許鍵煒，解小芬，匡濤，胡光線，王道勇，冉渺，楊小軍，伍徐嫻

神經(jīng)再生與神經(jīng)系統(tǒng)功能重建一直是世界性的難題。每年全球因?yàn)橐馔鈸p傷導(dǎo)致的癱瘓和神經(jīng)系統(tǒng)退行性變導(dǎo)致的如帕金森病、阿爾茨海默癥等患者高達(dá)5 300萬[1-3]，給患者、家庭及社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，隨著對干細(xì)胞研究的深入，有關(guān)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的研究取得了一定的進(jìn)展。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC)因其具有自我更新、多向分化及免疫調(diào)節(jié)等能力，在組織再生與修復(fù)領(lǐng)域備受關(guān)注[4]。課題組前期發(fā)現(xiàn)hUC-MSC在堿性成纖維生長因子、二甲基亞砜及丁羥基茴香醚等的誘導(dǎo)下，可成神經(jīng)樣細(xì)胞分化，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶[5]。移植hUC-MSC治療大鼠脊髓損傷模型，發(fā)現(xiàn)hUC-MSC有明顯的靶向歸巢損傷部位的特性[6]。然而，對于一些較大的腦組織缺損如膠質(zhì)瘤切除術(shù)后及脊髓損傷等，僅依靠hUC-MSC成神經(jīng)分化，難以修補(bǔ)組織的缺損，最終難免發(fā)展成病理性的膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)功能的重建。因此，尋找生物相容性和機(jī)械性能良好的材料，聯(lián)合干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷成為研究的焦點(diǎn)。本研究利用天然產(chǎn)物家蠶絲素蛋白(silk fibroin,SF)制備成的SF薄膜與成神經(jīng)分化hUC-MSC共培養(yǎng)，探討SF薄膜對成神經(jīng)分化hUC-MSC生物學(xué)特性的影響，為hUC-MSC作為種子細(xì)胞聯(lián)合生物材料治療神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新生兒臍帶由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，并通過醫(yī)院人體倫理委員會(huì)審批。SF(亳州市德億利藥業(yè)銷售有限公司)，干細(xì)胞基本培養(yǎng)基(Gibco 公司)，丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，B27(Gibco 公司)，多聚賴氨酸(Poly-L-lysine，PLL)、FITC 標(biāo)記的β-Ⅲ-Tubulin 抗體(Chemicon公司)，Annexin-V FITC凋亡試劑盒(美國BD公司)。U-LH100L-3活細(xì)胞工作站(日本OLYMPUS公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoForma公司)，酶標(biāo)儀(BioTek，Winooski，美國VT公司)，F(xiàn)ACSCantot Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 SF水溶液的制備

家蠶絲分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液煮沸脫膠，經(jīng)3次煮沸，每次30 min，前2次每次煮沸后用60 ℃雙蒸水清洗3遍，最后1次用雙蒸水煮沸并清洗。脫膠所得純SF于LiBr∶C2H5OH=40∶60 (質(zhì)量比)、(80±2)℃恒溫水浴攪拌溶解，獲得再生SF溶液。經(jīng)冷卻后，將SF溶液用截流分子量為10 000的透析袋流水透析2 d，再用雙蒸水透析1 d，每隔2 h換1次水，得SF水溶液。過濾后密封保存于冰箱中備用。

1.2.2 SF薄膜的制備

取已處理過的蓋玻片若干，用SF溶液包被蓋玻片，于烘箱中60 ℃烘烤2 h，然后用酒精覆蓋蓋玻片將其固定過夜。之后用雙蒸水清洗7～8 次，每次20 min，在室溫下自然風(fēng)干。所得SF薄膜材料使用前放置于培養(yǎng)皿中并在超凈臺(tái)紫外燈下照射30 min進(jìn)行無菌處理。

