●周傳慶 石宇佳 王忠英 孟 雪 梁美霞※

（1.費(fèi)縣自然資源和規(guī)劃局 山東 臨沂 273499；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264025；3.費(fèi)縣國有塔山林場(chǎng) 山東 臨沂 273421；4.淄博市林業(yè)保護(hù)發(fā)展中心 山東 淄博 255000）

核桃（Juglans regiaL.）又名胡桃、羌桃，為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）落葉喬木。它與扁桃、腰果、榛子一起，被譽(yù)為世界四大干果[1]。核桃屬植物在全世界約有23個(gè)種，我國有13個(gè)種[2]。因?yàn)楹颂揖哂型怀龅慕∧X作用和豐富的營養(yǎng)價(jià)值，所以被越來越多的人所喜愛[3]。

目前核桃的播種育苗及嫁接育苗繁殖系數(shù)很低，不能滿足核桃產(chǎn)業(yè)化、品種化的需要，經(jīng)濟(jì)效益不高。通過組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行難繁樹種核桃的離體繁殖，有繁殖速度快、繁殖系數(shù)高的優(yōu)點(diǎn)，并且可以很好地保留其親本的優(yōu)良性狀[4-5]。研究表明，在核桃的組織培養(yǎng)過程中，消毒方法、取材時(shí)期和外植體種類等都會(huì)影響到其組織培養(yǎng)的成敗。近年來，中外研究人員在核桃的組織培養(yǎng)及試管苗生根等方面雖然獲得了一定的進(jìn)展，但初接種污染率高、外植體分化較難、退化嚴(yán)重、增殖系數(shù)低、容易褐變等問題一直未能得到很好解決[6]。

本試驗(yàn)針對(duì)上述問題，開展提高核桃外植體初代培養(yǎng)的成活率，減少褐變，篩選芽增殖培養(yǎng)基配方研究，構(gòu)建核桃的高效離體快繁技術(shù)。篩選出最佳的取材時(shí)間、取材部位、外植體消毒方法、組培苗初代及增殖培養(yǎng)基。通過莖尖、莖段離體培養(yǎng)的方法，縮短核桃的育苗周期，提高其繁殖系數(shù)，加速良種壯苗的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料于2019年4月上旬到6月下旬，采集核桃新芽，剪成3～4 cm的莖尖和莖段，作為本試驗(yàn)的植物材料。

1.1.2 試劑與儀器標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基（4.43 g/L），蔗糖，瓊脂，去離子水，植物激素IBA（1 mg/mL）、6-BA（1 mg/mL）、TDZ（0.1 mg/mL）， 無 菌 水，1 mol/L的NaOH溶液，75%乙醇，0.1%升汞。燒杯，錐形瓶，電子分析天平，稱量紙，磁力攪拌器，pH計(jì)，培養(yǎng)瓶，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，鑷子，剪刀，酒精燈等。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒方法采集并篩選長勢(shì)一致的核桃新芽，剪取40個(gè)莖尖和40個(gè)莖段，剪取長度均為3～4 cm，經(jīng)過2種不同的消毒滅菌操作，其中的20個(gè)莖尖、20個(gè)莖段采取以下消毒流程（方法一）：流水沖洗→75%酒精浸泡40～45 s→無菌水沖洗3遍→0.1%升汞浸泡9 min→無菌水沖洗5遍，另外的20個(gè)莖尖、20個(gè)莖段采取如下消毒流程（方法二）：流水沖洗→75%酒精浸泡30～35 s→無菌水沖洗3遍→0.1%升汞浸泡9 min→無菌水沖洗5遍。然后將外植體生長下部剪去1cm左右，分別接種于核桃初代培養(yǎng)基MS+TDZ 0.01 mg/L+IBA 0.01 mg/L+PVP 2 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L上。每隔5～7 d，觀察其長勢(shì)，分析不同的外植體消毒方法對(duì)核桃初代培養(yǎng)成活率的影響。

