劉萱,秦雯,李錚,張憲,杜小偉（.北京市藥品檢驗(yàn)研究院（北京市疫苗檢測(cè)中心） 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 006;.北京城市學(xué)院,北京 00083）

桑白皮為?？浦参锷orus alba L.的干燥根皮。秋末葉落時(shí)至次春發(fā)芽前采挖根部，刮去黃棕色粗皮，縱向剖開，剝?nèi)「?，曬干。有瀉肺平喘，利水消腫的功能。用于肺熱喘咳，水腫脹滿尿少，面目肌膚浮腫[1]。最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[2]。桑白皮中含有多種化學(xué)成分，含傘形花內(nèi)酯、東莨菪素和眾多黃酮成分、桑根皮素、桑素、桑色烯、環(huán)桑素、環(huán)桑色烯等[3,6]。黃酮類化合物在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、改善心血管與內(nèi)分泌等方面具有顯著的藥理活性[4-5,7]。本研究采用高效液相色譜法對(duì)桑白皮中桑酮G、桑酮H含量進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

恒溫水浴鍋（Yamato Water Bath，BS600）、水循環(huán)冷卻器（LabTeach，H35）、冰箱（Haier）、電子天平（BSA822-CW；CPA225D）、紫外光度儀（SHIMADZU，UV-2600），超純水機(jī)（MILLIPORE，Milli-Q）、真空泵（ROCKER420）、超聲波清洗儀（BRANSON8510）、高效液相色譜儀（Waters2695）、色譜柱（Agilent Eclipse XDB C18（4.6mm×250mm，5μm）、桑酮G、桑酮H對(duì)照品、（成都瑞芬思生物科技有限公司）、乙腈（默克JA057930）、甲醇（默克MA01821）、樣品收集情況（見表1）。

表1 桑白皮藥材信息

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桑酮G8.6mg，桑酮H8.4mg，分別置于25ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述對(duì)照品溶液各2ml，分別置于10ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1ml含桑酮G68.8 g、桑酮H67.2 g的溶液，見圖1-3。

圖1 桑酮G對(duì)照品色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 取桑白皮藥材粉末（過二號(hào)篩）（YC-1）約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，稱定重量。加熱回流30min，立即冷卻，再稱定重量。用70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，見圖4。

圖4 桑白皮供試品色譜圖

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系 精密稱取桑酮G8.6mg，桑酮H8.4mg，置于同一25ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取混合對(duì)照品溶液0.4 l、1 l、2 l、4 l、5 l、10 l，按色譜條件依次進(jìn)樣，分別記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明桑酮G、和桑酮H 的線性關(guān)系均良好?；貧w方程分別為，桑酮G：y=2×106x+4.315×103，R1=0.9999，桑酮H：y=8.249×105x-6.281×103，R2=0.9999，結(jié)果見表2。

表2 桑酮G、桑酮H峰面積與濃度

3.2 精密度試驗(yàn) 取桑白皮藥材（YC-1）0.5g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制樣，按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算峰面積RSD。桑酮G：RSD=0.09%；桑酮H：RSD=0.89%。表明精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取桑白皮藥材（YC-1）0.5g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制樣，按色譜條件分別在0h、2h、8h、12h進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算峰面積RSD。桑酮G：RSD=0.37%；桑酮H：RSD=0.18%。結(jié)果表明，供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取桑白皮藥材（YC-1）0.5g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制樣，按色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算峰面積RSD。結(jié)果桑酮G平均含量7.553%，RSD為1.90%，桑酮H平均含量3.152%，RSD為1.63%（n＝6）。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

3.5 回收率試驗(yàn) 取已知含量的桑白皮藥材（YC-1）（桑酮G7.553%，桑酮H3.152%）0.5g，精密稱定，精密加入25ml對(duì)照品溶液（桑酮G濃度：0.0688 g/ml，桑酮H濃度：0.0672 g/ml），按色譜2.2制備方法制備并分析，計(jì)算加樣回收結(jié)果。結(jié)果表明，本測(cè)定方法回收率良好。見表3。

表3 桑酮G、桑酮H回收率測(cè)定結(jié)果

3.6 其他樣品測(cè)定結(jié)果 見表4。

表4 其他樣品測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 色譜條件的考察

4.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取桑酮G、桑酮H對(duì)照品溶液，在210-400nm掃描紫外光吸收光譜。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)對(duì)照品在265nm下，基線噪音均較低。特征峰響應(yīng)值均較高。因此，選擇265nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 桑酮H對(duì)照品色譜圖

圖3 桑酮G、桑酮H混合對(duì)照品色譜圖

4.1.2 流動(dòng)相的選擇 采用A g i l e n t E c l i p s e X D B C 1 8（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫。流速、時(shí)間及洗脫溶液比例等見表5-6，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)265nm，進(jìn)樣體積10μl。

表5 流動(dòng)相洗脫時(shí)間考察

結(jié)果采用表6洗脫時(shí)間短，分離效果好，故此選擇表6方法作為最終方法。

表6 流動(dòng)相洗脫時(shí)間考察

4.2 供試品溶液制備方法的考察

4.2.1 提取溶劑考察 取桑白皮藥材（YC-1）0.5g，精密稱定，置于100ml具塞錐形瓶中，分別精密加入乙醇，70%乙醇，稀乙醇，甲醇，70%甲醇，50%甲醇各50ml，稱定重量，超聲處理（功率100W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用相應(yīng)試劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，用70%甲醇提取桑酮G、桑酮H峰面積均為最高，故本實(shí)驗(yàn)選用70%甲醇作為提取溶劑。

4.2.2 提取方式的考察 取桑白皮藥材（YC-1）0.5g，精密稱定。分別精密加入70%甲醇50ml，分別采用回流30min與超聲（功率100W，頻率40Hz）提取30min的方法提取，制備樣品溶液，測(cè)定，結(jié)果表明，回流提取各成分的含量較高，故選擇回流提取。

4.2.3 提取時(shí)間的考察 取桑白皮藥材（YC-1）0.5g，精密稱定。精密加入70%甲醇50ml，稱定重量。分別回流提取15min、30min、1h、1.5h，回流后立即冷卻，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回流時(shí)間為30min時(shí)檢測(cè)到各成分含量較高，故選擇的提取時(shí)間為回流提取30min。

4.3 不同產(chǎn)地樣品的含量測(cè)定結(jié)果 樣品測(cè)定結(jié)果顯示不同產(chǎn)地對(duì)桑白皮中桑酮G、桑酮H的含量影響較大。其中產(chǎn)地為河南省的桑白皮樣品中桑酮G、桑酮H值均較高。與傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)相近。

4.4 不同色譜柱測(cè)定結(jié)果 取同一樣品分別選?。篕romasil（250×4.6mm）E10611，KR100-5C18色譜柱；Agilent Eclipse XDB C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；Phenomenex Gemini 5μ C18 110A（250×4.6mm，5micron）300268-1色譜柱。分別進(jìn)行測(cè)定，RSD為2.35%。

4.5 本研究采用回流方式進(jìn)行提取，提取完成后曾放至自然冷卻。發(fā)現(xiàn)效果不佳，后改進(jìn)為回流提取后立即冷卻，結(jié)果顯示效果良好。說明桑白皮中的桑酮類成分桑酮G、桑酮H對(duì)熱敏感。本研究建立的桑白皮中黃酮類成分的含量測(cè)定方法快速，靈敏度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可作為桑白皮藥材和飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法之一。