李 賀，肖洪賀，陳吉聰，趙宇萌，田 雨，田晉明，楊靜嫻

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

阿爾茨海默病（AD）是一種以淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑和Tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要病理特征，以進(jìn)行性記憶力減退和認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。

根據(jù)美國《World Alzheimer Report 2019》報告顯示，全球目前AD 患者人數(shù)超過5 000 萬，2019年全球用于治療AD 的總支出達(dá)1 萬億美元，預(yù)計2050 年患者人數(shù)將會高達(dá)1.52 億[2]。

AD 在中醫(yī)學(xué)中屬癡呆范疇[3]，其病位在腦，與腎關(guān)系密切。病機(jī)為髓減腦消，神機(jī)失用[4]。干細(xì)胞與“腎精”在生命起源和生理功能上有較多共性[5]，認(rèn)為兩者具有同一性。NSCs 分化形成的各類神經(jīng)細(xì)胞組成腦髓，腎中精氣化生為髓，上充于腦，是腦髓形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此中樞神經(jīng)再生可認(rèn)為是精氣化生為髓在細(xì)胞層次的反映。腦為髓海，髓海的充盈有賴于腎中精氣的化生與充養(yǎng)，AD 患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞缺失的根本原因在于腎精不足，髓海虧虛，因此通過補(bǔ)益腎精，充盈腦髓，即激活并促進(jìn)體內(nèi)干細(xì)胞增殖與分化，或能起到修復(fù)再生受損組織、恢復(fù)功能的作用。

參棗健腦口服液（SZJN）具有益氣健脾、養(yǎng)心安神之功效，臨床常用于治療神經(jīng)衰弱引起的心悸氣短、失眠多夢、神疲乏力、腰腿酸軟等癥。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[6]，AD 患者中睡眠障礙發(fā)生率高達(dá)44%，以睡眠量不正常、睡眠中出現(xiàn)異常行為、睡眠和覺醒正常節(jié)律性交替紊亂為表現(xiàn)。睡眠障礙可加速淀粉樣蛋白沉積，加重認(rèn)知功能紊亂，影響患者生活質(zhì)量；睡眠障礙還直接影響海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和存活，間接影響腦內(nèi)微環(huán)境從而加重神經(jīng)損傷[7]。實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn)[8]，SZJN 連續(xù)灌胃4 周能明顯改善AD 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能，促進(jìn)體內(nèi)神經(jīng)元存活和神經(jīng)干細(xì)胞的分化，但具體機(jī)制尚未清楚，因此本研究以離體培養(yǎng)的海馬NSCs 為研究對象，進(jìn)一步探究SZJN 促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化的潛在機(jī)制，為SZJN 臨床用于AD 的治療提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 參棗健腦口服液（批號：B20020138）購于通化仁民藥業(yè)股份有限公司；青-鏈雙抗（批號：J190007）購 于 美 國Hyclone 公 司；CCK-8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（G021-1-1）、LDH 乳酸脫氫酶試劑盒（A020-2-2）均購于南京建成生物工程研究所；兔抗GSK-3β 蛋白抗體（批號：WL01456）、兔抗P-GSK-3β 蛋白抗體（批號：WL03518）、兔抗β-catenin 蛋白抗體（批號：WL0962a）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔lgG（批號：WLA023）均購于沈陽萬類生物技術(shù)有限公司；兔抗β-actin 蛋白抗體（批號：bs-0061R）、抗小鼠Nestin（批號：bs-20607R）、抗小鼠Sox-2（批號：bs-0523R）抗體、兔抗小鼠CyTM3標(biāo)記二抗（批號：bs-0368R-Cy3）均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；B27 Supplement（17054-044）購于美國Gibco 公司；Human FGF-basic（100-18B）、EGF（315-09）均購于美國Pepro Tech 公司。

