潘曉藝 藺凌云 朱 悅 姚嘉赟 尹文林 劉憶瀚 陳 凡 沈錦玉, ①

鯉皰疹病毒2型(CyHV-2)滅活疫苗制備及其免疫效力測定*

潘曉藝1藺凌云1朱 悅2姚嘉赟1尹文林1劉憶瀚1陳 凡3①沈錦玉1, 2①

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室 浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室 浙江湖州 313001; 2. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 浙江舟山 316022; 3. 杭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 浙江杭州 310001)

鯽造血器官壞死病是由鯉皰疹病毒2型(CyHV-2)引起的危害我國養(yǎng)殖鯽魚()最嚴重的病毒性疾病。為制備有效預(yù)防鯽造血器官壞死病的滅活疫苗, 以CyHV-2代表流行株CNDF-TB2015為疫苗株, 以CSC細胞系進行病毒增殖, 并采用不同濃度的病毒對不同規(guī)格鯽魚進行攻毒, 建立攻毒模型。結(jié)果表明, 培養(yǎng)的病毒滴度達1010TCID50/mL, 以4×107TCID50/尾的劑量腹腔注射感染體重300 g的鯽魚可造成100%的死亡率。對病毒滅活劑甲醛、β-丙內(nèi)酯和BEI滅活條件進行篩選優(yōu)化, 對疫苗免疫佐劑763A、IMS1312、鋁膠和M402進行篩選, 結(jié)果表明, 濃度為108.3TCID50/mL的病毒液最佳滅活條件為終濃度10 mmol/L的BEI 37 °C滅活72 h, 疫苗制備最佳佐劑為水佐劑IMS1312。對滅活疫苗的最小免疫劑量、最佳免疫劑量和有效免疫產(chǎn)生期進行測定, 結(jié)果表明, 要獲得70%以上保護率的最小免疫劑量為8×106TCID50/尾, 最佳免疫劑量為4×107TCID50/尾, 在免疫4周后保護率可達80%, 5周后保護率達到100%。制備的滅活疫苗為鯽造血器官壞死病的免疫預(yù)防提供了有力手段, 也為其他水產(chǎn)動物病毒滅活疫苗的制備提供了借鑒。

鯉皰疹病毒2型; 鯽造血器官壞死病; 滅活疫苗; 免疫效力

鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)是造成鯽造血器官壞死病的病原, 可感染鯽魚及其變種。自1992年在日本金魚養(yǎng)殖場首次發(fā)現(xiàn)該病以來, 至今已在21個國家被報道(Jung, 1995; Thangaraj, 2021)。2010年傳入我國以來, 該病已在我國大部分的鯽魚養(yǎng)殖區(qū)相繼發(fā)生, 死亡率高達80%以上(Xu, 2013; 袁雪梅等, 2019), 已成為影響我國鯽魚養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的疾病, 雖沒被列入動物疫病名錄, 但2020年在全國監(jiān)測的15個省范圍內(nèi), 監(jiān)測到的樣品陽性率達到3.8% (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2021), 表明對該病的防控迫在眉睫。

針對水產(chǎn)動物病毒性疾病的治療, 疫苗的免疫預(yù)防是最為有效的手段之一。廖紅等(2016)以CyHV-2的ORF5的截短基因表達的蛋白制作成亞單位疫苗, 進行異育銀鯽的免疫, 按50 μg/ind.每7 d連續(xù)免疫三次后進行攻毒, 獲得了35%的保護率。周勇等(2018)利用CyHV-2 ORF25蛋白的抗原表位, 制備了重組蛋白亞單位疫苗, 免疫鯽魚后, 相對免疫保護率能達到47%。李坤(2018)構(gòu)建的ORF66和ORF72的重組桿狀病毒疫苗, 免疫后沒有獲得免疫應(yīng)答。然而, 串聯(lián)ORF66、ORF72、ORF81、ORF82四個基因構(gòu)建的重組桿狀病毒, 對鯽魚分別進行注射和口服免疫, 攻毒保護率分別達到80%和40.69%。以上針對CyHV-2抗原蛋白的亞單位疫苗都獲得了一定的免疫保護率。

