黃衛(wèi)東，梁建鋒，彭 鋒，桑 文，陳曉勝，王興民*

(1.廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物防治教育部工程技術(shù)研究中心，廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510640)

小圓胸小蠹EuwallaceafornicatusEichhoff,1868隸屬于鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae小蠹亞科Scolytinae方胸小蠹屬Euwallacea(Smithetal.,2019)。該蟲在我國(guó)分布廣泛，主要分布于福建、海南、廣東、廣西、臺(tái)灣、四川、云南、貴州等地，國(guó)外則分布于東南亞、澳洲、美洲的23個(gè)國(guó)家和地區(qū)(Rabagliaetal.,2006;Hulcretal.,2007;何華和伍蘇然,2016)。小圓胸小蠹是一種國(guó)際性的重大林木害蟲，也是近年國(guó)內(nèi)外爆發(fā)成災(zāi)的重大蛀干害蟲之一，其寄主植物十分廣泛，在全球范圍內(nèi)包括63科342種(Cooperbandetal.,2016;李巧等,2018)。小圓胸小蠹主要通過蟲、菌結(jié)合來危害寄主植物，成蟲在寄主植物體內(nèi)羽化后，即開始鉆蛀到新寄主植物枝干內(nèi)進(jìn)行產(chǎn)卵。在成蟲鉆蛀的過程中，其體表攜帶的真菌孢子散落在蛀道內(nèi)，并開始生長(zhǎng)。菌絲的過度生長(zhǎng)會(huì)阻塞寄主植物的維管束，影響樹體水分傳輸，與該蟲共同危害樹木(Walgama,2012;何華和伍蘇然,2016;李巧等,2018)。

對(duì)害蟲進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地鑒定是實(shí)施害蟲防治的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。目前，對(duì)于農(nóng)業(yè)害蟲的鑒定大都采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，但昆蟲形態(tài)學(xué)鑒定主要是以成蟲為研究對(duì)象，而昆蟲的卵、幼蟲和蛹的形態(tài)特征很難辨認(rèn)。因此，利用以分子生物學(xué)手段為基礎(chǔ)的DNA條形碼技術(shù)對(duì)害蟲進(jìn)行分子鑒定，能夠在很大程度上彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定中的不足。Hebert等(2003)首次提出DNA條形碼的概念，即利用線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I,COI)約658 bp的分子片段對(duì)物種進(jìn)行快速鑒定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于象甲科昆蟲的新種描述和物種鑒定等領(lǐng)域，并展現(xiàn)出了極大的應(yīng)用潛力(Skuhrovecetal.,2018;Cognatoetal.,2020)。除序列COI外，在鞘翅目昆蟲DNA條形碼研究中涉及的分子片段還包括核基因的28S rDNA(28S)、18S rDNA(18S)、延長(zhǎng)因子EF-1α等，線粒體基因的16S rDNA(16S)、12S rDNA(12S)、COII等(張媛等,2011)。

多重PCR(multiplex PCR)是指在一次PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對(duì)引物，從而產(chǎn)生多條目的片段的技術(shù)，最早由Chamberlain等(1988)提出。目前，多重PCR技術(shù)主要應(yīng)用于病原微生物的快速檢測(cè)：如Potrykus等(2014)利用多重PCR成功檢測(cè)了歐洲馬鈴薯SolanumtuberosumL.上侵染的Pectobacterium病原菌；Kim等(2015)則利用多重PCR成功檢測(cè)了感染人類的5種Vibrio病原菌。該技術(shù)目前也被應(yīng)用于節(jié)肢動(dòng)物物種的鑒定中，如王彥坤等(2020)利用COI和16S的通用引物結(jié)合雙重PCR技術(shù)對(duì)3綱8目14科的14種節(jié)肢動(dòng)物物種進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示雙重PCR技術(shù)不僅可以保證物種鑒定的高準(zhǔn)確率，還可以明顯減少時(shí)間與DNA樣本量的消耗。然而，關(guān)于使用多重PCR技術(shù)(即在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增3個(gè)或3個(gè)以上的分子標(biāo)記)對(duì)昆蟲進(jìn)行快速鑒定仍未見報(bào)道，其可行性需要進(jìn)一步探究。

本研究選擇在鞘翅目分子鑒定中常用的COI、16S和28S三個(gè)分子片段，利用多重PCR的方法開展小圓胸小蠹的分子鑒定。目的在于：一方面探究多重PCR在昆蟲分子鑒定中的可行性，另一方面建立小圓胸小蠹的分子鑒定方法，以期為開展小圓胸小蠹的有效、準(zhǔn)確鑒定及綜合防治等提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

小圓胸小蠹成蟲樣本采自于廣東省潮州市潮安區(qū)鳳凰鎮(zhèn)(緯度:23.851108;經(jīng)度:116.632647;海拔:539.32 m)。田間采集后，至于無水乙醇中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室至于-20℃低溫貯存?zhèn)溆?。成蟲的形態(tài)鑒定主要依據(jù)Gomez等(2018)和Smith等(2019)的文獻(xiàn)描述。

