安玉紅，關(guān)天琪，郭艷紅，李 慧,梁世康，黃 濤

(1.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院 食品工程系，貴陽(yáng) 551499； 2.貴州玄德生物科技股份有限公司，貴陽(yáng) 550016)

元寶楓(Acertruncatum)屬槭樹(shù)科(Aceraceae)槭屬落葉喬木，為我國(guó)特有的木本油料作物，廣泛分布于遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、貴州等地，是集食用油、觀賞、木材于一體的具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的樹(shù)種[1]。魏伊楚等[2]對(duì)內(nèi)蒙古、遼寧、山東、陜西等9個(gè)產(chǎn)地的元寶楓籽油進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，元寶楓籽的平均含油率為43.30%，元寶楓籽油不飽和脂肪酸含量為87.05%～90.16%，其中亞油酸含量為32.28%，油酸含量為25.36%，神經(jīng)酸含量為5.25%。2011年我國(guó)批準(zhǔn)元寶楓籽油為新資源食品[3]，使元寶楓籽油正式進(jìn)入人們的日常生活。

隨著人們生活水平的不斷提高，功能性油脂具有的保健和藥用功能越來(lái)越被認(rèn)可，功能性油脂的需求量持續(xù)增長(zhǎng)。元寶楓籽油是目前陸地上已知的食用油脂中神經(jīng)酸含量較高的功能性油脂，神經(jīng)酸具有保護(hù)和修復(fù)腦神經(jīng)損傷、改善老年癡呆、促進(jìn)大腦發(fā)育等功效[4-5]。但在如今普遍處于高脂、高蛋白膳食的情況下，若將元寶楓籽油作為功能性油脂直接飲用或食用，是否會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)肥胖的加劇，還未見(jiàn)報(bào)道。研究表明，攝入大量油脂會(huì)影響機(jī)體的脂代謝、腸道微生物菌群及腸道微環(huán)境[6-8]。目前關(guān)于元寶楓籽油作為功能性油脂在改善正常機(jī)體腸道菌群，調(diào)節(jié)腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡方面有一些研究，如：孫朋浩等[9]研究表明，在正常小鼠飼料中添加元寶楓籽可降低小鼠腸道中葡萄球菌屬(Staphylococcus)和放線桿菌門(mén)(Acinetobacter)的豐度，說(shuō)明元寶楓籽有抑制腸道有害菌的作用；梁嬋華等[10]研究表明，元寶楓籽油能改善脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的腸道損傷小鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞凋亡和黏膜損傷，其機(jī)制與下調(diào) Nod樣受體蛋白3〔NLRP3 炎性小體相關(guān)分子NLR家族Pyrin域蛋白3(pyrin domain contain-ning 3, Nlrp3)〕、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteine-aspartic proteases-1, Caspase1)和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)等的mRNA表達(dá)有關(guān)；陳顯揚(yáng)等[11]研究表明，元寶楓籽油可顯著降低正常大鼠腸道厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)、放線菌門(mén)、艾克曼菌和Paramuribaculum等的豐度，顯著增加擬桿菌門(mén)和普雷沃氏菌屬 NK3B31等的豐度，另外，對(duì)連續(xù)7 d 服用元寶楓籽油的10名健康志愿者服用前后的糞便進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，結(jié)果表明，元寶楓籽油可顯著降低健康志愿者糞便厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)等的豐度，顯著升高擬桿菌門(mén)、乳酸菌的豐度。但元寶楓籽油對(duì)高脂膳食機(jī)體脂代謝和腸道健康的影響還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本文采用高脂膳食誘導(dǎo)小鼠模擬營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩誘發(fā)的機(jī)體肥胖，從小鼠生長(zhǎng)狀況、生理生化、盲腸微環(huán)境和微生物群等指標(biāo)研究元寶楓籽油對(duì)高脂膳食機(jī)體脂代謝和腸道健康的影響，以期為消費(fèi)者食用元寶楓籽油及元寶楓籽油的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

