姚佳明，何悅，郝歡歡，黃心如，張敬，徐彬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

光是植物生長發(fā)育最重要的調(diào)控因子之一。植物長期處于黑暗條件下，會(huì)呈現(xiàn)莖細(xì)長柔弱、子葉不展開、葉片細(xì)小、葉片黃化等特征；而在正常光下，植物則呈現(xiàn)出莖粗壯、子葉展開和葉片發(fā)達(dá)等表型，這種受光強(qiáng)、光質(zhì)或光周期調(diào)節(jié)的生長發(fā)育過程稱為植物的光形態(tài)建成［1-2］。光敏色素是一種可溶性色素蛋白，以吸收紅光的非活性形式（red-absorbing phytochrome，Pr）和吸收遠(yuǎn)紅光的活性形式（far red-absorbing phytochrome，Pfr）存在，具有生理活性的Pfr能夠快速地從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，通過結(jié)合光敏色素互作因子（phytochrome-interacting factors，PIFs），進(jìn)而調(diào)控光響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平［3-4］。PIFs屬于bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，是光信號(hào)通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［5］，通過直接調(diào)控其下游基因的轉(zhuǎn)錄來抑制種子萌發(fā)、促進(jìn)幼苗光形態(tài)建成和提高植物耐蔭性等［6］。PIFs中的bHLH功能域由約15個(gè)氨基酸組成的堿性區(qū)（basic region）和約60個(gè)氨基酸組成的螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix）區(qū)組成，其中的堿性區(qū)能夠與順式作用元件G-box（CACGTG）特異性地結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)［7-15］。

近年來，越來越多的研究證實(shí)PIF家族成員不僅是光信號(hào)調(diào)節(jié)途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，還常作為細(xì)胞信號(hào)樞紐，能夠整合多種信號(hào)，成為其他信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分。例如，PIF在光信號(hào)和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)之間起到重要的橋梁作用［16］。PIF家族成員之間的功能也存在差異［17］，例如，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有8個(gè)PIFs成員［18］，包括PIF1（PIL5，At2G20180），PIF3（At1G09530），PIF4（At2G43010），PIF5（PIL6，At3G59060），PIF6（PIL2，At3G62090），PIF7（At5G61270），PIF8（At4G00050）和PIL1（At2G46970）。PIF1在黑暗條件下負(fù)調(diào)控葉綠素的合成和種子萌發(fā)，而光誘導(dǎo)PIF1的降解減緩了這一負(fù)調(diào)控作用，進(jìn)而促進(jìn)擬南芥光形態(tài)建成［12］；將擬南芥pif4缺失突變體幼苗和野生型擬南芥幼苗從22℃轉(zhuǎn)移到28℃時(shí)發(fā)現(xiàn)，pif4突變體幼苗明顯缺乏下胚軸和上胚軸伸長以及葉片下垂的能力。此外，這種溫度變化還會(huì)引起PIF4轉(zhuǎn)錄水平快速升高［19-20］；在光照條件下，PIF3能通過誘導(dǎo)光敏色素B的降解來降低植物對(duì)光的響應(yīng)從而調(diào)節(jié)擬南芥下胚軸的伸長［21］。小麥（Triticum aestivum）TaPIF3突變體和過表達(dá)株系的表型分析也表明，TaPIF3在莖的伸長和穗的生長調(diào)控中都發(fā)揮了作用［22］。PIFs不僅調(diào)控植物的光形態(tài)建成，還參與植物對(duì)逆境的響應(yīng)。如Yong等［23］研究結(jié)果表明過量表達(dá)ZmPIF3在不影響玉米（Zea mays）產(chǎn)量的同時(shí)，能夠提高玉米的耐旱性。過量表達(dá)水稻（Oryza sativa）OsPIL1基因不僅提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性，還促進(jìn)了細(xì)胞伸長生長［24］。Zhang等［25］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥光敏色素互作因子AtPIF5具有正調(diào)控黑暗誘導(dǎo)葉片衰老和葉綠素降解的功能。另外，擬南芥AtPIF5也能夠調(diào)控乙烯合成和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)［26］。基于以上研究結(jié)果，光敏色素互作因子（PIFs）在植物光形態(tài)建成、耐逆調(diào)控和激素信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，因此，克隆多年生黑麥草（Lolium perenne）PIFs基因，并分析其轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，可為黑麥草的耐逆（耐蔭、旱和鹽等）生物技術(shù)育種提供重要的候選基因。