1.2 基因組DNA的提取

血液/組織/細(xì)胞基因組織提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)用于目標(biāo)昆蟲DNA的提取。選擇小圓胸小蠹后足組織用于DNA的提取，詳細(xì)的提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行。提取后的DNA至于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

試驗(yàn)設(shè)計(jì)了4組多重PCR體系，(1)COI+28S+16S；(2)COI+16S；(3)COI+28S；(4)16S+28S；并且分別擴(kuò)增了28S、16S和COI的單個(gè)片段。引物序列信息和參考文獻(xiàn)見表1。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

PCR擴(kuò)增體系為50 μL：PCR Mix 24 μL(TransGen Biotech,Beijing)，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，然后使用無菌水補(bǔ)充至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸5 min。最后將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色后，在紫外燈下照射，對(duì)符合目的片段長(zhǎng)度的產(chǎn)物進(jìn)行回收，并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 序列分析

在軟件Geneious 7.1.4(Kearseetal.,2012)中將測(cè)序獲得的基因序列進(jìn)行拼接和人工校準(zhǔn)，去除兩端引物。然后將拼接完成的序列輸出文件格式為FASTA，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST序列同源性分析，以確認(rèn)目的片段被擴(kuò)增。使用軟件MEGA 7(Kumaretal.,2016)分別統(tǒng)計(jì)了小圓胸小蠹COI、16S和28S的堿基組成。為了計(jì)算種間的遺傳距離，本研究從數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了部分小圓胸小蠹和其它方胸小蠹屬的分子序列，并利用MUSLE(Edgar,2004)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，然后使用MEGA 7分析各種間的遺傳距離(表2)。由于本研究擴(kuò)增的小圓胸小蠹的28S片段與數(shù)據(jù)庫(kù)中小圓胸小蠹的28S片段不屬于同一區(qū)域，因此本研究中28S的擴(kuò)增僅用于探究多重PCR的可行性而不用于后續(xù)的遺傳距離計(jì)算和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

表2 本研究所用到的序列信息Table 2 Information of sequences used in this study

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

本研究分別基于單個(gè)分子片段使用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)和最大似然法(Maximum likelihood,ML)用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。NJ樹的構(gòu)建實(shí)施于MEGA 7中，基于K2P(Kimura-2-parameter)雙參數(shù)模型。ML樹的構(gòu)建實(shí)施于RAxML 8.2.8(Stamatakis,2014)中，同時(shí)使用自舉值重復(fù)1 000次以檢驗(yàn)各節(jié)點(diǎn)的可信度。在ML樹構(gòu)建之前，使用Modeltest(Posada and Crandall,1998)分別推算COI和16S數(shù)據(jù)集的最佳替換模型。ML分析在CIPRES Science Gateway上運(yùn)行(Milleretal.,2010)。

2 結(jié)果與分析

2.1 通用引物的多重PCR檢測(cè)

基于通用引物的小圓胸小蠹的多重PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：在包含COI、16S和28S的反應(yīng)體系1中產(chǎn)生3條目的條帶，但COI條帶較弱。在包含COI和16S的體系2中，COI條帶也較弱，16S則產(chǎn)生明亮條帶。對(duì)比包含COI和28S的體系3中，COI和28S均產(chǎn)生明亮條帶。在包含16S和28S的反應(yīng)體系4中，也產(chǎn)生了2條明亮條帶。此外，基于單個(gè)PCR反應(yīng)的COI、16S和28S均產(chǎn)生了符合目的片段大小的明亮條帶(圖1)。

圖1 小圓胸小蠹成蟲生態(tài)照Fig.1 Ecological photograph of the adults of Euwallacea fornicatus

2.2 基因序列分析

將序列拼接完成、去除兩端引物后，擴(kuò)增得到小圓胸小蠹的COI序列長(zhǎng)度為658 bp，16S序列長(zhǎng)度為302 bp，28S序列長(zhǎng)度為908 bp。在GenBank中進(jìn)行BLAST檢索顯示所獲得序列為目的序列。在COI的所有位點(diǎn)中，堿基A、T、G和C的含量分別為33.0%、33.1%、14.9%和19.0%，且A+T含量高于G+C含量。在16S的所有位點(diǎn)中，堿基A、T、G和C的含量分別為37.4%、39.0%、15.1%和8.5%，且A+T含量高于G+C含量。在28S的所有位點(diǎn)中，堿基A、T、G和C的含量分別為24.3%、21.8%、29.9%和24.0%，而A+T含量稍低于G+C含量。本研究新測(cè)序的分子序列均已上傳至GenBank中；COI登錄號(hào)為MT946291，16S登錄號(hào)為MT946906，28S登錄號(hào)為MT940909。