然而, 由于敏感細胞系對CyHV-2病毒增殖效率不是很高, 因此在滅活疫苗上的研究較少。最近幾年針對CyHV-2, 馬杰和魏鈺娟等分別建立了可穩(wěn)定增殖CyHV-2病毒的鯽腦組織細胞系(GiCB) (Ma, 2015)和鯽魚脊髓組織細胞系(CSC) (魏鈺娟等, 2020), 傳代病毒滴度分別可達到10(7.5±0.37)TCID50/mL和109.33TCID50/mL, 這為滅活疫苗的制備提供了高效的病毒增殖細胞。根據(jù)Zhang等(2016)采用GiCB細胞擴增病毒, 制備了β-丙內(nèi)酯滅活的CyHV-2滅活疫苗, 免疫鯽魚后能同時誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生非特異性和特異性的抗病毒免疫反應(yīng), 免疫保護率達到了71.4%。

本研究采用建立的CSC細胞系擴培CyHV-2, 優(yōu)化滅活條件和最小免疫劑量, 建立攻毒模型, 免疫鯽魚后測定免疫產(chǎn)生期和攻毒保護率, 評價疫苗的免疫效力, 以期為鯽造血器官壞死病的免疫預(yù)防提供有效的滅活疫苗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

100～500 g的健康鯽魚()購于浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店基地, 于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng), 水溫為(24±1) °C。鯉皰疹病毒2型(CyHV-2)敏感細胞系CSC (CCTCC No.: C2018211)由本實驗室建立并保存(沈錦玉等, 2019), CyHV-2疫苗株選取區(qū)域流行代表毒株CNDF-TB2015 (GenBank: MN201961.1), 本實驗室保存。胎牛血清、雙抗、胰酶和M199培養(yǎng)基購自Gibco公司, 甲醛(Formaldehyde)、β-丙內(nèi)酯(β-Propiolactone)、二乙烯甲胺(BEI)、硫代硫酸鈉溶液、鋁膠佐劑、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自北京索萊寶科技有限公司, ISA 763A和IMS1312佐劑由SEPPIC公司提供, 納米級氫氧化鋁佐劑M402由成都依思康醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2 CyHV-2病毒液制備

采用含體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的M199培養(yǎng)液, 24 °C培養(yǎng)CSC細胞系至長滿單層, 接種CNDF-TB2015毒株病毒液, 24 °C吸附1 h后, 棄去病毒稀釋液, 換成血清濃度為2%的M199維持液繼續(xù)培養(yǎng), 逐日觀察細胞病變情況, 細胞病變達到60%以上時收獲病毒液, 取少量病變細胞采用2%戊二醛進行固定、制樣和透射電鏡觀察, 并對病毒液進行半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量TCID50測定(魏鈺娟等, 2020)。

1.3 攻毒模型建立

1.3.1 魚體規(guī)格對病毒的敏感性 分別取100、200、300、400、500 g的健康鯽魚, 每組20尾, 各種規(guī)格同時設(shè)置1個平行組, 用108.3TCID50/mL的病毒液進行攻毒試驗, 每尾0.2 mL, 記錄每天的死亡情況, 從而篩選出最適實驗用魚的體重。

1.3.2 病毒致死劑量確定 挑選300 g左右的鯽魚,分為4組, 每組設(shè)置1個平行組, 分別注射濃度為108.3、107.6、106.9TCID50/mL的病毒液和生理鹽水, 每尾鯽魚腹腔注射0.2 mL; 養(yǎng)殖水槽常規(guī)充氧, 水溫控制在(24±1) °C, 連續(xù)觀察14 d, 記錄死亡情況。

1.4 CyHV-2滅活條件優(yōu)化

選擇病毒滅活疫苗最常用的甲醛、β-丙內(nèi)酯和BEI三種滅活劑, 按表1設(shè)置滅活劑終濃度、滅活時間、滅活溫度等條件組合對108.3TCID50/mL的病毒液進行滅活處理, 共27組。其中BEI滅活后, 加入同等終濃度的硫代硫酸鈉溶液終止滅活。

將上述27組滅活后的病毒液各取0.5 mL接入CSC細胞, 并設(shè)立一組陽性對照和陰性對照, 連續(xù)觀察細胞病變情況, 未出現(xiàn)細胞病變則再盲傳1次。