多年生黑麥草為禾本科早熟禾亞科黑麥草屬植物，是重要的冷季型牧草和草坪草。常作為草坪建植的先鋒草種，廣泛應(yīng)用于我國的南北過渡帶及以北溫帶地區(qū)。目前，對(duì)于多年生黑麥草PIF基因家族成員的克隆、表達(dá)模式分析及功能的研究尚未見報(bào)道。本研究從多年生黑麥草中克隆得到一個(gè)光敏色素因子（PIFs）編碼基因，命名為LpPIL5，并分析了其基因組結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)子順式作用元件，亞細(xì)胞定位和不同組織下的表達(dá)特性以及在不同非生物脅迫下的表達(dá)規(guī)律。研究結(jié)果可為多年生黑麥草LpPIFs轉(zhuǎn)錄因子的功能分析奠定基礎(chǔ)，也可為黑麥草耐逆育種提供基因資源。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年6月-2021年6月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草類生理生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑

以多年生黑麥草（品種為Buena Vista，購買于美國Syngenta公司）為試驗(yàn)材料，在人工氣候室中培養(yǎng)，基質(zhì)為蛭石、珍珠巖和泥炭土（體積比為1∶3∶9）。氣候室生長條件設(shè)定為：25/20℃（白天/晚上），光照14 h，濕度為70%，光合有效輻射為750 μmol·m-2·s-1。

RNA提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購于OMEGA BIO-TEK公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（MonScriptTMRTⅢSuper Mix with dsDNase）及熒光定量試劑盒（MonAmpTMChemoHS qPCR Mix）購于Monad公司；DNA聚合酶（Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase）購于諾維贊生物科技股份有限公司。

1.2 LpPIL5全 長cDNA擴(kuò) 增 及 測(cè) 序

以擬南芥AtPIF5基因的bHLH功能域序列為誘餌，在多年生黑麥草基因組數(shù)據(jù)庫（SRA號(hào)：PRJNA335527）進(jìn)行檢索（basic local alignment search tool，BLAST），篩選出LpPIL5基因，利用BioXM預(yù)測(cè)LpPIL5基因編碼區(qū)序列，用Primer Premier 5設(shè)計(jì)基因全長引物（表1），以多年生黑麥草葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為30 μL，包括：2×Phanta Max buffer 15 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1）0.6 μL，LpPIL5-cDNAF（10 μmol·L-1）1.2 μL，LpPIL5-cDNAR（10 μmol·L-1）1.2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.6 μL，cDNA模版1 μL，ddH2O 10.4 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物切膠純化，經(jīng)BamHI和HindⅢ雙酶切后連接至入門載體pEND-Linker，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單克隆并測(cè)序。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 LpPIL5基因序列分析

從TAIR和NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥、水稻、玉米等物種的PIF基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列，利用MEGA 6.0軟件中的ClustalW程序?qū)pPIL5與擬南芥、水稻和玉米等物種的PIF同源蛋白進(jìn)行比對(duì)，利用Neighborjoining程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用Protparam分析LpPIL5蛋白的分子式，利用NetPhos預(yù)測(cè)該蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)，用SOMPA和SWISS-MODEL分別模擬LpPIL5的二維和三維結(jié)構(gòu)，用Plant Care網(wǎng)站預(yù)測(cè)LpPIL5啟動(dòng)子上游1500 bp內(nèi)所包含的順式作用元件。

1.4 晝夜節(jié)律表達(dá)模式分析

晝夜節(jié)律設(shè)定為白天和黑暗各12 h，間隔4 h取樣，試驗(yàn)周期為48 h（圖1）。固定時(shí)間點(diǎn)取樣，提取mRNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，Thermo，美國）檢測(cè)mRNA質(zhì)量，將無明顯降解的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用羅氏熒光定量系統(tǒng)（Roche Light Cycler?480Ⅱ）并結(jié)合2-ΔΔCT［27］計(jì)算方法檢測(cè)LpPIL5基因的相對(duì)表達(dá)量，LpeLF4A［28］為內(nèi)參基因（GenBank登錄號(hào)為：G0924770）。

