王洪亞，鄭 文，戴永剛，周瑋琰，孫進學

作者單位：1(250031)中國山東省濟南市，山東省立第三醫(yī)院檢驗科；2(250021)中國山東省濟南市，山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院眼科

0引言

葡萄膜炎是一種臨床上可以導致嚴重視力下降的疾病，是全球排名第五位的致盲眼病。該病發(fā)病年齡多較為年輕，對個人家庭以及國家影響較大。因此，葡萄膜炎的診斷、治療及發(fā)病機制越來越受到重視。其類型眾多，確切發(fā)病機制至今尚不完全清楚，目前普遍認為自身免疫紊亂所致的葡萄膜炎是其中最為常見和重要的類型[1]。所以目前大量的研究力求從免疫學的角度探討其詳細的發(fā)病機制。近年來人白細胞抗原-B27(human leucocyte antigen-B27,HLA-B27)被認為與葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系[2]，HLA-B27陽性的葡萄膜炎患者被認為比陰性患者發(fā)病更早且更易復發(fā)，但是目前這兩類患者的具體發(fā)病機制區(qū)別尚未明確，因此我們的研究對這兩類葡萄膜炎患者的外周血中的炎癥因子進行相關研究，旨在探討其可能的發(fā)病機制，為尋求新的診斷及治療方法提供依據(jù)。

1對象和方法

1.1對象回顧性研究。選取2020-01/2022-04山東省立第三醫(yī)院初診的葡萄膜炎患者76例。所有納入研究的病例均具有不同程度的眼紅、眼痛、畏光、流淚、視物模糊等臨床表現(xiàn)，裂隙燈檢查可見不同程度的瞳孔縮小或后黏連、前房閃輝、角膜后見呈塵狀或羊脂狀的沉著物(keratic precipitates，KP)、睫狀體充血、晶狀體表面色素沉著。納入標準：初發(fā)病例，經(jīng)專業(yè)眼科醫(yī)生確診為葡萄膜炎。排除標準：(1)近1mo內(nèi)服用免疫抑制劑、免疫調節(jié)劑、糖皮質激素、抗生素等者；(2)合并眼部外傷史或其他眼部疾病反復發(fā)作史者；(3)合并感染性疾病者。本研究采用廢棄的檢測后標本，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，符合倫理要求。研究期間所有研究對象的個人信息均保密，征得患者及家屬知情同意。

1.2方法采集所有患者空腹靜脈血置于EDTA-K2抗凝試管中，所有標本均于當天應用流式細胞術完成HLA-B27的檢測。將剩余標本提取全血RNA，用RT-qPCR方法檢測炎性指標：白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、蛋白酶激活受體2(PAR2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素增強因子3(ILF3)。

1.2.1儀器與試劑HLA-B27檢測使用的流式細胞儀為美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)8色(CytoFLE)。HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE檢測試劑盒和溶血素為美國貝克曼庫爾特生產(chǎn)的配套試劑。采用Trizol試劑提取全血總RNA，炎癥因子mRNA檢測引物合成于上海生工，具體序列如表1所示，RT-qPCR使用的是羅氏LightCycler 480Ⅱ實時熒光定量PCR儀器及其配套試劑。

1.2.2流式細胞術檢測HLA-B27 向檢測管中依次加入10μL檢測抗體和50μL的EDTA-K2抗凝外周血，振蕩混勻后置于室溫避光處孵育15min，然后每管加入0.5mL溶血素，混勻后避光孵育10min，加入0.5mL 0.9%生理鹽水，振蕩混勻后2000r/min離心5min，棄掉上清液，加2mL 0.9%生理鹽水，振蕩混勻后2000r/min離心5min，棄掉上清液，每管加0.5mL 0.9%生理鹽水，振蕩混勻后流式細胞儀上機檢測分析。CytoFLEX流式細胞儀通過FSC和SSC雙參數(shù)圖圈定淋巴細胞亞群設門，然后分析淋巴細胞中HLA-B7-和HLA-B27+細胞群的百分比，比例≥90%判讀為陽性，比例≤5%判讀為陰性。

