李曉偉，許華，張傳強(qiáng)

南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院普外科，江蘇蘇州 215228

作為機(jī)體防御的重要屏障，腸道黏膜屏障在維持腸道菌群平衡、抵御病原菌侵襲方面發(fā)揮著重要的作用。研究報道，手術(shù)應(yīng)激、創(chuàng)傷等多種病理條件會損傷腸黏膜，增加腸黏膜通透性，導(dǎo)致微生物、毒性物質(zhì)能夠順利通過腸壁，引起炎癥反應(yīng)，甚至導(dǎo)致多器官功能障礙[1]。作為腸黏膜屏障的基礎(chǔ)屏障，機(jī)械屏障受到破壞后會增加腸道通透性，導(dǎo)致大量細(xì)菌滋生，誘發(fā)菌群易位[2]。目前臨床公認(rèn)claudin家族是構(gòu)成機(jī)械屏障的重要蛋白，主要分布在空回腸，與多數(shù)腸道疾病的形成及發(fā)展有關(guān)[3]。以往有學(xué)者在動物試驗研究中發(fā)現(xiàn)大鼠小腸I/R后，SIRT1會呈現(xiàn)出降低趨勢，考慮其能夠?qū)π∧cI/R病理生理過程起到調(diào)控作用[4]。本研究選取2014年7月—2021年7月因腸系膜血栓導(dǎo)致的部分小腸壞死行手術(shù)治療患者5例，旨在分析SIRT-1調(diào)控緊密連接蛋白claudin-4保護(hù)腸缺血再灌注后引起的屏障損傷，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批同意，選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院因腸系膜血栓導(dǎo)致的部分小腸壞死行手術(shù)治療的5例患者作為研究對象，男3例，女2例；年齡28～64歲，平均（42.54±5.32）歲,所選病例患者或家屬已知情同意。術(shù)中切除壞死腸管及部分正常腸管作為樣本，對腸內(nèi)容物予以生理鹽水沖洗，提取部分壞死和正常腸黏膜，在液氮中保存。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者經(jīng)CT、MRI檢查均確診為腸系膜血栓；②患者交流無障礙，可配合研究；③患者均行手術(shù)治療；④資料齊全，無重大器質(zhì)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重要臟器嚴(yán)重受損；②合并精神類疾病；③惡性腫瘤疾?。虎艽嬖谌砀腥景Y狀者；⑤治療期間配合度、依從性不佳或中途退出；⑥免疫功能異?；蚰系K；⑦妊娠婦女。

1.3 方法

1.3.1 Western Blot在6孔板內(nèi)接種壞死腸管及正常腸管標(biāo)本，經(jīng)過24 h處理后，采用PBS進(jìn)行3次漂洗，在每孔中加入1 mL含有濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司），經(jīng)過15 min冰浴處理后，按照12 000×g在4℃環(huán)境下進(jìn)行離心處理，時間以15 min為宜。對上清液蛋白水平采用蛋白測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）予以檢測，蛋白上樣后，設(shè)置電壓為80 V，進(jìn)行2 h電泳處理，然后調(diào)整為100 V恒壓，進(jìn)行1 h濕轉(zhuǎn)直至形成PVDF膜，完成轉(zhuǎn)膜后，采用脫脂奶粉（50 g/L）進(jìn)行1 h封閉，然后在其中加入一抗（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司），保存于4℃冰箱中過夜。進(jìn)行3次TBST洗膜，10 min/次。在其中加入二抗（上海西唐生物科技有限公司），室溫環(huán)境下進(jìn)行1 h孵育。再次進(jìn)行3次TBST洗膜，10 min/次。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑（陜西普羅安蒂生物科技發(fā)展有限公司）加入以顯影。利用復(fù)日FR-988生物顯微圖像分析系統(tǒng)（浙江恒岳儀器有限公司）采集發(fā)光信號。