元寶楓籽油(油酸含量為24.2%，亞油酸含量為31.7%，神經(jīng)酸含量為4.38%)，貴州玄德生物科技股份有限公司；60只SPF級(jí)昆明種雄性小鼠〔生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001〕，體質(zhì)量18～20 g，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司；基礎(chǔ)飼料，重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，德國(guó) Qiagen 公司；糞便DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；熒光定量試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，南京建成生物工程研究所；丙酸(純度>99.0%)、丁酸(純度>99.0%)、異丁酸(純度>99.0%)、戊酸(純度>98.0%)、巴豆酸(純度>98%)、丙氨酸(純度>98%)標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；己酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%)，阿拉丁試劑公司；其他試劑均為分析純。

Thermo TRACE 1310-ISQ LT氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Nano Drop 1000微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；SG8200HPT超聲波清洗儀；H1-16KR高速冷凍離心機(jī)；Light Cycler Nano 熒光定量 PCR儀，美國(guó)羅氏公司；SpectraMax190連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó) Molecular Devices公司；L5S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；CTFD-12S真空冷凍干燥機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與樣品采集

將60只昆明種雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、元寶楓籽油低劑量組和元寶楓籽油高劑量組，每組15只，每5只1籠。其中元寶楓籽油高劑量組灌胃劑量為1 200 mg/(kg·d)，元寶楓籽油低劑量組灌胃劑量為600 mg/(kg·d)元寶楓籽油和600 mg/(kg·d)大豆油(灌胃劑量參考余德林等[12]的方法改進(jìn))，而空白組和模型組灌胃1 200 mg/(kg·d)大豆油。模型組和元寶楓籽油組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間一直給予高脂飼料飼養(yǎng)，而空白組小鼠給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，每天早上8:30—9:00進(jìn)行灌胃，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，每3 d稱(chēng)1次體質(zhì)量，并調(diào)整灌胃量，實(shí)驗(yàn)時(shí)間60 d。實(shí)驗(yàn)最后1 d禁食不禁水12 h，乙醚麻醉后，采用鋼尺和軟尺分別測(cè)定體長(zhǎng)和腰圍；然后眼眶取血，于4℃、4 000 r/min離心15 min，-80℃保存，備用；快速解剖出肝臟、脂肪、盲腸等，稱(chēng)量質(zhì)量、分裝，-80℃保存，備用。高脂飼料配方參照美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)[13]配制，配方為：基礎(chǔ)飼料78.8%，蛋黃粉10%，豬油10%，膽固醇1%，膽酸鹽0.2%。

1.2.2 Lee′s指數(shù)的計(jì)算

Lee′s指數(shù)(x1)按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：m為體質(zhì)量，g；l為體長(zhǎng)，cm。

1.2.3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別測(cè)定血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。

1.2.4 腸道指標(biāo)的測(cè)定

1.2.4.1 盲腸及其微環(huán)境指標(biāo)測(cè)定

盲腸內(nèi)容物pH和水分的測(cè)定參考夏雪娟[14]的方法進(jìn)行；盲腸內(nèi)容物硫化氫(H2S)的測(cè)定參照鄭揚(yáng)等[15]的方法進(jìn)行；盲腸內(nèi)容物氨態(tài)氮(NH3-N)的測(cè)定參照蒲萬(wàn)霞等[16]的方法進(jìn)行；盲腸壁表面積和游離氨含量的測(cè)定參照游玉民等[17]的方法進(jìn)行。

1.2.4.2 盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸(SCFA)的測(cè)定

參照李明澤等[18]的方法測(cè)定盲腸內(nèi)容物的SCFA。

GC條件：Agilent HP-INNOWAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量 1 μL，分流比 10∶1；進(jìn)樣口溫度 250℃； 升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?90℃，然后以10℃/min 升溫至 120℃，再以5℃/min 升溫至 150℃，最后以 25℃/min 升溫至 250℃，保持 2 min；載氣(氦氣)流速 1.0 mL/min。