1.2.3 hUC-MSC的培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定

取健康的新生兒臍帶(足月兒，不帶細(xì)菌及病毒等)，無菌生理鹽水清洗，去除血凝塊，75%酒精中浸泡30 s，用無菌生理鹽水沖洗3遍去除殘余酒精。將清洗后的臍帶內(nèi)的動(dòng)、靜脈血管剝離丟棄，再分離出血管周圍的華通氏膠，用無菌的眼科鑷將華通氏膠放入無菌的玻璃小瓶，用無菌眼科剪將華通氏膠剪碎成約1 mm3大小的組織塊，將剪碎的華通氏膠均勻地鋪在培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待原代細(xì)胞從華通氏膠組織塊爬出后對其進(jìn)行半換液，細(xì)胞融合至80%左右，可以對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集P3代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)志物CD105、CD44、CD90及CD73等。

1.2.4 hUC-MSC成神經(jīng)樣分化及鑒定

選取生長狀況良好的第4代hUC-MSC，按5×104/mL 接種于含包被PLL蓋玻片的35 mm培養(yǎng)皿中。實(shí)驗(yàn)組：用hUC-MSC生長培養(yǎng)基(L-DMEM+10% FBS)培養(yǎng)。接種24 h后觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞60%鋪滿蓋玻片時(shí)，棄生長培養(yǎng)基，加入含10 μg/L bFGF的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)24 h后，換成無血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基[含2%二甲基亞砜(DMSO)和200 μmol/L 丁羥基茴香醚(BHA)]繼續(xù)誘導(dǎo)6 h即誘導(dǎo)30 h。維持18 h即誘導(dǎo)48 h，之后繼續(xù)維持24 h即誘導(dǎo)72 h。對照組：始終以hUC-MSC常規(guī)培養(yǎng)基(10%FBS+L-DMEM液)培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞，取誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)24 h、誘導(dǎo)30 h、誘導(dǎo)48 h、誘導(dǎo)72 h的細(xì)胞進(jìn)行固定，并進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物巢蛋白(nestin)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)的免疫熒光染色檢測。

1.2.5 成神經(jīng)樣分化hUC-MSC在SF薄膜上的培養(yǎng)及細(xì)胞生物學(xué)性狀觀察

取上述成神經(jīng)樣分化hUC-MSC制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞活力后，按2.5×104/mL密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h及72 h后，分別去除培養(yǎng)基，用PBS 清洗1 次，4%多聚甲醛、4 ℃冰箱內(nèi)固定過夜。 PBS清洗后，加FITC 標(biāo)記的羊抗鼠β-Ⅲ-Tubulin 抗體(1∶200)，室溫下放置1 h，PBS 清洗，50%甘油封片，U-LH100L-3活細(xì)胞工作站觀察并采集圖片。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8，Sigma-Aldrich)檢測不同材料對細(xì)胞增殖的影響。培養(yǎng)72 h后，用10 mL CCK-8和90 mL L-DMEM組成的100 mL溶液轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)2 h后，通過酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度。用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡和死亡進(jìn)行定量，檢測細(xì)胞與培養(yǎng)材料的生物相容性。分別對在PLL和SF膜上培養(yǎng)72 h的成神經(jīng)樣分化hUC-MSC用0.25%的胰蛋白酶消化，PBS 清洗1次后，用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer I，F(xiàn)ITC)結(jié)合的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙重染色后進(jìn)行檢測，并使用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過 NIH ImageJ 軟件處理，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)量化圖由SYSTAT.Sigma Stat計(jì)算并繪制。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSC的培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定

臍帶華通氏膠組織碎塊接種第3天，倒置熒光顯微鏡下可觀察到少量長梭狀細(xì)胞爬出貼于皿底，4～5 d，細(xì)胞迅速增多，匯聚后細(xì)胞排列緊密，呈群落樣生長，聚合的細(xì)胞呈漩渦狀。原代細(xì)胞融合達(dá)80%左右，可進(jìn)行傳代。經(jīng)過數(shù)代培養(yǎng)后，細(xì)胞形狀無明顯變化，增殖能力無明顯變化(圖1)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示CD105、CD44、CD90及CD73呈陽性表達(dá)。