1.1.2 實(shí)驗儀器 Ti-S 型熒光顯微鏡（日本尼康株式會社）；C00I01HW 型CO2培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；MR-96A 型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；PowerPacTMHC 型半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；SH-510 型凝膠成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗動物 SPF 級C57BL/6 小鼠購于遼寧長生生物有限公司，合格證號為 SCXK（遼） 2017-0001。將一雄一雌兩只小鼠合籠，飼養(yǎng)于20 ～ 25 ℃環(huán)境，相對濕度為40% ～ 60%，自由飲食飲水，每日12 h 自然光照維持，晝夜交替。將孕鼠單獨(dú)一籠飼養(yǎng)直至分娩，取48 h 內(nèi)新生乳鼠用于實(shí)驗。研究中所有實(shí)驗動物及相關(guān)操作都經(jīng)過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)［編號：SYXK（遼） 2019-0004］，并嚴(yán)格按照國際實(shí)驗倫理行為準(zhǔn)則實(shí)行。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 NSCs的培養(yǎng)和鑒定 取48 h內(nèi)新生C57BL/6乳鼠，剝離海馬組織，除去腦膜和血管，打散后，加入含有0.125%EDTA 的胰酶，37 ℃消化3 min，經(jīng)70 μm 濾網(wǎng)過濾，濾液在4 ℃條件下1 500 rpm離心5 min，離心完成后加入NSCs 增殖培養(yǎng)基（DMEM/F12 + 2%B27 + 20 ng/L bFGF + 20 ng/L EGF +1%P/S）重懸細(xì)胞，于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d 半量換液。培養(yǎng)7 ～ 10 d 獲得懸浮生長的神經(jīng)球，進(jìn)行傳代，至第3 代開始后續(xù)試驗。

取第3 代神經(jīng)球，以1 × 105個/mL 細(xì)胞密度鋪于96 孔板中，在增殖培養(yǎng)基下培養(yǎng)7 ～ 10 d，選擇Nestin 和Sox-2 一抗進(jìn)行雙標(biāo)記免疫熒光染色，倒置顯微鏡下觀察。另取神經(jīng)球打散后以相同密度鋪于96 孔中，在NSCs 分化培養(yǎng)基（DMEM/F12 +10%FBS + 1%P/S）中培養(yǎng)7 ～ 10 d，免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞中GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞）、NF-M（神經(jīng)元）和NG-2（少突膠質(zhì)細(xì)胞）特異性蛋白的表達(dá)。

1.2.2 AD 細(xì)胞模型的制備 根據(jù)實(shí)驗室已建立的方法[7]，第3 代NSCs 機(jī)械性打散后用于轉(zhuǎn)染。取GFP或GFP-APP595/596 質(zhì)粒15 μg，和輔助質(zhì)粒（pLP1 6.5 μg、pLP2 2.5 μg 和pLP/VSV-G 3.5 μg）混合后，將脂質(zhì)體2000 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h 后，倒置熒光顯微鏡下觀察，可見綠色熒光。轉(zhuǎn)染72 h后，收集含有病毒的細(xì)胞上清液，進(jìn)行離心濃縮，用濃縮的病毒上清液感染打散的NSCs，感染72 h 后，熒光顯微鏡下觀察熒光情況。

1.2.3 CCK-8 檢測細(xì)胞活力 取打散的NSCs 和APP-NSCs 以1×105個/mL 細(xì) 胞 密 度 接 種 于96 孔板，在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h 后給藥，NSCs 和APP-NSCs 組給予10 μL PBS，給藥組加入10 μL 不同濃度的SZJN，每組設(shè)置6 個復(fù)孔。24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h，并用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測各組細(xì)胞的吸光度，計算細(xì)胞活力。

1.2.4 免疫熒光法檢測NSCs 的分化情況 實(shí)驗分為NSCs + PBS 組、NSCs + SZJN 組、APP-NSCs +PBS 組和APP-NSCs + SZJN 組。各組細(xì)胞在分化培養(yǎng)基下培養(yǎng)，NSCs + SZJN 組和APP-NSCs + SZJN組給予SZJN（終濃度為32 mg/mL）；7 d 后棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗1 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1 次，0.5%Triton-100 透化15 min，PBS 清洗1 次，5%BSA 封閉1 h，加入兔抗GFAP 一抗、兔抗NF-M一抗和兔抗NG2 一抗（1 ∶200），4 ℃孵育過夜。PBS 清洗2 次，加入Cy3 標(biāo)記二抗（1 ∶300）避光孵育1.5 ～ 2 h。PBS 清洗1 次，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核5 min，滴加抗熒光淬滅劑，倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5 神經(jīng)干細(xì)胞遷移實(shí)驗 將NSCs 接種于24孔板上，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育3 d 后，倒置顯微鏡下拍照。應(yīng)用Image J軟件測量神經(jīng)細(xì)胞從神經(jīng)球邊緣的遷移距離。