MS條件：電子轟擊電離(EI)源，SIM 掃描方式，電子能量 70 eV，離子源溫度 230℃，傳輸線溫度 250℃，四極桿溫度 150℃。

1.2.4.3 盲腸內(nèi)容物微生物測(cè)定

按照糞便DNA提取試劑盒提取DNA后，進(jìn)行純度檢測(cè)。各腸道菌群特異性PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定各腸道菌群表達(dá)量，以各腸道菌群標(biāo)準(zhǔn)為內(nèi)參計(jì)算其表達(dá)量[19-20]。

表1 各細(xì)菌引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 21.0及Origin 8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，兩組間比較采用Student′st檢驗(yàn)，多組間比較采用One-Way ANOVA 進(jìn)行Duncan分析，以p< 0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 元寶楓籽油對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀況的影響

元寶楓籽油對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀況的影響如表2所示。

表2 元寶楓籽油對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀況的影響(n=15)

由表2可知：與空白組相比，在初體質(zhì)量差異不顯著的情況下，經(jīng)過(guò)60 d高脂飼養(yǎng)，模型組小鼠終體質(zhì)量、腰圍、Lee′s指數(shù)和腹腔脂肪質(zhì)量均顯著增加(p<0.05)，分別增加了31.23%、28.29%、28.23%和71.77%；與空白組相比，模型組攝食量顯著降低(p<0.05)，降低了19.36%；與模型組相比，元寶楓籽油高、低劑量組小鼠攝食量減少，但不顯著(p>0.05),小鼠體質(zhì)量、腰圍、Lee′s指數(shù)和腹腔脂肪質(zhì)量降低，其中高劑量組作用顯著(p<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明元寶楓籽油具有一定的減肥作用，但其作用效果有一定的量效關(guān)系。

2.2 元寶楓籽油對(duì)小鼠血清脂質(zhì)水平的影響

元寶楓籽油對(duì)小鼠血清脂質(zhì)水平的影響如表3所示。

表3 元寶楓籽油對(duì)小鼠血清脂質(zhì)水平的影響(n=15) mmol/L

由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平顯著升高(p<0.05)，分別升了73.68%、62.64%和188.52%，而HDL-C水平顯著降低(p<0.05),下降了49.06%。與模型組相比，元寶楓籽油高、低劑量組小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均顯著降低(p<0.05)，HDL-C水平顯著升高(p<0.05)，其中，高劑量組小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平降幅分別為21.65%、18.55%和38.07%，而低劑量組小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平降幅分別為9.96%、9.72%和18.75%，高、低劑量組HDL-C水平增幅分別為51.85%和22.22%。以上結(jié)果表明，元寶楓籽油具有改善因高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠血清脂代謝紊亂的作用，但不能將高脂膳食小鼠恢復(fù)到正常水平，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.3 元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸及其微環(huán)境的影響

腸道是機(jī)體主要的消化吸收?qǐng)鏊?，盲腸和結(jié)腸是腸道微生物最密集和多樣的區(qū)域。盲腸作為小腸的末端，連接著大腸，此區(qū)域是最早接觸到大腸方向來(lái)源的微生物群落，因而國(guó)內(nèi)外以盲腸研究腸道健康的報(bào)道[17,21-24]較多。元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸及其微環(huán)境的影響分別如表4和表5所示。

表4 元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸的影響(n=15)

表5 元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸微環(huán)境的影響 (n=15)

由表4可知，與空白組相比，模型組小鼠盲腸總質(zhì)量和盲腸內(nèi)容物質(zhì)量顯著增加(p<0.05)，分別增加了89.47%和114.81%。與模型組相比，元寶楓籽油低、高劑量組小鼠盲腸總質(zhì)量和盲腸內(nèi)容物質(zhì)量增加，且高劑量組增加顯著(p<0.05)?？赡苁窃獙殫髯延椭谢钚晕镔|(zhì)對(duì)小鼠腸道產(chǎn)生了刺激作用，增大了盲腸表面積，加強(qiáng)了小鼠盲腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收所致[25]。腸道pH的降低能降低腸癌等腸道類(lèi)疾病發(fā)生的概率[26]，游離氨、硫化氫(H2S)、氨態(tài)氮(NH3-N)是腸道健康的重要生物標(biāo)志物。由表5可知，與空白組相比，模型組小鼠盲腸內(nèi)容物游離氨、氨態(tài)氮、硫化氫和pH顯著增加(p<0.05)，分別增加了173.91%、109.52%、18.46%、12.05%，而盲腸內(nèi)容物水分顯著降低(p<0.05)，降低了 14.06%。與模型組相比，元寶楓籽油高、低劑量組小鼠游離氨和氨態(tài)氮含量顯著降低(p<0.05)，高劑量組硫化氫含量和pH顯著降低(p<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，高脂膳食會(huì)影響小鼠盲腸及其微環(huán)境，而元寶楓籽油可降低因高脂膳食造成的小鼠盲腸代謝產(chǎn)物的毒害損傷。

