張艷艷，劉 睿，楊文明，劉曉闖，韓燕全

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)中心，安徽 合肥 230031）

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）是一種從設(shè)計(jì)初期通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPPs）和關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs），建立滿足藥品質(zhì)量要求且穩(wěn)定的工藝設(shè)計(jì)空間，用設(shè)計(jì)空間確定其質(zhì)量控制策略和藥品質(zhì)量體系[1]。智腦膠囊系安徽省中醫(yī)院國家級重點(diǎn)?？颇X病科的特色制劑，主治阿爾茲海默?。ˋD），臨床應(yīng)用近20 年療效確切，該處方由八味中藥組成，其中以黃芪、黨參、肉蓯蓉為君藥，具有健脾益腎、豁痰化瘀、開竅健腦之功效[2]。本研究基于 QbD 理念對智腦膠囊提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，保證該制劑提取工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可靠。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Acquity 超高液相色譜儀（美國Waters 公司）；ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm ×100 mm，1.8-Micron）（美國安捷倫科技公司）；1510型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.1.2 試藥 黨參（批號(hào)：2101091）、黃芪（批號(hào)：2011113）、酒黃精（批號(hào)：2010133）、肉蓯蓉（批號(hào)：2012012）、郁金（批號(hào)：2012043）、石菖蒲（批號(hào)：2101062）、川芎（批號(hào)：2010251）、地龍（批號(hào)：2004221）均由安徽普仁中藥飲品有限公司提供，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院韓燕全主任中藥師鑒定為正品，松果菊苷對照品（批號(hào)：111670-200503）、毛蕊異黃酮苷（批號(hào)：111920-201505） 、阿魏酸對照品（批號(hào)：110773-201915）、黨參炔苷對照品（批號(hào)：DSTDD003501）均購于中國食品藥品檢定研究院；D-無水葡萄糖（批號(hào)：C12301890，Macklin 公司）；乙腈（色譜純，Acetonitrile 公司）；甲醇（色譜純，Sigma-Aldrich 公司）；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研確定CQAs

通過TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫，設(shè)定OB ≥30% 、DL ≥0.18[3]為條件篩選出智腦膠囊各味中藥的活性成分共54 個(gè)以及對應(yīng)靶點(diǎn)278 個(gè)，在UniProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫檢索確認(rèn)智腦膠囊活性成分對應(yīng)基因24 個(gè)；通過GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫[4]，以Score ≥10 為條件篩選得到疾病AD 對應(yīng)的基因1 482 個(gè)；用Venny 圖取智腦膠囊與AD 共同作用基因交集，見圖1。使用Cytoscape v_3.7.2 軟件構(gòu)建活性成分-疾病基因的網(wǎng)絡(luò)圖，確定智腦膠囊中毛蕊異黃酮（MOL000417）等54 個(gè)關(guān)鍵成分作用于AD 10個(gè)基因，見圖1。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，最終確定以固體物質(zhì)提取量、多糖含量、松果菊苷[5]、黨參炔苷[6]、毛蕊異黃酮苷[7]、阿魏酸[8]含量為智腦膠囊的CQAs。

圖1 智腦膠囊中活性成分基因與AD 基因的Venny 圖及活性成分-疾病基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 Venny diagram of active ingredient gene and AD gene in Zhinao capsule and active ingredient disease gene network diagram

1.2.2 CPPs 的篩選及風(fēng)險(xiǎn)評估 使用魚骨圖為關(guān)鍵工藝風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)識(shí)手段來確定潛在關(guān)鍵工藝參數(shù)（pCPPs）[9]。采用失效模式及效應(yīng)分析方法（FMEA）對魚骨圖提供的因素進(jìn)行篩選，采用風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先系數(shù)（RPN）作為FMEA 的評價(jià)指標(biāo)，見圖2。基于文獻(xiàn)調(diào)研和提取經(jīng)驗(yàn)，對智腦膠囊的提取工藝中失效事件發(fā)生頻率（P）、嚴(yán)重程度（S）、可檢測程度（N）進(jìn)行估計(jì)，根據(jù)公式RPN = S × P × N 計(jì)算出風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先系數(shù)。并將每個(gè)單元按照影響大小從低到高分為1 ～ 10個(gè)等級，根據(jù)RPN = S × P × N 公式計(jì)算出風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先數(shù)值，將RPN 按照低水平（RPN ＜ 100）、中水平（100 ＜RPN ＜ 500）、高水平（RPN ＞ 500）分為3 個(gè)等級[9]。

圖2 智腦膠囊提取工藝參數(shù)風(fēng)險(xiǎn)魚骨圖Fig. 2 Fish bone diagram of extraction process parameters of Zhinao capsule

根據(jù)表1 的RPN 值，得出提取次數(shù)、提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比處于高水平，因此將這4 個(gè)因素作為智腦膠囊提取工藝的CPPs 進(jìn)行考察。

表1 智腦膠囊提取工藝潛在關(guān)鍵參數(shù)風(fēng)險(xiǎn)評估表Tab. 1 Risk assessment of potential key parameters of Zhinao capsule extraction process