表1 滅活劑及滅活條件

Tab.1 Inactivator and inactivation conditions

1.5 佐劑篩選

選取4種常用佐劑(油佐劑763A, 水佐劑IMS1312, 鋁膠, 納米佐劑M402)分別對CYHV-2滅活疫苗進行乳化, 配制成相當于最終病毒載量濃度108.3TCID50/mL, 并分別免疫規(guī)格為300 g左右的健康鯽魚, 定期進行攻毒試驗, 篩選最佳佐劑。

1.6 滅活疫苗免疫保護率測定

利用109TCID50/mL的CyHV-2病毒液滅活后, 用IMS1312佐劑乳化制成不同抗原濃度的滅活疫苗(108.3, 107.6, 106.9, 106.2, 105.5TCID50/mL), 同時設(shè)IMS1312佐劑對照組, 共6組, 每組30尾300 g健康鯽魚, 每尾腹腔注射疫苗0.2 mL, 免疫4周后攻毒, 每日統(tǒng)計死亡魚數(shù), 依下列公式計算相對保護率(relative percentage survival, RPS):

相對保護率(RPS)=[1 – (免疫組死亡率/對照組死亡率)]×100%. (1)

1.7 免疫產(chǎn)生期測定

利用終濃度108.3TCID50/mL的IMS1312佐劑疫苗免疫150尾300 g健康鯽魚, 每隔7 d取20尾進行攻毒保護率測定, 14 d內(nèi)觀察發(fā)病死亡情況, 計算保護率。

2 結(jié)果

2.1 CyHV-2病毒液制備

CSC細胞接種CNDF-TB2015毒種后, 在第8 d細胞病變達到70%以上(圖1b)收獲病毒, 并進行擴培,制得一批經(jīng)測定濃度為1010TCID50/mL的病毒培養(yǎng)液, 分裝于液氮中保存。病變細胞固定后透射電鏡觀察, 可以看到大量的皰疹病毒分布在細胞核中(圖1c), 表明毒株CNDF-TB2015可在CSC細胞中大量復(fù)制, 獲得的病毒培養(yǎng)液含有高濃度的病毒粒子, 為滅活疫苗的抗原制備提供了高效的培養(yǎng)體系。

圖1 CSC病變細胞特征及電鏡圖

注: a. 正常CSC細胞; b. 受CyHV-2感染的CSC細胞; c, d. 病毒電鏡圖, d表示c圖中的框線內(nèi)區(qū)域

2.2 攻毒模型建立

2.2.1 不同規(guī)格魚體對病毒敏感性 以濃度為108.3TCID50/mL的病毒液0.2 mL/尾進行腹腔注射攻毒, 相當于4×107TCID50/尾, 連續(xù)觀察14 d, 記錄死亡率, 結(jié)果顯示, 200 g及以上的鯽魚攻毒后14 d內(nèi)全部發(fā)病死亡, 并表現(xiàn)出典型的鯽魚造血器官壞死病臨床癥狀(圖2)。而規(guī)格100 g組死亡率僅為20%, 表明小規(guī)格鯽魚對CyHV-2具有一定的耐受性。因此, 根據(jù)攻毒情況, 選取300 g作為攻毒模型中鯽魚規(guī)格大小的標準。

2.2.2 病毒致死劑量確定 通過不同濃度的病毒進行鯽魚的腹腔注射攻毒試驗, 由圖3可知, 攻毒后, 108.3TCID50/mL濃度組最早出現(xiàn)死亡情況, 并于7 d內(nèi)全部死亡, 而107.6TCID50/mL濃度組出現(xiàn)死亡時間后延, 至第11 d全部死亡。106.9TCID50/mL濃度組最終致死率為35%。綜合考慮, 以107.6TCID50/mL的濃度作為攻毒模型的攻毒濃度。

2.3 CyHV-2滅活條件篩選優(yōu)化

各組滅活后的病毒液經(jīng)無菌檢測后, 接種CSC細胞進行細胞毒性檢測, 結(jié)果見表2。甲醛組最佳滅活條件為終濃度0.3%, 65 °C滅活3 h; β-丙內(nèi)酯組最佳條件為終濃度0.2%, 4 °C滅活72 h; BEI組最佳條件為終濃度10 mmol/L, 37 °C滅活72 h。雖然甲醛具有最好的滅活性能, 但甲醛去除增加了不少程序和時間, 因此, 綜合考慮, 選取BEI的最佳滅活條件(BEI濃度10 mmol/L, 37 °C滅活72 h)作為滅活條件。