圖1 P3代的hUC-MSC的細(xì)胞形態(tài)(標(biāo)尺=100 μm)

2.2 hUC-MSC成神經(jīng)樣分化

經(jīng)上述方法誘導(dǎo)30 h，hUC-MSC由不規(guī)則多角長梭形逐漸變圓，折光性增強(qiáng)，伸出細(xì)長的突起，并且多為兩極突起。繼續(xù)維持培養(yǎng)48 h后，發(fā)生形態(tài)改變的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加，細(xì)胞出現(xiàn)3個(gè)或更多分叉及次級(jí)分叉，呈現(xiàn)出典型的神經(jīng)元樣(圖2)。

圖2 hUC-MSC成神經(jīng)樣分化圖(標(biāo)尺=100 μm)

通過免疫熒光技術(shù)檢測nestin和NSE的表達(dá)，整個(gè)誘導(dǎo)分化過程中，nestin的表達(dá)呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。NSE在誘導(dǎo)期和維持前期均為陰性，在整個(gè)過程的中、末期才開始表達(dá)，到維持72 h時(shí)有75%左右的細(xì)胞表達(dá)。不同誘導(dǎo)時(shí)間的hUC-MSC免疫熒光結(jié)果統(tǒng)計(jì)見圖3。

注：* P<0.05，** P<0.01，表示與對照組比較差異有顯著意義。圖3 不同誘導(dǎo)時(shí)間的hUC-MSC免疫熒光結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖

2.3 成神經(jīng)樣分化hUC-MSC在SF膜上的生長及生物學(xué)性狀

成神經(jīng)樣分化hUC-MSC培養(yǎng)在SF膜及PLL上，在上述配制的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1～3 d會(huì)保持圓形或橢圓形，兩極或更多分叉及次級(jí)分叉，伸出細(xì)長的突起。培養(yǎng)24 h，β-Ⅲ-Tubulin免疫熒光染色均呈陽性表達(dá)，SF膜上細(xì)胞樹枝狀分叉數(shù)與常規(guī)包被液PLL相似。培養(yǎng)72 h，β-Ⅲ-Tubulin免疫熒光染色均持續(xù)呈陽性表達(dá)，SF膜上細(xì)胞樹枝狀分叉數(shù)多于常規(guī)包被液PLL上的細(xì)胞樹枝狀分叉數(shù)。對每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)觀察5個(gè)視野的活細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h，SF膜上附著大量活細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量較接種時(shí)沒有明顯減少，與PLL包被的培養(yǎng)皿相比，細(xì)胞密度相似。培養(yǎng)至72 h后，SF膜上細(xì)胞數(shù)量較PLL包被的培養(yǎng)皿上的細(xì)胞數(shù)量明顯增多。CCK-8分析結(jié)果表明，三維SF膜培養(yǎng)比二維PLL涂層培養(yǎng)更有利于成神經(jīng)樣分化hUC-MSC的擴(kuò)展，細(xì)胞在三維SF膜上的活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，顯著高于在二維PLL涂層培養(yǎng)皿中的活性。2組細(xì)胞的存活率第1天至第3天均增加，第3天以后存活曲線趨于平穩(wěn)。成神經(jīng)樣分化hUC-MSC在SF膜及PLL上的生長情況見圖4。

注：A為β-III-Tubulin(綠)/Hoechst 33258(藍(lán)) /GFAP(紅)免疫熒光染色(Scale bar=100 μm)，B為成神經(jīng)樣分化hUC-MSC在不同材料上的相對存活率。*P<0.05。圖4 成神經(jīng)樣分化hUC-MSC在不同材料上的生長情況