外植體的消毒滅菌需要注意，一是要盡可能地將外植體表面的微生物全部殺死，二是要盡量減少消毒劑對(duì)其組織和表層細(xì)胞的傷害。

1.2.2 不同采取時(shí)期的外植體對(duì)核桃初代培養(yǎng)的影響每隔7～10 d采取一次核桃新芽，將采回的芽體剪成3～4 cm的莖尖和莖段，流水沖洗后，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒，流程為：75%酒精浸泡30～35 s→無菌水沖洗3遍→0.1%升汞浸泡9 min→無菌水沖洗5遍。從外植體生長下部剪去1 cm左右，接種于4種含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上（表1）。每隔5～7 d，觀察其長勢(shì)，分析不同采取時(shí)期的外植體對(duì)核桃初代培養(yǎng)的影響。

表1 4種核桃初代培養(yǎng)基

1.2.3 不同部位外植體在核桃初代培養(yǎng)中的區(qū)別采集并篩選長勢(shì)一致的核桃新芽，剪成3～4 cm的莖尖和莖段，以其莖尖和莖段兩種不同類型的外植體各80個(gè)為試驗(yàn)材料，流水沖洗后在超凈工作臺(tái)上消毒滅菌，具體流程：75%酒精浸泡30～35 s→無菌水沖洗3遍→0.1%升汞浸泡9 min→無菌水沖洗5遍。從外植體生長下部剪去1cm左右，接種于4種不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上（表1）。每隔5～7 d，觀察其長勢(shì)，并分析不同部位的外植體在核桃初代培養(yǎng)中的區(qū)別。

1.2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)核桃初代培養(yǎng)的影響采集并篩選長勢(shì)一致的核桃新芽，剪取3～4 cm的莖段，流水沖洗后在超凈工作臺(tái)上消毒滅菌，具體流程：75%酒精浸泡30～35 s→無菌水沖洗3遍→0.1%升汞浸泡9 min→無菌水沖洗5遍。從外植體生長下部剪去1cm左右，接種到4種MS添加了不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合核桃初代的培養(yǎng)基上，放到培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上進(jìn)行培養(yǎng)。具體培養(yǎng)基配方，見表1。20～30 d后觀察其長勢(shì)，記錄株高。

1.2.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)核桃組培苗增殖的影響將核桃初代培養(yǎng)獲得的組培苗在超凈工作臺(tái)上剪切成合適大小的形態(tài)，約2～3 cm，并去除其下部多余葉片以及衰老、枯萎的葉片，只留頂部的3～4片葉片。然后將其接種到4種MS添加了不同濃度植物植物生長調(diào)節(jié)劑組合的核桃增殖培養(yǎng)基上，放到培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上進(jìn)行培養(yǎng)。具體培養(yǎng)基配方，見表2。20～30 d后觀察其長勢(shì)，記錄株高并計(jì)算增殖系數(shù)。公式：

表2 4種不同的核桃增殖培養(yǎng)基

增殖系數(shù)=瓶苗在一個(gè)周期內(nèi)形成的有效苗數(shù)/接種苗數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方法對(duì)外植體成活率的影響

本試驗(yàn)采取的兩種外植體消毒方法中，使用方法二消毒后外植體的成活率較高，為70%。使用方法一消毒，由于酒精浸泡時(shí)間過長，傷害了外植體，表現(xiàn)褐變嚴(yán)重，成活率較低，為32.5%。

2.2 不同采取時(shí)期的外植體對(duì)核桃初代培養(yǎng)的影響

在本試驗(yàn)中，4月上旬到6月下旬，每隔7～10 d采取一次核桃新生莖尖及莖段外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)，結(jié)果表明：應(yīng)在5月上中旬外植體半木質(zhì)化時(shí)采取。因4月份核桃剛剛萌芽，采集的外植體過于幼嫩，消毒劑對(duì)其毒害過于嚴(yán)重，所以不易成活。而5月下旬至6月，外植體已完全木質(zhì)化，難以剪切，而且其褐變程度和污染狀況都較重。