2.4 免疫佐劑篩選

采用4種不同佐劑制備的滅活疫苗同等條件下免疫鯽魚后, 在第5、7、9周對各免疫組鯽魚進行免疫保護率測定, 結(jié)果見表3。表明IMS1312、鋁膠佐劑組和M402組都具有較高免疫保護率, 分別為70%、60%和60%, 其中佐劑IMS1312對提高免疫保護率更具優(yōu)勢, 并且IMS1312為一種水佐劑, 注射后對機體的刺激和病理損傷更低, 因此選擇IMS1312作為本疫苗制備的佐劑。

圖2 鯽魚受CyHV-2感染的發(fā)病癥狀

注: a, b, c分別為正常魚; d, e, f為發(fā)病魚的鰓、腹部和肛門出血癥狀

圖3 不同病毒濃度致死率

表2 滅活劑滅活條件優(yōu)化

Tab.2 Optimization of inactivation conditions

注: +++表示直接出現(xiàn)CPE (細胞病變效應(yīng), cytopathic effect); ++表示盲傳1次后出現(xiàn)CPE; +表示盲傳2次后出現(xiàn)CPE; –表示3次盲傳均未出現(xiàn)CPE

表3 不同佐劑制備的疫苗的免疫保護率

Tab.3 Immune protection rate of vaccines prepared with different adjuvants

2.5 滅活疫苗免疫保護率測定

按不同TCID50濃度滅活的病毒, 用IMS1312佐劑乳化配制成滅活疫苗, 免疫健康鯽魚4周后, 按濃度107.6TCID50/mL的病毒液進行攻毒, 連續(xù)觀察14 d后統(tǒng)計免疫保護率, 見圖4, 保護率達到70%以上的最小免疫劑量為107.6TCID50/mL×0.2 mL/尾, 相當于8.0×106TCID50/尾。而免疫劑量為108.3TCID50/mL× 0.2 mL/尾的時候, 即4.0×107TCID50/尾, 攻毒保護率可達到100%, 因此選取4.0×107TCID50/尾的免疫劑量作為最佳免疫劑量。

2.6 免疫產(chǎn)生期測定

對免疫后的鯽魚, 在第1周～第6周采用攻毒的方式評價免疫保護的產(chǎn)生期, 攻毒后觀察14 d, 相對保護率如圖5。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn), 免疫后的鯽魚在第3周產(chǎn)生了30%的保護率, 之后保護率逐漸升高, 至第5周獲得了100%的免疫保護率, 第4周也可獲得高達80%的免疫保護率。通過對免疫產(chǎn)生期的分析表明, 養(yǎng)殖鯽魚應(yīng)在鯽造血器官壞死病發(fā)病季35 d之前進行疫苗免疫, 以獲得對發(fā)病季節(jié)鯽魚最佳的免疫保護。

圖4 不同劑量疫苗免疫后的相對保護率

圖5 疫苗免疫后不同時期的保護率

3 討論

3.1 各種CyHV-2疫苗免疫效力分析

疫苗接種可以刺激魚體產(chǎn)生對病原體強烈和較長的免疫保護力。近年來, 由于鯽造血器官壞死病對鯽魚養(yǎng)殖業(yè)巨大的負面影響, 研制該病的免疫制劑較為迫切。國內(nèi)一些研究機構(gòu)已對CyHV-2的相關(guān)疫苗進行了研究, 并取得了進展。其中, 研制的CyHV-2基因工程亞單位疫苗表現(xiàn)出了一定的保護率(廖紅等, 2016; 李坤, 2018; 周勇等, 2018)。