1.2.6 Western blot 檢測Wnt/β-catenin 通路蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞處理方式同“1.2.4”，處理后，用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，根據(jù)全蛋白試劑盒說明書提取蛋白，按照BCA 蛋白定量試劑盒說明書檢測蛋白濃度。加入5 × Loading Buffer 制備上樣緩沖液，隨后使用SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒制膠，122 V 恒壓電泳90 min，指示劑到達(dá)底部后轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入兔抗Wnt-3a、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin 和β-actin 蛋白抗體，4 ℃孵化過夜；次日加入山羊抗兔二抗孵育PVDF 膜。按試劑盒說明書配制ECL 工作液，滴加超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液，并置于凝膠成像儀中顯影。用Image J 分析條帶并計算相對灰度值。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 SZJN 對APP-NSCs 細(xì)胞活力的影響

給 予16 mg/mL 和32 mg/mLSZJN 后APP-NSCs細(xì)胞活力明顯升高（P＜ 0.05 或P＜ 0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，說明SZJN 能夠提高APP-NSCs 細(xì)胞活力，見圖1A。16 mg/mL 和32 mg/mL SZJN 組的APP-NCSs 細(xì)胞LDH 釋放量降低（P＜ 0.05 或P＜0.01），說明SZJN 能夠減輕APP-NSCs 損傷，見圖1B。以上結(jié)果說明，SZJN 能夠有效提高APP-NSCs細(xì)胞活力，減輕APP-NSCs 損傷。最終選擇32 mg/mL作為后續(xù)實(shí)驗給藥濃度。

圖1 SZJN 對細(xì)胞存活率和乳酸脫氫酶釋放量的影響（n = 6）Fig. 1 Effects of SZJN on cell viability and lactate dehydrogenase release（n = 6）

2.2 SZJN 對APP-NSCs 增殖的影響

經(jīng)過5 ～ 7 d 的培養(yǎng)，單個NSCs 可以形成多個細(xì)胞聚合的神經(jīng)球，懸浮于培養(yǎng)基中，神經(jīng)球的直徑和數(shù)量能夠反映NSCs 的增殖能力，檢測培養(yǎng)7 d 后的神經(jīng)球直徑和數(shù)量，探究SZJN 對APP-NSCs 增殖的影響。與NSCs + PBS 組比較，NSCs + SZJN 組神經(jīng)球的數(shù)量和直徑明顯增加（P＜ 0.05 或P＜ 0.01）；與APP-NSCs + PBS 組比，APP-NSCs + SZJN 組神經(jīng)球的數(shù)量和直徑顯著增大（P＜ 0.05 或P＜ 0.01），見圖2、3。以上結(jié)果說明，32 mg/mL 的SZJN 連續(xù)作用7 d對NSCs和APP - NSCs的增殖具有促進(jìn)作用。

圖2 SZJN 對APP-NSCs 增殖的影響Fig. 2 Effects of SZJN on APP-NSCs proliferation

2.3 SZJN 對APP-NSCs 分化的影響

在分化條件下培養(yǎng)7 d 后，大多數(shù)NSCs 分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，少部分分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞。與NSCs + PBS 組比較，NSCs + SZJN 組NSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例減少（P＜ 0.01），分化為神經(jīng)元的比例增加（P＜ 0.05），而分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例沒有明顯變化。同樣的，在APP-NSCs 細(xì)胞上觀察到類似的結(jié)果，SZJN 給藥組的APP-NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化減少（P＜ 0.01），而向神經(jīng)元分化增加（P＜ 0.05），少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例沒有明顯變化，見圖4、5。這些結(jié)果說明，SZJN 能夠促進(jìn)NSCs 和APP-NSCs 向神經(jīng)元方向分化。

圖3 SZJN 對神經(jīng)球直徑和數(shù)量影響的統(tǒng)計圖（n = 3）Fig. 3 Statistical diagram of the effect of SZJN on the diameter and number of neurospheres（n = 3）

圖4 免疫熒光實(shí)驗檢測GFAP、NF-M 和NG2 的表達(dá)Fig. 4 Immunofluorescence experiments detect the expression of GFAP,NF-M and NG2

圖5 各類型神經(jīng)細(xì)胞比例統(tǒng)計圖（n = 3）Fig. 5 Statistical diagram of proportion of various types of neural cells（n = 3）

2.4 SZJN 對NSCs 和APP-NSCs 神經(jīng)元遷移距離的影響

與NSCs+PBS 組相比，NSCs + SZJN 組的神經(jīng)元遷移距離增加（P＜ 0.01）；與APP-NSCs + PBS 組相比，APP-NSCs + SZJN 組的神經(jīng)元遷移距離增加（P＜0.01），見圖6、7。以上結(jié)果說明，SZJN 能夠促進(jìn)NSCs 和APP-NSCs 神經(jīng)元的遷移。