1.2.3全血RNA的提取混勻全血后，吸取200μL全血和1mL Trizol試劑充分混合，反復用槍吹打和劇烈震蕩以裂解細胞，在15℃～30℃下放置20min；在上述體系中加入200μL氯仿，用力震蕩15s，充分混勻，在15℃～30℃放置5min，4℃、12000g離心15min；將上層水相置于新EP管中，加入等量遇冷的異丙醇，在-20℃放置2h以上，4℃、12000g離心30min充分沉淀RNA；棄上清，每管加入1mL預冷的DEPC水配制的75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，4℃、12000g離心15min，棄上清，讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀，并用A260/A280檢測RNA純度。純度在1.800～2.000之間，濃度在200～500ng/μL。

2結果

2.1兩組患者一般資料比較本研究共納入葡萄膜炎患者76例，采集靜脈血分離有核細胞，用流式細胞術(直接免疫熒光法)檢測HLA-B27(圖1)，分成HLA-B27陽性組(≥90%)35例(男19例，女16例)，平均年齡44.26±14.31歲，HLA-B27陰性組(≤5%)41例(男15例，女26例)，平均年齡42.46±13.71歲。兩組患者一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=2.39，P=0.12；t=0.56，P=0.58)。

圖1 流式細胞術檢測HLA-B27 A：陽性；B：陰性。

表1 本實驗所用引物一覽表

2.2兩組患者外周血中炎癥因子mRNA表達量的比較采用RT-qPCR檢測GAPDH和各炎癥因子的mRNA，得到△Ct，公式為△Ct=各炎癥因子Ct-GAPDH Ct，故△Ct越小，基因表達量越高。HLA-B27陽性組比HLA-B27陰性組中IL-6 mRNA的表達高，HLA-B27陽性組比HLA-B27陰性組中ILF3 mRNA的表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IL-1β、IL-10、PAR2、TNF-α mRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組患者外周血中炎癥因子mRNA表達量(ΔCt)的比較