1.3.2 免疫熒光將同代細(xì)胞在蓋玻片上接種，細(xì)胞生長融合后加入處理因素，將蓋玻片取出后，經(jīng)過PBS漂洗3次，10 min/次，然后采用多聚甲醛（40 g/L）（濟(jì)南雙盈化工有限公司）實施固定，時間為15 min，經(jīng)過PBS漂洗后，在其中加入濃度為5 g/L的Triton-X-100（上海索寶生物科技有限公司），經(jīng)過10 min處理與PBS漂洗，采用小牛血清清蛋白（北京凱詩源生物科技有限公司）進(jìn)行封閉處理，在室溫狀態(tài)下共封閉1 h，然后將兔抗claudin-4抗體（北京義翹神州科技股份有限公司）加入，并加入適量抗體稀釋液，切面后，在4℃環(huán)境下過夜。經(jīng)過PBS漂洗，將FITC二抗（1∶200）（上海世澤生物科技有限公司）加入，在室溫下進(jìn)行1 h孵育。再次實施PBS漂洗。采用蒸餾水沖洗，封片采用甘油，在顯微鏡下予以觀察。

1.3.3 PCR SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染，Sense序列5’CCCUGUAAAG CUUUCAGAATT-3’，Anti sense序列5’UUCUGAAAGC UUUACAGGGTT-3’。

1.3.4 HE染色 采用二甲苯I、II（沈陽依萊普克斯化工有限公司）進(jìn)行10 min脫蠟處理，分別采用100%、90%、80%、70%不同濃度酒精各進(jìn)行5 min覆水處理，并用自來水進(jìn)行沖洗，5 min/次，反復(fù)3次。給予HE染色，時間以5 min為宜。采用5%乙酸（濟(jì)南宏博利化工有限公司）進(jìn)行1 min分化，沖洗后，滴加適量乙酸，確保將玻片組織完全覆蓋。伊紅染色1 min，然后進(jìn)行脫水處理，自然風(fēng)干后封片，以5 min為宜。

1.3.5 TER檢測選擇生長狀態(tài)良好的Caco-2細(xì)胞，在6孔Transwell小室（北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）內(nèi)接種，密度為（5～10）×105個/孔，將培養(yǎng)基加入Transwell小室、孔中，設(shè)置培養(yǎng)條件：O∶2CO∶2N2=20%∶5%∶75%，溫度為37℃恒溫，進(jìn)行培養(yǎng)。每2天對培養(yǎng)基進(jìn)行1次更換，對TER采用Millicel ERS細(xì)胞電阻儀進(jìn)行連續(xù)測定，測定前，先在75%酒精中對觸筆進(jìn)行30 min浸泡，TER數(shù)值穩(wěn)定后做好記錄。單個孔內(nèi)TER計算方法為電阻值與有效膜面積的乘積，測定未接種細(xì)胞TER數(shù)值，為Rcellmonolayer=Rsample-Rcontrol。計算給予白藜蘆醇（西安博林生物技術(shù)有限公司）干預(yù)后TER的值。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗；采用Kruskal-Wallis法對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗;組間比較采用SNK法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 壞死腸管與正常腸管claudin-4表達(dá)

claudin-4在缺血壞死腸管中的表達(dá)為（0.06±0.01），明顯少于正常黏膜（0.22±0.06），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.189，P＜0.05），見圖1。

圖1 壞死腸管與正常腸管claudin-4表達(dá)

2.2 激活SIRT-1表達(dá)后claudin-4表達(dá)

SIRT-1經(jīng)過白藜蘆醇激活后，SIRT-1表達(dá)升高，claudin表達(dá)為（0.61±0.12），較正常腸管增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），HE染色可見組織破壞減輕，TER呈現(xiàn)出升高趨勢。SIRT-1表達(dá)抑制后，claudin-4表達(dá)較正常腸管減少，腸道緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞，結(jié)構(gòu)斷裂且模糊不清，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），免疫熒光結(jié)果見圖2。

圖2 激活SIRT-1表達(dá)后claudin-4免疫熒光圖

2.3 SIRT-1激活后腸黏膜屏障損傷分析

I/R后收集腸組織，實施HE染色后，在200倍光鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過白藜蘆醇處理后，小腸黏膜呈現(xiàn)完整的形態(tài)，絨毛整齊排列。充血癥狀明顯緩解，且細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞不明顯。經(jīng)過HE染色可見水腫及出血較未激活減輕，可見肺泡結(jié)構(gòu)，炎性細(xì)胞少量存在，肺水腫癥狀緩解。

2.4 激活和抑制SIRT-1對TER的影響

采用Cac0-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧6 h，對TER值進(jìn)行檢測，可以發(fā)現(xiàn)SIRT-1激活后，TER為（1 213.29±46.34）Ω·cm2，高于未激活的（992.49±24.65）Ω·cm2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.624，P＜0.001）；SIRT-1抑制后，TER降低為（426.50±33.21））Ω·cm2，與未激活比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=161.956，P＜0.001）。