圖1 取樣時(shí)間Fig.1 Sampling time

1.5 基因表達(dá)模式及不同組織間的表達(dá)量分析

選取長勢(shì)一致的種子苗（萌發(fā)后3周）進(jìn)行水培處理，培養(yǎng)液為Hoagland營養(yǎng)液，1周后進(jìn)行15%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000、100 mmol·L-1NaCl、100 μmol·L-1CdCl2、50 μmol·L-1脫 落 酸（abscisic acid，ABA）、25 μmol·L-16-芐氨基嘌呤［N-（phenylmethyl）-9H-purin-6-amine，6-BA］和高溫（38℃）處理，于0、0.5、2、6、12和24 h后剪取葉片和根，-80℃條件下凍存。相同時(shí)間點(diǎn)剪取未進(jìn)行逆境和激素處理的葉片和根，作為平行對(duì)照。另外，選取多年生黑麥草的伸展葉、成熟葉、老葉、根、莖和根冠部位，用于分析目標(biāo)基因在不同組織、器官中的表達(dá)模式。

1.6 亞細(xì)胞定位表達(dá)載體構(gòu)建

將LpPIL5經(jīng)BamHI和HindⅢ雙酶切連接入門載體pEND-linker，然后用PvuⅠ將構(gòu)建好的pEND-LpPIL5線性化，純化后將其與表達(dá)載體（p2GWF7.0）進(jìn)行LR重組反應(yīng)，構(gòu)建p2GWF7.0-LpPIL5亞細(xì)胞定位載體。

1.7 多年生黑麥草原生質(zhì)體提取

參照Yu等［29］的方法提取多年生黑麥草原生質(zhì)體，其中酶解液、W5溶液和MMg溶液配方見表2。

表2 提取并轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體所用溶液Table 2 The solution used to extract and transform protoplasts

1.8 亞細(xì)胞定位分析

取原生質(zhì)體溶液200 μL（約40000個(gè)原生質(zhì)體），質(zhì)粒p2GWF7.0-LpPIL5（1000 ng·μL-1）20 μL，PEG 4000溶液（見表2）220 μL加入2 mL無菌離心管中混勻。室溫孵育5 min，加入800 μL的W5溶液，混勻后200 r·min-1離心2 min，去除上清液并加入400 μL的W5溶液重懸原生質(zhì)體。室溫下暗孵育12 h后，采用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM780 Exciter，德國）觀察目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0對(duì)基因定量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析（P＜0.05），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示。利用SigmaPlot 12.5、MEGA 6.0和Excel 2013軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多年生黑麥草LpPIL5全長cDNA克隆與生物信息學(xué)分析

經(jīng)PCR反應(yīng)，從多年生黑麥草中擴(kuò)增出LpPIL5基因序列（圖2，GenBank登錄號(hào)為MZ188927），其具有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)長1410 bp（圖3a）。NCBI數(shù)據(jù)庫檢索得到LpPIL5的直系同源蛋白，分別為大麥（Hordeum vulgare）HvPIL1、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）BdPIF1、小米（Setaria italica）SiPIL1、柳枝稷（Panicum virgatum）PvPIL13、高粱（Sorghum bicolor）SbPIF1、玉米ZmPIL5和水稻OsPIL13，這些蛋白都具有保守的bHLH結(jié)構(gòu)域（圖3b）。進(jìn)化結(jié)果表明，LpPIL5與單子葉植物的同源蛋白聚為一類，且與大麥HvPIL1的親緣關(guān)系最近（圖4）。

圖2 部分樣品的mRNA（a）及LpPIL5基因（b）全長克隆的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of some samples’mRNA（a）and full length of LpPIL5 gene（b）

圖3 LpPIL5的基因結(jié)構(gòu)（a）和氨基酸序列（b）分析Fig.3 Gene structure（a）and amino acid sequence（b）analysis of LpPIL5

圖4 LpPIL5及其同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of LpPIL5 and its homologous proteins