3討論

葡萄膜炎是一種作用于虹膜、睫狀體、玻璃體以及視網(wǎng)膜等多個眼內(nèi)組織器官的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，是目前最為復雜和疑難的眼科疾病之一，其治療多較為困難，若治療不及時可能會導致患者視力的永久喪失[3]。人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是目前發(fā)現(xiàn)的具有多態(tài)性的一類抗原系統(tǒng)，包括A、B、C、D、DR、DP和DQ7個位點[4]。自1973年首次報道葡萄膜炎與HLA-B27有關系以來，人們對HLA-B27抗原與葡萄膜炎研究越來較多，目前發(fā)現(xiàn)多類葡萄膜炎和HLA有著密切關系[5-6]。其中非感染性葡萄膜炎可以分為HLA-B27抗原陽性和陰性兩大類。HLA-B27抗原陽性葡萄膜炎因病程進展快、易復發(fā)、并發(fā)癥多且多伴有脊柱關節(jié)病變等原因[7]，得到了眼科醫(yī)生的極大重視。關于其流行病學和臨床特征已有不少的報道，但是其具體發(fā)病機制原因及相關危險因素研究不是很多，其確切的發(fā)病機制至今尚未完全清楚。目前已知炎癥因子與葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展密切相關，本研究主要分析了白細胞介素(interleukin，IL)、蛋白酶激活受體2(protease activated receptor 2，PAR2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素增強因子-3(interleukin enhancer-binding factor -3，ILF3)在HLA-B27抗原陽性和陰性兩組葡萄膜炎患者中的表達情況，我們通過流式細胞儀將來我院就診的葡萄膜炎患者分為HLA-B27抗原陽性和陰性兩組進行相關分析，兩組患者年齡及性別無統(tǒng)計學差異，我們通過檢測外周血中的上述炎癥因子來試圖找到兩組患者的發(fā)病機制區(qū)別。通過研究我們得出：(1)IL-6上調。HLA-B27陽性組IL-6的mRNA ΔCt為9.27±1.29,較陰性組10.51±1.32明顯降低(P<0.05)，表明IL-6基因表達HLA-B27陽性組明顯高于陰性組，具有統(tǒng)計學意義。IL是一種在體內(nèi)調節(jié)免疫和炎癥反應的炎癥因子，其中IL-6是一種多功能細胞因子，在炎癥和免疫反應中和IL-1具有類似的作用，在急性炎癥初始階段IL-1分泌產(chǎn)生，然后刺激IL-6的分泌，兩種因子共同作用促進T、B淋巴細胞的生長和分化，引起炎癥劇烈反應[8]，是炎癥反應的正相關因子。Kramer等[9]發(fā)現(xiàn)急性期葡萄膜炎患者外周血IL-6水平明顯升高，治療穩(wěn)定后其水平明顯下降。Shim等[10]發(fā)現(xiàn)下調IL-6表達可以使Behcet小鼠模型炎癥反應降低。以往有文獻報道，在兒童葡萄膜炎及多種類型葡萄膜炎中，患者眼內(nèi)液均可檢測出IL-6的表達升高。我們的研究也驗證了上述的結論。在研究發(fā)現(xiàn)IL-6較IL-1β及IL-10在HLA-B27陽性的葡萄膜炎患者中起著更重要的作用，可以作為陽性患者治療的一個新的靶點及指導病情發(fā)生發(fā)展變化的作用因子。(2)ILF3下調。本研究發(fā)現(xiàn)HLA-B27陽性組患者ILF3 mRNA ΔCt為8.21±0.83,明顯高于HLA-B27陰性組7.26±0.54，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該因子在葡萄膜炎患者中的表達及相應作用目前尚未見報道。ILF3是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與免疫相關的新基因，文獻報道在一些免疫相關疾病中其表達異常，是一類免疫增強因子[11]。ILF3蛋白在炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用，是白細胞介素起作用所需重要的轉錄因子，白細胞介素依賴其來發(fā)揮相應作用[12-13]。文獻報道在CD4+T細胞上誘導ILF3基因DNA甲基化，會引起血液中IL6等炎性因子的濃度降低[14]，意味著抑制ILF3的活性，可能會降低人體內(nèi)的炎癥反應。同時發(fā)現(xiàn)敲除巨噬細胞上的ILF3基因，能夠顯著降低IL-6和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生。而ILF3的過度表達則可以促進巨噬細胞分泌炎癥因子。另外，葡萄膜炎中多種炎癥因子形成一個細胞因子網(wǎng)絡，各個因子互相間有著影響，我們的研究結果表明在HLA-B27陽性患者中ILF3起著一定作用，結合我們發(fā)現(xiàn)IL-6在陽性患者中表達升高，我們猜測，ILF3表達的降低可能與IL-6升高后對ILF3的反向抑制有關系，當然，具體的原因可能需要在后期的進一步研究中證實。(3)IL-1β、IL-10、TNF-α、PAR2表達量沒有明顯差異。IL-1的主要生物學作用由存在于體液中的IL-1β介導[15]。IL-1β是由巨噬細胞分泌的炎性因子，可以對體內(nèi)大部分細胞產(chǎn)生炎性反應、免疫應答[16]，同時誘導細胞產(chǎn)生多種炎癥因子，然后增強炎性因子的活性,加重炎性反應。已有文獻報道IL-1β在葡萄膜炎中的作用十分關鍵，因子檢測可以發(fā)現(xiàn)葡萄膜炎患者中其水平明顯增高，同時伴隨疾病的進展其表達可以反應性增高[17]。IL-10是由炎癥細胞分泌產(chǎn)生的一種具有免疫抑制活性的細胞因子，可以減輕炎癥反應。能有效抑制Th1細胞和單核巨噬細胞產(chǎn)生IL、TNF等細胞因子，從而降低單核巨噬細胞的抗原呈遞作用[18-19]。文獻報道發(fā)現(xiàn)IL-10在葡萄膜炎后期升高，這可能與炎癥的消退有著關系，而應用重組IL-10蛋白治療大鼠葡萄膜炎模型，發(fā)現(xiàn)治療組大鼠玻璃體內(nèi)IL-6和IL-8明顯下降[20]。Commodaro等[19]觀察發(fā)現(xiàn)恢復期小柳原田綜合征患者外周血中IL-10明顯表達升高。但是這三種白細胞介素在HLA-B27抗原陽性的葡萄膜炎患者中的表達變化情況目前尚未有文獻報道。PAR2是G蛋白耦聯(lián)受體(protease activated receptors，PARs)的家族成員，目前被認為在調控炎癥反應中起著作用，幾乎表達于所有細胞，其生理功能廣泛，參與血栓形成、止血、誘導腫瘤發(fā)生發(fā)展，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在感染、免疫炎癥性疾病、纖維化疾病中有著重要作用。有文獻報道發(fā)現(xiàn)在類風濕性關節(jié)炎患者中，PAR2激動劑可以促進患者的外周血單核細胞分泌的IL-6表達顯著升高。同時在類風濕性關節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)PARs可通過成纖維細胞、單核細胞、T細胞、肥大細胞等多種細胞發(fā)揮促炎作用，而抑制PARs活化可緩解該免疫性疾病發(fā)生發(fā)展[21]。但是目前該因子在非感染性葡萄膜炎中尤其是HLA-B27抗原陽性的葡萄膜炎患者中的表達情況及作用尚未見文獻報道。兩組表達無統(tǒng)計學差異，提示在該疾病中此因子可能并非和IL-6為同一通路。TNF是一種Garswell等于1975年發(fā)現(xiàn)的炎癥因子，其中TNF-α主要由單核巨噬細胞合成、其分泌后可以逆向激活單核巨噬細胞，誘使單核巨噬細胞分泌炎性介質殺滅病原體，同時其還可以提高性中粒細胞吞噬功能[22]。TNF-α被發(fā)現(xiàn)在葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，應用外源性TNF-α可加重大鼠葡萄膜炎的病程。Pérez-Guijo等[23]發(fā)現(xiàn)葡萄膜炎患者房水和血清中TNF-α水平明顯高于對照者。大量的文獻報道發(fā)現(xiàn)在急性期Behcet病患者血清及房水中TNF-α水平明顯高于緩解期患者和健康對照者，其水平變化與炎癥嚴重程度相關。該因子在葡萄炎中有著重要作用，但是我們的研究發(fā)現(xiàn)在HLA-B27抗原陽性及陰性兩組患者中TNF-α mRNA均有表達，但是兩組比較統(tǒng)計學分析并無明顯差異。證實該因子可能并非HLA-B27抗原陽性葡萄膜炎患者的獨特致病因素。