2.3 不同部位的外植體在核桃初代培養(yǎng)中的區(qū)別

本試驗(yàn)中的核桃莖尖和莖段兩種外植體，圖1是不同部位的核桃外植體在初代培養(yǎng)中的生長狀況。

圖1 不同部位的外植體在核桃初代培養(yǎng)中的生長狀況

由圖1可看出：在初代培養(yǎng)中，莖尖和莖段外植體培養(yǎng)所獲得的組培苗都生長良好，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)，莖尖成活率為55%，莖段成活率為85%。與莖尖相比，莖段的成活率高，污染和褐化程度較輕，因此，用莖段進(jìn)行核桃的初代培養(yǎng)的效果更好。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)核桃初代培養(yǎng)的影響

核桃外植體在4種培養(yǎng)基上都能生長。具體生長結(jié)果，見表3。

表3 核桃外植體在4種不同初代培養(yǎng)基上的生長狀況

由表3可知，在核桃的初代培養(yǎng)中，莖段外植體在4號(hào)初代培養(yǎng)基上的高度較高，葉片綠且密，生長狀態(tài)最佳。圖2為核桃莖段在4號(hào)培養(yǎng)基上的生長狀況?？梢缘贸鼋Y(jié)論，4號(hào)培養(yǎng)基：MS+TDZ 0.01 mg/L+IBA 0.01 mg/L+PVP 2 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L為核桃初代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

圖2 核桃莖段在4號(hào)培養(yǎng)基上的生長狀況

2.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)核桃組培苗增殖的影響

核桃組培苗在4種增殖培養(yǎng)基上的生長效果，見表4。

表4 核桃組培苗在四種不同的增殖培養(yǎng)基上的生長狀況

由表4可知，核桃組培苗在1號(hào)增殖培養(yǎng)基上的株高較高，葉片綠且密，繁殖系數(shù)較高，生長狀態(tài)最佳。因此，核桃組培苗的最佳增殖培養(yǎng)基為1號(hào)：MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L。

3 結(jié)論與討論

外植體材料的消毒滅菌是植物組織培養(yǎng)的第一步，也是其初代培養(yǎng)中最關(guān)鍵的一步。本試驗(yàn)采取升汞浸泡的方法對(duì)外植體進(jìn)行消毒，但由于升汞有劇毒，國外多已不用，而用其他滅菌劑取代，如NaClO等[8]。

宮永紅[8]研究提到了應(yīng)注意縮短轉(zhuǎn)瓶周期。開始時(shí)每天轉(zhuǎn)移1次，3～4 d后當(dāng)芽體基部不再變褐時(shí)，每隔2周轉(zhuǎn)移1次。因此可以適當(dāng)增大外植體的長度，但不要超過5 cm。因?yàn)橥庵搀w內(nèi)可能含有內(nèi)生菌，外植體的體積越大，其含有的內(nèi)生菌數(shù)量越大。關(guān)于外植體的最佳取材大小，還需要一定的研究。

本試驗(yàn)得出的核桃初代最佳培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.01 mg/L+IBA 0.01 mg/L+PVP 2 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L。核桃組培苗增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L。其他研究中提到了DKW培養(yǎng)基，而本試驗(yàn)中采用的MS培養(yǎng)基也能達(dá)到培養(yǎng)目的。

在本試驗(yàn)組培苗的生根培養(yǎng)中，組培苗基部出現(xiàn)了易腫大且愈傷化的現(xiàn)象，可能是培養(yǎng)基IBA濃度過高所致，因此導(dǎo)致了生根試驗(yàn)失敗。另外，在核桃的組織培養(yǎng)過程中，對(duì)于不同品種核桃的最佳培養(yǎng)基配方，也需要進(jìn)一步研究。

通過組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行難繁樹種核桃的離體繁殖，能實(shí)現(xiàn)核桃良種的快速繁殖，對(duì)于其工廠化育苗具有重要意義。