圖6 SZJN 對神經(jīng)元遷移的影響Fig. 6 Effects of SZJN on neuronal migration

2.5 SZJN 通 過 激 活Wnt/β-catenin 通 路 促 進(jìn)APP-NSCs 向神經(jīng)元分化

與NSCs 組比較，APP-NSCs 組細(xì)胞中的Wnt-3a，p-GSK-3β/GSK-3β 和β-catenin 的蛋白表達(dá)明顯降低（P＜ 0.01），而APP-NSCs + SZJN 組Wnt-3a、p-GSK-3β/GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜ 0.01）。給予阻斷劑XAV-939 孵育后發(fā)現(xiàn)，XAV-939 可 以 阻 斷SZJN 提 高p-GSK-3β/GSK-3β和β-catenin 蛋白表達(dá)的作用，但不影響Wnt-3a 的表達(dá)水平，見圖8、9。以上結(jié)果充分說明，SZJN 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路來促進(jìn)APP-NSCs 向神經(jīng)元分化。

圖7 神經(jīng)元遷移距離的統(tǒng)計圖（n = 3）Fig. 7 Statistical diagram of neuronal migration distances（n = 3）

圖8 Western blot 條帶圖Fig. 8 Western blot strip plot

3 討論

圖9 Wnt-3a、β-catenin、p-GSK-3β/GSK-3β 相對表達(dá)量統(tǒng)計圖（n = 3）Fig. 9 Statistical chart of the relative expression of Wnt-3a, β-catenin,p-GSK-3β/GSK-3β（n = 3）

《靈樞·經(jīng)脈》云：“人始生，先成精，精成而生腦髓?！蹦I藏精，受五臟六腑之精藏之。腎精能夠生氣養(yǎng)神、生髓充骨、填補(bǔ)腦髓、激發(fā)各臟腑的功能活動，維持正常的生命活動[9]。根據(jù)“腎藏精”理論，SZJN 中人參大補(bǔ)元?dú)猓餮a(bǔ)五臟，能夠補(bǔ)益腎中精氣；配伍淫羊藿、地黃、干姜，益精填髓、溫補(bǔ)腎陽，使髓?；性?，得以充養(yǎng)腦髓，激活內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生[10]，修復(fù)受損腦組織。

NSCs 具有多向分化和自我更新潛能，有可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)和退行性病變的有效手段[11]。實(shí)驗室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[8]，SZJN 能夠抑制神經(jīng)元凋亡，并促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，從而改善Aβ42聯(lián)合東莨菪堿誘導(dǎo)的AD 樣小鼠的認(rèn)知能力。

通過構(gòu)建一種模擬AD 病理特點(diǎn)的體外AD 細(xì)胞模型，來研究SZJN 對轉(zhuǎn)染APP 的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化能力的影響。經(jīng)實(shí)驗發(fā)現(xiàn)由APP 產(chǎn)生的Aβ寡聚體會抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。SZJN 能提升APP-NSCs 細(xì)胞的存活率并降低其LDH 的釋放量，具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。神經(jīng)球形成性實(shí)驗和免疫熒光染色結(jié)果顯示，與APP 組相比，SZJN 組的神經(jīng)球數(shù)目和直徑明顯提高；SZJN 組神經(jīng)干細(xì)胞可分化為更多神經(jīng)元，但分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力與APP 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Wnt/β-catenin 信號通路參與調(diào)節(jié)NSCs 的增殖、分化、突觸發(fā)生及軸突的形成，激活Wnt 信號通路可有效促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化，增加新生和成熟海馬神經(jīng)元數(shù)量。為了探索SZJN 的作用機(jī)制，我們采用Western blot 法檢測Wnt/β-catenin 信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)XAV-939 可以阻斷SZJN 提高p-GSK-3β/GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達(dá)的作用，同時不影響Wnt-3a 的表達(dá)水平。以上結(jié)果說明SZJN是通過激活Wnt/β-catenin 信號通路，抑制GSK-3β活性，并激活β-catenin 活性，在體外發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的作用。從現(xiàn)有結(jié)果來看，SZJN具有治療AD或者其它神經(jīng)退行性疾病的潛能。

4 結(jié)論

本研究從激活內(nèi)源神經(jīng)再生角度探討了SZJN 對AD 細(xì)胞模型的影響，初步證明SZJN 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，從神經(jīng)再生角度出發(fā)，為SZJN 用于AD 的治療提供了實(shí)驗依據(jù)。但作為體外實(shí)驗，本實(shí)驗結(jié)果可能具有一定的局限性，SZJN 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)神經(jīng)再生的作用有待于通過體內(nèi)實(shí)驗進(jìn)一步驗證。