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于以上分析，以浸膏得率（Y1）、多糖含量（Y2）、松果菊苷（Y3）、毛蕊異黃酮苷（Y4）、阿魏酸（Y5）、黨參炔苷（Y6）為CQAs，以提取次數(shù)（X1）、乙醇濃度（X2）、提取時(shí)間（X3）和液料比（X4）作為CPPs。結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，以CQAs 為影響因素、CPPs 為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 10 設(shè)計(jì)安排四因素三水平試驗(yàn)[10]，按表2 設(shè)計(jì)的因素水平取智腦膠囊處方量藥材共計(jì)33.3 g，加熱回流提取過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃、40 rpm的條件下濃縮，用容量瓶將濃縮液定容至50 mL，得各組樣品溶液。

表2 Box-Behnken 工藝參數(shù)及水平Tab. 2 Box-Behnken process parameters and level

1.2.4 供試品溶液的制備 取各組樣品溶液適量，12 000 r/min 離心5 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.2.5 多糖對照品溶液的制備 精密稱定干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品粉末0.1 g，加蒸餾水定容至50 mL容量瓶中，配制成2 mg/mL 的葡萄糖對照品溶液。

1.2.6 指標(biāo)成分對照品溶液制備 精密稱取適量松果菊苷、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、黨參炔苷對照品，得到濃度依次為 0.042 mg/mL、1.203 mg/mL、0.195 mg/mL、0.581mg/mL 的對照品溶液。

1.2.7 混合標(biāo)準(zhǔn)品配制 分別精密量取“1.2.6”項(xiàng)下方法制備的對照品溶液：松果菊苷對照品50 μL、毛蕊異黃酮苷對照品50 μL、阿魏酸對照品100 μL、黨參炔苷對照品20 μL，置于5 mL 容量瓶用甲醇定容至刻度，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.8 多糖含量測定 精密吸取“1.2.4”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液0.2 mL，轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中，加無水乙醇定容，12 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，離心管底部沉淀物用無水乙醇反復(fù)洗滌至無色，N2揮干乙醇，將沉淀物加蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容至25 mL，精密吸取各組供試品溶液0.5 mL，以蒸餾水為空白組，并將各組供試品溶液置于10 mL具塞刻度試管，在490 nm 處測其吸光度值。根據(jù)回歸方程計(jì)算供試品溶液多糖含量[11]。

1.2.9 指標(biāo)成分含量測定 分別量取“1.2.6”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液適量，用UPLC 檢測指標(biāo)成分含量，檢測波長為260 nm，進(jìn)樣量為2 μL，流速為0.25 mg/mL，柱溫為30 ℃。

1.2.10 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8-Micron）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）[7,12-14]，洗脫梯度見表3。

表3 樣品洗脫梯度Tab. 3 Sample elution gradient

1.2.11 浸膏含量測定 取各組樣品溶液10 mL 置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，105 ℃干燥 5 h，移至干燥器中冷卻 30 min，迅速精密稱定并計(jì)算浸膏得率[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取葡萄糖對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于10 mL 具塞試管中，加入1 mL 現(xiàn)配的5%苯酚溶液和5 mL 濃硫酸，加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，50°C 水浴加熱20 min，取出后冰浴10 min，用蒸餾水作為空白對照組，用酶標(biāo)儀測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，得回歸方程為：Y= 1.819 5X- 0.421 8，R2= 0.999 4，表明在0.08 ～ 0.24 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 指標(biāo)成分含量測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取各對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，按“1.2.10”項(xiàng)下色譜條件測定松果菊糖、阿魏酸、黨參炔苷以及毛蕊異黃酮苷峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，得回歸方程，結(jié)果R2均大于0.999，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表4。

表4 智腦膠囊線性關(guān)系測定結(jié)果Tab. 4 Determination results of linear relationship of Zhinao capsule

2.3 醇提工藝的Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在“1.2.10”色譜條件下，供試品中松果菊苷、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、黨參炔苷色譜峰之間分離度良好且無其它峰干擾，出峰時(shí)間與對照品、混合對照品出峰時(shí)間基本一致，見圖3。

圖3 智腦膠囊UPLC 圖Fig. 3 UPLC diagram of Zhinao capsule

Y1-Y6為響應(yīng)值的四因素三水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表6。通過分析，固體物質(zhì)提取量的一次項(xiàng)和二項(xiàng)式回歸總模型方差顯著（P＜ 0.05），失擬值不顯著（P＞ 0.05），一次項(xiàng)模型的失擬值小于二次項(xiàng)模型，因此選擇二次項(xiàng)模型。Y2、Y3、Y4含量一項(xiàng)式方差不顯著（P＞ 0.05），二項(xiàng)式回歸總模型方差顯著（P＜ 0.05）且失擬值不顯著（P＞ 0.05），因此選用二次項(xiàng)模型。Y5、Y6總模型方差均不顯著（P＞ 0.05），準(zhǔn)確的關(guān)系模型無法建立。模型信噪比S/N ＞ 4,表明模型的預(yù)測精密度良好,可以用于設(shè)計(jì)空間。4 個(gè)因素對各個(gè)物質(zhì)含量影響程度見表7，其中，X3在3 個(gè)模型中P＜ 0.05，表明提取時(shí)間對Y1、Y2、Y3影響明顯。