2.2 LpPIL5具有典型的bHLH三級(jí)結(jié)構(gòu)

LpPIL5編碼蛋白質(zhì)的分子式為C2150H3368N652O686S28，原子總數(shù)為6884，相對(duì)分子質(zhì)量為50.22 kDa，等電點(diǎn)為6.68；正電荷殘基（精氨酸+賴氨酸）為43個(gè)，負(fù)電荷殘基（天冬氨酸+谷氨酸）為46個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)為61.84，屬不穩(wěn)定蛋白；平均親水性系數(shù)為-0.657。且其結(jié)構(gòu)中含有49個(gè)磷酸化位點(diǎn)（閾值＞0.5），其中28個(gè)絲氨酸、19個(gè)蘇氨酸及2個(gè)酪氨酸。

LpPIL5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖5a所示。其中α-螺旋由137個(gè)氨基酸殘基組成，占29.15%；延伸鏈由38個(gè)氨基酸殘基組成，占8.09%；β-轉(zhuǎn)角由14個(gè)氨基酸殘基組成，占2.98%；無規(guī)則卷曲由281個(gè)氨基酸殘基組成，占59.79%。LpPIL5蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)如圖5b所示，該蛋白具有典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)，且位于該蛋白兩端的α-螺旋可以形成拉鏈結(jié)構(gòu)，嵌入到DNA雙鏈的大溝里，而在這兩個(gè)α-螺旋末端均富含堿性氨基酸，以識(shí)別DNA序列。

圖5 LpPIL5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間三維結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure and three-dimensional structure of LpPIL5

2.3 LpPIL5定位于細(xì)胞核

將p2GW7.0-LpPIL5-GFP融合表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化多年生黑麥草原生質(zhì)體，用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）信號(hào)的定位。結(jié)果表明GFP信號(hào)與4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）信號(hào)重疊（圖6），說明LpPIL5定位于細(xì)胞核。

圖6 LpPIL5蛋白在多年生黑麥草原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Fig.6 The subcellular localization of LpPIL5 protein in protoplasts of perennial ryegrass

2.4 LpPIL5啟動(dòng)子具有激素、逆境和光響應(yīng)順式作用元件

LpPIL5啟動(dòng)子區(qū)含有響應(yīng)逆境、植物激素和光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如與脫落酸有關(guān)的順式調(diào)控元件ABRE、干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域的共同順式作用元件CAAT-box、調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的基本元件TATA-box等。另外，啟動(dòng)子區(qū)域也含有如G-box、I-box、BoxⅡ、TCCC-motif等多個(gè)光響應(yīng)元件（表3），說明LpPIL5可能參與植物的激素信號(hào)傳導(dǎo)、耐逆響應(yīng)和晝夜節(jié)律調(diào)控。

表3 LpPIL5啟動(dòng)子順式作用元件分析Table 3 The analysis of cis-acting regulatory elements in the LpPIL5 promoter

2.5 LpPIL5的表達(dá)具有組織特異性，且受晝夜節(jié)律調(diào)控

LpPIL5在多年生黑麥草伸展葉、成熟葉、老葉、根、莖、葉鞘和根冠中均表達(dá)（圖7a）。葉片中LpPIL5的表達(dá)量顯著高于根、莖、葉鞘和根冠，其中，在成熟葉中的表達(dá)量最高。另外，LpPIL5的表達(dá)受光周期調(diào)控，如在光下的相對(duì)表達(dá)量要明顯高于黑暗。在光照開始0～4 h，其表達(dá)量上升最為明顯，隨后會(huì)有不同程度的下降。而在黑暗條件下，該基因的表達(dá)量顯著低于光照條件，且處于較低水平（圖7b）。

圖7 LpPIL5在不同組織（a）和光照條件（b）下的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of LpPIL5 gene in different tissues（a）and light or dark conditions（b）

2.6 干旱、鹽、鎘和高溫逆境調(diào)控LpPIL5的表達(dá)