3 討論

作為機(jī)體防御重要屏障，腸黏膜屏障能夠?qū)δc道內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素易位起到預(yù)防作用。大量臨床研究證實受多種病理條件影響，TNF-α?xí)尸F(xiàn)出高表達(dá)，對腸上皮細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用，在黏膜固有炎性反應(yīng)及上皮細(xì)胞脫落中具有一定的參與作用，是導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞通透性增加的主要因素，會導(dǎo)致腸屏障功能受損，誘發(fā)腸源性感染[5-6]。

作為屏障功能的重要蛋白，Claudin家族與多種腸道疾病形成有關(guān)。以往有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)多數(shù)腸道疾病伴隨claudin蛋白表達(dá)，其中claudin-1、claudin-2表達(dá)能夠反映出炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，疾病越嚴(yán)重，claudin-1、claudin-2表達(dá)量增加越明顯[7-8]。腸道上皮形成屏障蛋白為Claudin-4，其與CPE結(jié)合后會通過質(zhì)膜孔隙，上皮細(xì)胞Ca2+開放后，會導(dǎo)致不可控流入，引起細(xì)胞凋亡。claudin蛋白受損后會促使CPE與claudin蛋白基的外側(cè)膜結(jié)合，加劇細(xì)胞損傷[9]。馬遠(yuǎn)航[10]在研究中觀察了SIRT-1調(diào)控claudin-4對患者腸屏障的影響，首先建立了一個缺氧、復(fù)氧模型，在1%濃度O2下進(jìn)行12 h培養(yǎng)，然后復(fù)氧0、6、12、24、48 h，采用蛋白印跡法對SIRT-1、claudin-4表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示復(fù)氧6 h時，SIRT-1、claudin-4表達(dá)值達(dá)到最低值，為（0.12±0.01），復(fù)氧12 h時為（0.18±0.02），提示缺氧12 h、復(fù)氧6 h對細(xì)胞屏障功能損傷最為嚴(yán)重。采用藥物對SIRT-1表達(dá)進(jìn)行抑制，顯示SIRT-1下調(diào)后會導(dǎo)致claudin-4表達(dá)減少，降低腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻值，加重腸上皮屏障損傷。本研究調(diào)查研究結(jié)果，壞死腸管腸黏膜claudin-4表達(dá)量為（0.06±0.01），少于正常腸管的（0.22±0.06）（P＜0.05），提示腸缺血后，claudin-4與腸屏障損傷密切相關(guān)。作為第三類組蛋白去乙酰化酶sirtuin蛋白家族成員，SIRT-1對HDAC有著較高的依賴性，催化結(jié)構(gòu)域高度保守，能夠?qū)Χ喾N類型底物產(chǎn)生去乙?；饔肹11-12]。其通過抑制炎性因子生成途徑或減輕細(xì)胞病理損傷，可對炎性反應(yīng)起到抑制作用。以往有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)SIRT-1通過對腎臟疾病患者claudin-1基因啟動區(qū)域組蛋白的調(diào)控，能夠?qū)laudin蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)產(chǎn)生影響，使得屏障功能得到改善，提示SIRT-1在細(xì)胞屏障功能調(diào)節(jié)方面具有一定的效果[13-14]。本研究通過對SIRT-1的激活，結(jié)果顯示claudin-4表達(dá)較正常腸管增多（P＜0.05），腸I/R所致的黏膜屏障損傷得到改善。當(dāng)SIRT-1受到干擾及抑制后，claudin-4減少。提示SIRT-1可通過對claudin-4的調(diào)控，改善腸道屏障損傷[15-16]。臨床多采用TER對腸黏膜屏障功能予以評估，其降低提示腸黏膜通透性增加，伴隨腸黏膜屏障損傷[17-18]。本研究HE染色可見組織破壞減輕，TER呈現(xiàn)出升高趨勢；SIRT-1表達(dá)抑制后，TER呈現(xiàn)出降低趨勢，SIRT-1表達(dá)的激活或增加TER表達(dá)，說明SIRT-1能夠?qū)ER調(diào)控可對腸黏膜屏障起到保護(hù)作用。

綜上所述，SIRT-1通過對緊密連接蛋白claudin-4表達(dá)的調(diào)控，可對腸缺血再灌注后引起的屏障損傷起到保護(hù)作用，可作為臨床治療腸道疾病引起的SIRS及MODS的新靶點。