2.4 元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物SCFA的影響

腸道SCFA可以反映機(jī)體腸道內(nèi)厭氧菌的數(shù)量和代謝情況，其組成和含量與腸道微生物菌群存在一定的相關(guān)性，如乙酸、丁酸和丙酸與瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和乳酸菌(Lactobacillus)呈正相關(guān)，而丁酸與雙歧桿菌(Bifidobacterium)和阿克曼氏菌(Akkermansia)呈正相關(guān)[27]。元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物SCFA的影響如表6所示。

表6 元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物SCFA的影響(n=15) μmol/g

由表6可知，與空白組相比，模型組小鼠盲腸內(nèi)容物中SCFA總量、丁酸、異丁酸、戊酸和丙酸含量顯著降低(p<0.05)，分別降低了28.09%、32.74%、11.22%、18.67%和25.65%。與模型組相比，元寶楓籽油可增加小鼠盲腸內(nèi)容物中SCFA總量、丁酸、戊酸、丙酸和異丁酸含量，其中：元寶楓籽油高劑量組小鼠盲腸內(nèi)容物中SCFA總量、丁酸、戊酸和丙酸的含量顯著增加(p<0.05)，分別增加了19.93%、25.54%、9.94%和18.31%；而低劑量組小鼠盲腸內(nèi)容物中丙酸含量顯著增加(p<0.05)，增加了23.94%。以上結(jié)果表明，元寶楓籽油具有促進(jìn)高脂膳食機(jī)體腸道內(nèi)的發(fā)酵反應(yīng)，改善腸道菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)的作用。

2.5 元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響

元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響如表7所示。

表7 元寶楓籽油對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響(n=15) lg(copies)/g

由表7可知，與空白組相比，模型組小鼠盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭菌的量顯著降低(p<0.05)，分別下降了28.88%、18.41%和29.76%，而腸桿菌、腸球菌和擬桿菌的量顯著升高(p<0.05)，分別上升了24.09%、28.79%和15.73%。與模型組相比，元寶楓籽油高、低劑量組小鼠盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭菌的量均顯著增加(p<0.05)，而腸桿菌、腸球菌和擬桿菌的量顯著減少(p<0.05)。以上結(jié)果表明，元寶楓籽油可改善因高脂膳食造成的小鼠盲腸代謝產(chǎn)物的毒害損傷，增加有益微生物，促進(jìn)腸道健康。

3 結(jié) 論

以高脂膳食小鼠模擬機(jī)體營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，從生長(zhǎng)狀況、血脂、腸道微環(huán)境3個(gè)方面研究元寶楓籽油對(duì)高脂膳食小鼠脂代謝和腸道健康的影響。結(jié)果表明：元寶楓籽油直接飲用或食用，并未加重高脂膳食小鼠脂代謝紊亂，以及促進(jìn)肥胖的發(fā)生；但元寶楓籽油并不能將高脂膳食小鼠恢復(fù)到正常水平。此外，元寶楓籽油可改善因高脂膳食造成的小鼠盲腸代謝產(chǎn)物的毒害損傷，增加有益微生物量，具有一定的維持腸道健康的作用。后續(xù)將采用16S rDNA測(cè)序、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理等進(jìn)一步探明元寶楓籽油對(duì)高脂膳食機(jī)體脂代謝和腸道健康的影響機(jī)制。