PEG、NaCl、CdCl2和高溫脅迫處理?xiàng)l件下葉片中LpPIL5基因的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照，說明4種非生物脅迫的逆境處理均抑制了葉片中LpPIL5基因的表達(dá)（圖8）。在根中PEG、NaCl、CdCl2和高溫脅迫處理6 h內(nèi)，LpPIL5基因的相對(duì)表達(dá)量也低于對(duì)照，然而在處理24 h后，LpPIL5基因在根中的表達(dá)量均高于對(duì)照。

圖8 4種非生物脅迫處理下多年生黑麥草葉片和根中LpPIL5的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 The relative expression of LpPIL5 in leaves and roots in response to four different abiotic stresses

2.7 細(xì)胞分裂素和脫落酸調(diào)控LpPIL5的表達(dá)

兩種激素處理?xiàng)l件下，LpPIL5在根和葉片中的表達(dá)模式也具有差異（圖9）。LpPIL5在葉片中的表達(dá)均受ABA和6-BA的抑制，但抑制程度不同。如：6-BA處理0.5～2 h時(shí)，LpPIL5表達(dá)量呈上升的趨勢(shì)，但ABA處理0.5～2 h，LpPIL5表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)。在根中，LpPIL5在6-BA和ABA處理下的表達(dá)模式是相似的，均表現(xiàn)為前12 h內(nèi)，該基因的表達(dá)受到抑制，但在24 h時(shí)，該基因的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照。

圖9 ABA和6-BA處理下多年生黑麥草葉片和根中LpPIL5的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 The relative expression of LpPIL5 in leaves and roots in response to ABA and 6-BA

3 討論

光在植物生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，不僅參與植物的光合作用，還作為信號(hào)調(diào)節(jié)多種生理反應(yīng)，如光形態(tài)建成等。光敏色素主要在細(xì)胞質(zhì)中合成，在紅光照射下會(huì)快速移動(dòng)到細(xì)胞核中，然后與PIFs蛋白發(fā)生相互作用，促進(jìn)它們的快速降解來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程［30］。光敏色素互作因子作為bHLH轉(zhuǎn)錄因子的亞家族，是參與光信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［6］。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，目前，越來越多的PIF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中被發(fā)現(xiàn)并研究。如PIF轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在水稻［31］、番茄（Solanum lycopersicum）［32］、擬南芥［18，33］、小立碗蘚（Physcomitrella patens）［34］和玉米［35-36］等多種植物中被發(fā)現(xiàn)并分離。但是，多年生黑麥草的PIF轉(zhuǎn)錄因子家族成員尚未被克隆。

本研究從多年生黑麥草中克隆得到一個(gè)PIF基因LpPIL5，其編碼蛋白具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix）蛋白保守的bHLH結(jié)構(gòu)域和APB功能域。前人研究結(jié)果表明，光敏色素A和B可以與PIFs的APA和APB功能域互作，促進(jìn)PIF降解進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能［37-38］。然而，本研究發(fā)現(xiàn)LpPIL5不含有APA功能域，說明其可能不與光敏色素A直接互作。對(duì)LpPIL5蛋白進(jìn)行空間三維立體結(jié)構(gòu)模擬，發(fā)現(xiàn)其具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域特征，位于該蛋白兩端的α-螺旋形成拉鏈結(jié)構(gòu)，能夠嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的大溝，而在這兩個(gè)α-螺旋末端均富含堿性氨基酸，以識(shí)別DNA序列。前人研究發(fā)現(xiàn)，PIFs可以通過其bHLH結(jié)構(gòu)域的基本區(qū)域與下游基因的順式作用元件結(jié)合［39］?；谝陨辖Y(jié)果，并結(jié)合LpPIL5定位于細(xì)胞核，推測(cè)LpPIL5是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子，通過bHLH功能域與其下游基因啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)下游基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。