總之，本研究證實了HLA-B27陽性相關的葡萄膜炎患者外周血中IL-6表達上調，ILF3表達下調，IL-1β、IL-10、PAR2、TNF-α表達無明顯差異。提示我們IL-6及ILF3在HLA-B27陽性表達的葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展中有一定作用，可以作為治療靶點來指導疾病的診療。目前來說針對病因復雜，治療困難的葡萄膜炎，單單研究某個炎癥因子的表達變化情況雖然可以一定程度反映其機制及功能，但是所得結果比較局限，與我們在臨床診療中有不少的差距。因此，對復雜的葡萄炎患者炎癥因子集合及相關網(wǎng)絡的研究有著重要的作用，同時炎癥因子網(wǎng)絡的復雜性，也提示我們在臨床診療中，需綜合考慮多種炎癥指標的變化。本研究對炎癥因子在HLA-B27陽性葡萄膜炎中的表達變化情況的研究，不僅能進一步揭示該病的免疫學機制，而且也為進一步探討新的治療方法提供靶點及依據(jù)。

1鄭曰忠. 頑固性葡萄膜炎的生物治療展望. 中華眼科雜志 2016;52(7):551-556

3宋國祥, 黃進賢, 鄧亞玲, 等. 強直性脊柱炎伴發(fā)葡萄膜炎82例臨床分析. 海南醫(yī)學 2014;25(20):3059-3061