對培養(yǎng)72 h成神經(jīng)樣分化hUC-MSC進(jìn)行Annexin-V和PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡和死亡情況。在SF膜及PLL包被的培養(yǎng)皿上成神經(jīng)樣分化hUC-MSC大多數(shù)是活的，SF膜上活細(xì)胞數(shù)量占97.5%，PLL包被的培養(yǎng)皿中活細(xì)胞數(shù)量占94.5%。這些結(jié)果表明，SF膜無毒，具有良好的生物相容性，可使成神經(jīng)樣分化hUC-MSC粘附、擴(kuò)散，并具有良好的增殖能力。成神經(jīng)樣分化hUC-MSC在SF膜及PLL上的存活率見圖5。

圖5 成神經(jīng)樣分化hUC-MSC在不同材料上的存活率

3 討論

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠶SF對于細(xì)胞的附著、生長及增殖具有良好的效果[7]。絲素來源于蠶絲中心，是一種高純度的天然蛋白，因其具有無毒、無刺激、無抗原性及易降解等優(yōu)點(diǎn)[8]，目前已經(jīng)在手術(shù)縫合線、創(chuàng)面保護(hù)材料、人工器官及藥物緩釋體等生物材料方面得到了廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以hUC-MSC作為種子細(xì)胞，誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，并表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin和NSE，說明hUC-MSC可以分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，這為間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實(shí)驗(yàn)支持。通過對成神經(jīng)樣分化的hUC-MSC在SF膜上的生長情況及生物學(xué)性狀的實(shí)驗(yàn)觀察，結(jié)果表明SF膜對成神經(jīng)樣分化的hUC-MSC具有良好的生物相容性和支持作用。與PLL相比，SF膜更能促進(jìn)成神經(jīng)樣分化的hUC-MSC的成活和成熟。通過β-Ⅲ-Tubulin特異性免疫熒光染色，隨機(jī)選取熒光視野內(nèi)β-Ⅲ-Tubulin陽性細(xì)胞，計(jì)算單個(gè)細(xì)胞的樹枝狀分叉總數(shù)、一級(jí)分叉數(shù)，并測量細(xì)胞樹枝狀分叉總長度發(fā)現(xiàn)，SF膜上的成神經(jīng)樣分化的hUC-MSC與常規(guī)包被的PLL上的成神經(jīng)樣分化hUC-MSC一樣具有較高的復(fù)雜度，說明SF膜非常適合成神經(jīng)樣分化hUC-MSC的生長，并促進(jìn)其分化。CCK-8及流式細(xì)胞檢測結(jié)果證明SF膜具有良好的生物相容性，能更好地支持成神經(jīng)樣分化的hUC-MSC的生長，促進(jìn)其增殖，并提高其成活率。

神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，炎癥因子可通過激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，使其再進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)，并誘導(dǎo)其增殖、分化，產(chǎn)生各種神經(jīng)細(xì)胞來代替缺損的細(xì)胞[9-11]。但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖產(chǎn)生的幾乎全是膠質(zhì)細(xì)胞[12-13]。由內(nèi)源性干細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)組織可能不足以代替損傷后缺失的神經(jīng)組織，尤其在諸如腦和脊髓損傷以及大腦膠質(zhì)瘤切除術(shù)后等較為嚴(yán)重的缺損下，這就限制了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。若直接將大量外源性細(xì)胞移植注入損傷部位，又會(huì)因?yàn)榧?xì)胞缺乏支撐條件而大量死亡[14]。因此，利用組織工程技術(shù)開發(fā)SF膜來為種子細(xì)胞的生存和遷移創(chuàng)造條件，對于提高細(xì)胞的存活率并發(fā)揮功能提供了可能。SF膜是一種極具開發(fā)潛力的神經(jīng)組織工程的生物材料，并可能為探討神經(jīng)系統(tǒng)損傷或神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的有效治療及干預(yù)，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)及功能重建提供新的途徑。