分析LpPIL5基因的表達(dá)模式有助于揭示其調(diào)控多年生黑麥草耐逆反應(yīng)、激素響應(yīng)和光形態(tài)建成的機(jī)制。Wang等［40］的研究表明兩對(duì)AhPIF3基因（AhPIF3A1/B1，AhPIF3A4/B4）在黑暗下的轉(zhuǎn)錄水平要高于在光下的轉(zhuǎn)錄水平。與上述結(jié)果相似的是葡萄（Vitis vinifera）VvPIFs在光下的轉(zhuǎn)錄水平也會(huì)被抑制，并且暗處理可誘導(dǎo)其表達(dá)［41］。除此之外，AtPIF3在黑暗條件下的擬南芥幼苗中表達(dá)量高，但在紅光和遠(yuǎn)紅光條件下都會(huì)被降解［42］。本研究結(jié)果表明LpPIL5的表達(dá)受光調(diào)控，表現(xiàn)為白天的表達(dá)量顯著高于夜晚，并且在其啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了許多與光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如G-box、I-box、BoxⅡ、TCCC-motif等。因此，推測(cè)LpPIL5基因功能發(fā)揮與光信號(hào)密切相關(guān)，是植物光信號(hào)通路的核心調(diào)控因子，且LpPIL5啟動(dòng)子為光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，光照能夠驅(qū)動(dòng)或誘導(dǎo)LpPIL5基因的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)植物的光形態(tài)建成［43］。因此，LpPIL5是調(diào)控多年生黑麥草光形態(tài)建成及耐蔭響應(yīng)的重要候選基因。前人研究顯示，AdPIF3A4/AiPIF3B4基因在雌蕊發(fā)育早期的表達(dá)量高于其他組織［44］，本研究發(fā)現(xiàn)LpPIL5基因在植物葉片中的表達(dá)量顯著高于其他部分，并且在葉片不同時(shí)期內(nèi)的表達(dá)量也有所不同，其中在成熟葉片中表達(dá)量最高，說明該基因在多年生黑麥草發(fā)育過程中可能具有不同的生物學(xué)功能。

不同非生物脅迫和兩種外源激素處理的定量數(shù)據(jù)結(jié)果表明，LpPIL5基因在葉片中受NaCl、CdCl2、高溫、干旱、ABA和6-BA處理后均表現(xiàn)為先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)。而在聚乙二醇（PEG）處理后的0.5 h內(nèi)其基因表達(dá)量出現(xiàn)了先下降，隨后上升再下降的趨勢(shì)。但與對(duì)照組相比，不管在哪種非生物脅迫處理下，其葉片中該基因的相對(duì)表達(dá)量都下降，但下降的程度不相同，表明該基因在多年生黑麥草葉片中對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)具有重要作用，且不同逆境下其響應(yīng)程度不同。在根中，不同處理下也出現(xiàn)了相似的表達(dá)模式，但與葉片中不同的是，在處理24 h后，該基因的相對(duì)表達(dá)量均超過了對(duì)照組。尤其是在NaCl處理下，該基因在6 h后表達(dá)量快速上升，說明LpPIL5在根部受NaCl的影響要高于其他處理組。根和葉的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)分析也表明，LpPIL5基因在根和葉中均有不同的表達(dá)模式。LpPIL5基因表達(dá)對(duì)上述逆境及植物激素處理的響應(yīng)可能與其啟動(dòng)子中含有的ABRE，MBS，CGTCA-motif和TGACG-motif等順式作用元件相關(guān)，但與其啟動(dòng)子互作的逆境和激素響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子仍需進(jìn)一步挖掘。綜上所述，LpPIL5不僅具有參與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，而且在響應(yīng)鹽、鎘、高溫、干旱等非生物脅迫方面也發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本研究克隆了多年生黑麥草LpPIL5基因，發(fā)現(xiàn)LpPIL5與大麥HvPIL1遺傳距離較近，且具有bHLH蛋白保守的結(jié)構(gòu)域和APB功能域；LpPIL5定位于細(xì)胞核；與其他組織相比，LpPIL5在多年生黑麥草葉片中表達(dá)量較高；并且其在葉片和根中表達(dá)量均受NaCl、CdCl2、PEG、高溫、ABA和6-BA等調(diào)控。另外，LpPIL5基因的表達(dá)受晝夜節(jié)律調(diào)控，如LpPIL5在白天的表達(dá)量顯著高于夜晚。本研究初步明確了LpPIL5不僅在光信號(hào)通路中起著至關(guān)重要的作用，而且還參與多年生黑麥草耐逆調(diào)控，研究結(jié)果為后續(xù)揭示LpPIL5基因調(diào)控多年生黑麥草光形態(tài)建成和耐逆（如耐蔭）機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。