺傳分析及BSA-seq基因定位最終將該突變基因定位于高粱第6染色體404 kb區(qū)段內(nèi)。此前有報道高粱一殼雙粒突變性狀，認(rèn)為雙粒是顯性遺傳性狀，但是雙粒形成的比率容易受到基因型和環(huán)境影響［15］。高粱TW960雙粒特性是單基因控制的顯性遺傳，受環(huán)境影響較?。?6］。復(fù)粒高粱材料SZ0以及10個國內(nèi)外高粱雙粒品種的雙?；蛴酗@性也有隱性，且不同的品種復(fù)粒率的差距較大［17］。這些有關(guān)雙粒突變體研究僅限于遺傳分析，沒有高粱雙?；虻亩ㄎ缓涂寺〉膱蟮?。本文所定位的Dgs，是高粱中第一個定位的無柄小穗雙粒突變性狀基因。

擬南芥和水稻多籽粒性狀已有一定研究，也已克隆了相關(guān)基因。在擬南芥中，CLV1編碼一個富含亮氨酸重復(fù)的類受體蛋白激酶，CLV2編碼一個類似的蛋白，它有一個亮氨酸重復(fù)（leucine rich repeat，LRR）結(jié)構(gòu)域，但缺乏細(xì)胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，這兩種蛋白質(zhì)被認(rèn)為形成異源二聚體，LRR結(jié)構(gòu)域似乎在配體結(jié)合中起作用。CLV3編碼一個包含CLE結(jié)構(gòu)域的小分泌蛋白，并作為CLV1-CLV2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體的假定配體。CLV發(fā)生突變，不能抑制WUSCHEL（WUS）的活性，分生組織干細(xì)胞狀態(tài)不能正常維持，導(dǎo)致頂端分生組織、花序分生組織以及花分生組織的增大，最終造成花器官數(shù)目增加，花器官形態(tài)發(fā)生變化［22］。水稻中發(fā)現(xiàn)一系列的花器官突變體fon1、fon2、fon3、fon4、fon5、fon6、fon（t）等都表現(xiàn)出多雌蕊現(xiàn)象［23］。FON2和FON4與擬南芥CLV3同源，在維持水稻的花分生組織中起重要作用［5-6］。FON1與擬南芥CLV1同源。基因FON1、FON5、FON6突變造成花分生組織增大，進(jìn)而使花器官數(shù)目改變，但是營養(yǎng)分生組織和花序分生組織未見明顯差異。而FON3除了影響花器官數(shù)目，還參與穗部發(fā)育調(diào)控［7］。水稻花器官突變基因大多都與擬南芥CLV基因同源，表明CLV調(diào)控分生組織大小的途徑在雙子葉植物和單子葉植物中具有功能上的保守性。此外，MADS-box類基因也和花器官發(fā)育相關(guān)，如擬南芥中的AP1、AP3、PI和AG，以及水稻的OsMADS16等［24-27］。本研究中Dgs定位區(qū)段內(nèi)的53個基因在數(shù)據(jù)庫Phytozome進(jìn)行基因功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)有一個基因與AP2相關(guān)。另外，還有一個基因編碼與CLE相似的蛋白，可能與CLV3同源。需要進(jìn)一步研究確定Dgs的候選基因。

4 結(jié)論

田間自然突變體Dgs小花有4-7個雄蕊，2個子房，每個子房上各有1對羽狀柱頭，結(jié)實(shí)后形成一殼兩粒的表型。該性狀受1對顯性基因調(diào)控，Dgs定位于高粱第6染色體Indel2930和SSR7060標(biāo)記之間，物理距離為404 kb，是一個全新的高粱雙粒突變基因。