表5 智腦膠囊四因素三水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 5 Experimental results of Zhinao capsule

表6 智腦膠囊 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差結(jié)果Tab. 6 Variance results of Box-Behnken experiment of Zhinao capsule

表7 4 種因素對物質(zhì)含量影響程度Tab. 7 Influence degree of four factors on substance content

2.4 模型評價(jià)

采用二項(xiàng)式回歸對4 個(gè)CQAs 及對應(yīng)的CPPs 進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得按編碼因素計(jì)算的最終回歸方程如下：

對Box-Behnken 設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，Y1-Y4的二項(xiàng)式回歸總模型方差顯著且失擬值不顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其擬合系數(shù)R2分別是0.806 4、0.720 8、0.735 4、0.730 8分別是0.612 7、0.441 6、0.470 8、0.461 5，擬合度良好。

2.5 響應(yīng)面分析

從成分等高線圖4 分析，浸膏得率隨乙醇濃度升高而減少，隨提取次數(shù)、提取時(shí)間、液料比的增加而增加。多糖含量隨乙醇濃度增加而減少，隨提取次數(shù)增加而增加。松果菊苷成分含量隨提取次數(shù)、液料比、提取時(shí)間增加而增加，在乙醇濃度75%左右時(shí)松果菊苷成分含量最高。毛蕊異黃酮苷含量隨提取次數(shù)、液料比增加而增加，隨著乙醇濃度增加而減少。以上分析結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖4 CPPs 和CQAs 相互關(guān)系等高線圖Fig. 4 Contour map of the relationship between CPPs and CQAs

2.6 建立設(shè)計(jì)空間及驗(yàn)證

設(shè)定各成分提取含量最大值的55%為優(yōu)化目標(biāo)，即X1≥20.16 % ，Y2≥123.48 μg，Y3≥226.88 μg，Y4≥2 971.21 μg 構(gòu)建設(shè)計(jì)空間取置信水平α = 0.05，用Overlay Plot 展示，如圖5，黃色區(qū)域?yàn)橹悄X膠囊提取工藝的設(shè)計(jì)空間：X1為1.72 ～ 3.17 次、X2為68.37% ～77.30%、X3為57.10 ～ 86.16 min、X4為9.52倍～ 10.74 倍。結(jié)合工藝生產(chǎn)實(shí)際情況，最終確定智腦膠囊最佳醇提工藝為X1為2 次、X2為75%、X3為60 min、X4為10 倍。

圖5 智腦膠囊醇提工藝設(shè)計(jì)空間Fig. 5 Design space of alcohol extraction process of Zhinao capsule

取空間內(nèi)、空間外、置信區(qū)間內(nèi)共6 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果見表8，結(jié)果表明在空間內(nèi)、置信區(qū) 間 內(nèi) 均 能 滿 足Y1≥20.16%、Y2≥123.48 μg，Y3≥226.88 μg、Y4≥2 971.22 μg，達(dá)到預(yù)期設(shè)計(jì)目標(biāo)，空間外則不能完全滿足上述條件。

表8 智腦膠囊空間設(shè)計(jì)驗(yàn)證及結(jié)果Tab.8 Space design verification and results of Zhinao capsule

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇浸膏得率、多糖含量和各指標(biāo)成分含量為關(guān)鍵質(zhì)量屬性。浸膏得率能反應(yīng)中藥復(fù)方制劑提取效果。方劑中藥多糖類成分含量高，故選擇多糖含量作為檢測指標(biāo)。松果菊苷、阿魏酸、黨參炔苷分別為2020 年版《中國藥典》中肉蓯蓉、川芎、黨參的質(zhì)控檢測指標(biāo)，毛蕊異黃酮苷是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選與疾病AD 的治療密切相關(guān)的成分。最終將固體物質(zhì)提取量、多糖含量、松果菊苷、黨參炔苷、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸含量作為智腦膠囊的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

本實(shí)驗(yàn)中阿魏酸和黨參炔苷含量總模型方差不顯著，數(shù)據(jù)分析顯示阿魏酸在75%乙醇濃度最高，但是趨勢不明顯，可能與阿魏酸同時(shí)易溶于熱水、乙醇溶劑的性質(zhì)有關(guān)。黨參炔苷在本實(shí)驗(yàn)中隨著提取時(shí)間增加濃度呈下降趨勢，而在60% ～ 90%乙醇濃度范圍內(nèi)，黨參炔苷含量隨乙醇濃度提高而緩慢增加，可能與黨參炔苷易溶于乙醇難溶于水，并隨著溫度升高而分解有關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于QbD 理念，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理和文獻(xiàn)調(diào)研確定關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)，通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化智腦膠囊提取工藝，建立了工藝生產(chǎn)設(shè)計(jì)空間，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測結(jié)果基本一致，說明提取工藝穩(wěn)定有效，為藥品制劑工藝開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。后期可以通過UPLC-Q-TOF-MS 對該藥進(jìn)行全成分分析，結(jié)合體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定智腦膠囊治療AD的有效成分。