然而, CyHV-2結(jié)構(gòu)蛋白和外膜蛋白種類多樣, 主要保護性抗原至今未明, 全病毒的滅活疫苗在抗原的完整性上表現(xiàn)出了絕對優(yōu)勢, 并且與全病毒的弱毒苗相比, 滅活疫苗還避免了因毒力返強引發(fā)的風(fēng)險。該病在我國暴發(fā)初期, 由于缺乏病毒敏感的細胞系, 滅活疫苗遲遲未能被研究, 但隨著近年CyHV-2敏感細胞系的建立(Ma, 2015; 魏鈺娟等, 2020), CyHV-2的細胞培養(yǎng)與滅活疫苗也被進行了研究(Zhang, 2016)。王維玲(2017)利用β-丙內(nèi)酯制備了CyHV-2滅活疫苗, 通過疫苗浸泡免疫健康異育銀鯽魚種, 發(fā)現(xiàn)在免疫后第8周, 相對免疫保護率為61.6%, 在第4周加強免疫組相對保護率達到了73.1%。而本研究采用滅活劑BEI制備的毒株CNDF-TB2015的滅活疫苗, 以IMS1312為佐劑(抗原量相當于108.3TCID50/mL), 注射免疫4周后, 攻毒免疫保護率達到100%, 相比已報道的幾種滅活疫苗和亞單位疫苗具有更高的保護率, 可以用于鯽造血器官壞死病的免疫預(yù)防。

3.2 不同病毒滅活劑對滅活CyHV-2的效果分析

滅活疫苗在制備過程中, 如何對病毒進行徹底滅活的同時, 最大限度地保護抗原的完整性是其關(guān)鍵點。通?？乖诓煌瑴缁顒┳饔孟? 抗原完整性和穩(wěn)定性會受到不同程度的影響。甲醛雖然已被廣泛應(yīng)用于疫苗的制備, 大多數(shù)魚類細菌滅活疫苗都通過甲醛滅活制備而成(王璐瑤等, 2018), 但用甲醛過度滅活會導(dǎo)致對相應(yīng)抗原的意外修飾, 從而降低疫苗抗原性和保護效力(Herrera-Rodriguez, 2019)。為了選擇一種能滅活病毒又能很好保全抗原的滅活劑, 本研究在制備滅活苗的過程中, 選取以破壞病毒核酸來滅活病毒的滅活劑β-丙內(nèi)酯和BEI作為篩選目標。

β-丙內(nèi)酯已被應(yīng)用于CyHV-2的滅活(Zhang, 2016; 王維玲, 2017), 也有研究者發(fā)現(xiàn)其在滅活流感病毒和保全抗原完整性上要優(yōu)于甲醛(Mondal, 2005), β-丙內(nèi)酯在滅活流感病毒過程中, 以0.1%的濃度在高于18 °C的溫度下孵育6～18 h, 能夠完全滅活流感病毒。若在4 °C下, 則需要72 h以上的滅活時間才能完全滅活流感病毒(Pawar, 2015)。本研究采用不同濃度的β-丙內(nèi)酯在4 °C滅活CyHV-2, 發(fā)現(xiàn)也需滅活72 h以上才能完全滅活CyHV-2, 與文獻報道相符。

而核酸烷化劑BEI, 早在1959年就被用作滅活病毒材料的殺病毒劑(Brown, 1959)。BEI濃度是影響病毒滅活效果的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)先前BEI對手足口病毒滅活效果的研究, 滅活所需的時間隨著BEI濃度的增加而減少(Aarthi, 2004)。本研究采用不同濃度的BEI滅活CyHV-2, 也表現(xiàn)出了滅活時間的差異, 其中BEI最高濃度10 mmol/L需要72才能完全滅活CyHV-2病毒。

在選擇最佳滅活劑時, 為了保護病毒效價, 在同等條件下, 優(yōu)先選擇低濃度、較低溫度和較短處理時間就達到滅活效果的滅活劑。甲醛雖然價格低, 但其滅活溫度高, 易造成抗原降解, 免疫原性下降, 并有致癌作用(徐守振等, 2010); β-丙內(nèi)酯在使用時需要較大體積比, 單價高, 對于市場價格低的水產(chǎn)疫苗, 不利于推廣; 而BEI具有成本低、毒性低, 且保存方便的優(yōu)點, 其滅活機制是, 通過烷化病毒核酸中的鳥嘌呤和腺嘌呤達到破壞該核酸并阻止其復(fù)制的效果, 但不損壞病毒表面蛋白, 也不破壞抗原蛋白空間結(jié)構(gòu), 病毒的抗原決定位置也不受影響(Mudasser, 2006)。并且, 利用BEI進行滅活時, 最終會加入硫代硫酸鈉中和, 從而消除滅活劑的殘留, 進一步保證了疫苗的安全性(Mondal, 2005), 至今未有因BEI殘留引起中毒事件的發(fā)生(Tang, 2016)。因此, 本研究最終選取了BEI作為CyHV-2疫苗制備的滅活劑。

3.3 不同佐劑對疫苗免疫效果影響的分析

在疫苗佐劑的篩選過程中, 選取的4種常用佐劑中, IMS1312、鋁膠和納米佐劑都表現(xiàn)出了較好的刺激免疫保護性的作用, 其中水佐劑IMS1312制備的滅活苗免疫組, 表現(xiàn)出了最高的免疫保護率。IMS1312與水互溶, 制備的疫苗對機體的刺激更小, 并且該水佐劑中含有緩釋劑, 能讓疫苗的免疫效果更加持久。以BEI作為滅活劑, IMS1312為佐劑制備的滅活疫苗, 免疫鯽魚后, 在第4周獲得了80%的免疫保護率, 在第5周就可獲得100%的免疫保護率, 在免疫保護率上遠高于已報道的CyHV-2滅活疫苗。

4 結(jié)論

在CyHV-2滅活疫苗制備過程中, 通過對病毒濃度、滅活劑濃度、滅活溫度、滅活時間和佐劑種類的比較分析, 結(jié)果表明, 采用BEI滅活CyHV-2病毒株CNDF-TB2015, 以水佐劑IMS1312進行乳化獲得的終濃度為108.3TCID50/mL的CyHV-2滅活疫苗, 免疫鯽魚28 d后可獲得80%的免疫保護率, 免疫35 d后可獲得100%的免疫保護率, 具有良好的應(yīng)用前景。

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PREPARATION AND EFFICACY OF INACTIVATED VACCINE AGAINST CYPRINID HERPESVIRUS-2

PAN Xiao-Yi1, LIN Ling-Yun1, ZHU Yue2, YAO Jia-Yun1, YIN Wen-Lin1, LIU Yi-Han1, CHEN Fan3, SHEN Jin-Yu1, 2

(1. Ministry of Agriculture and rural areas Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China; 2. School of Fishery, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 3. Hangzhou Centre for Agricultural Technology Extension, Hangzhou 310001, China)

Herpesviral haematopoietic necrosis (HVHN) is a viral disease of crucian carp caused by Cyprinid herpesvirus-2 (CyHV-2), which causes huge losses on aquaculture in China. To prevent from the outbreak of HVHN, the inactivated vaccine was developed using vaccine strain CNDF-TB2015 and the immune efficacy was assessed. The CyHV-2 culture showed that the titer of virus cultured with CSC cells reached 1010TCID50/mL, and the challenge model test showed the dose of 4×107TCID50/ind could cause 100% mortality in crucian carp within 14 d post injection with the CyHV-2 CNDF-TB2015. The inactivated vaccine preparation test showed that the optimal inactivation condition for CyHV-2 at 108.3TCID50/mL was 10 mmol/L BEI at 37 °C for 72 h and the best adjuvant was IMS1312. The minimum immune dose was 8×106TCID50/ind, and the optimal immune dose was 4×107TCID50/ind. The protection rate reached 80% in 4 weeks and 100% in 5 weeks after immunization with dose of 4×107TCID50/ind. This study presents that the inactivated CNDF-TB2015 strain of CyHV-2 could serve as a potential vaccine candidate to prevent the prevalence of HVHN, and provides a reference for the preparation of other inactivated viral vaccines for fish in aquaculture.

CyHV-2; HVHN; inactivated vaccine; immune efficacy

S942.5

10.11693/hyhz20211200329

* 浙江省重點研發(fā)計劃, 2019C02058號; 浙江省科研院所扶持專項, 2021YSZX001號。潘曉藝, 研究員, E-mail: panxiaoyi@163.com

沈錦玉, E-mail: sjinyu@126.com; 陳 凡, E-mail: chenfan101@163.com

2021-12-16,

2022-01-22