2.3 遺傳距離分析

基于COI的遺傳距離分析顯示本研究擴(kuò)增獲取的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中小圓胸小蠹的COI序列的遺傳距離為0.009～0.014；而與其它方胸小蠹屬的遺傳距離為0.104～0.162(表3)?；?6S的遺傳距離分析顯示本研究擴(kuò)增獲取的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中小圓胸小蠹的16S序列的遺傳距離為0.000～0.007；而與其它方胸小蠹屬的遺傳距離為0.081～0.114(表4)。

表3 基于COI基因的小圓胸小蠹與其它小蠹的遺傳距離分析Table 3 Genetic distance between Euwallacea fornicatus and other species of Euwallacea based on COI gene

表4 基于16S基因的小圓胸小蠹與其它小蠹的遺傳距離分析Table 4 Genetic distance between Euwallacea fornicatus and other species of Euwallacea based on 16S gene

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,無論是基于何種建樹方法還是不同的分子片段，本研究擴(kuò)增的小圓胸小蠹的分子序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中小圓胸小蠹的分子序列均聚為一支，且得到較高的支持率(圖2,圖3)。此外，小圓胸小蠹與其它方胸小蠹屬的物種區(qū)分明顯，表明COI和16S分子序列可作為小圓胸小蠹分子鑒定的依據(jù)。

圖2 小圓胸小蠹的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification result of Euwallacea fornicatus with multiplex PCR注：1，Marker 2000；2，COI+16S+28S；3，COI+16S；4，COI+28S；5，16S+28S；6，COI；7，16S；8，28S。

圖3 基于COI基因的小圓胸小蠹與其它小蠹構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Euwallacea fornicatus and other species of Euwallacea based on COI gene注：圖中節(jié)點(diǎn)旁邊為自舉值(左：NJ；右：ML)，紅色方形表示本研究中生成的序列。Note:Numbers at nodes represented bootstrap value for NJ (left) and ML (right).Red rectangle represented this sequence was new generated in this study.

3 結(jié)論與討論

DNA條形碼鑒定的前提是DNA條形碼間隙(barcode gap)的存在，即種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離(Hebertetal.,2003;2004;Puillandreetal.,2012;Taylor and Harris,2012)。Hebert等(2004)指出種間遺傳距離分化至少應(yīng)大于種內(nèi)遺傳分化的10倍；然而，后續(xù)的研究表明遺傳距離閾值對(duì)于不同類群來說是不一致的(Havermansetal.,2011;Songetal.,2018)。例如，2%～3%被表明適用于膜翅目、蜉蝣目、襀翅目和毛翅目部分類群的種類鑒定(Monaghanetal.,2005;Zhouetal.,2010;Webbetal.,2012;Schmidtetal.,2015)；3%～5%適用于一些雙翅目和鞘翅目物種的種類鑒定(Linetal.,2015;Nzeluetal.,2015;Huangetal.,2020)；而6%～8%則適用于毛翅目紋石蛾科Hydropsychidae的物種鑒定(Paulsetal.,2010)。在本研究中，基于COI基因的遺傳距離分析表明本研究擴(kuò)增的小圓胸小蠹的DNA條形碼序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列差異小于2%，而和其它方胸小蠹屬的序列差異則為10.4%～16.2%。同樣地，在基于16S基因的遺傳距離分析中也揭示了本研究擴(kuò)增的小圓胸小蠹的16S序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中小圓胸小蠹的16S序列具有極高的相似性。目前，一些研究表明基于COI單個(gè)分子的物種鑒定結(jié)果經(jīng)常被一些偏差所影響，包括假基因的存在、不完全譜系選擇和基因滲透(Funk and Omland,2003;Dupuisetal.,2012;Talaveraetal.,2013;Huangetal.,2020)。因此，為了增加分子鑒定的可信度，其它的基因片段，如12S、16S、18S和28S被提出作為互補(bǔ)的分子片段用于物種鑒定(Lerayetal.,2013;Elbrechtetal.,2016)。本研究中，利用多個(gè)分子片段同時(shí)用于小圓胸小蠹的分子鑒定，遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明COI和16S分子片段可用于小圓胸小蠹的快速、準(zhǔn)確鑒定,同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了使用多個(gè)分子片段在準(zhǔn)確鑒定物種方面的重要性。

圖4 基于16S基因的小圓胸小蠹與其它小蠹構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Euwallacea fornicatus and other species of Euwallacea based on 16S gene注：圖中節(jié)點(diǎn)旁邊為自舉值(左：NJ；右：ML)，紅色方形表示本研究中生成的序列。Note:Numbers at nodes represented bootstrap value for NJ (left) and ML (right).Red rectangle represented this sequence was new generated in this study.

在本研究中，首次使用3對(duì)通用引物來開展小圓胸小蠹的分子鑒定，并探究多重PCR在昆蟲中應(yīng)用的可行性。結(jié)果表明，在設(shè)置的4個(gè)多重PCR反應(yīng)體系中均可以產(chǎn)生符合目的片段大小的單一條帶。但在體系1和體系2中，COI產(chǎn)生的條帶則較暗，通過比較體系3和體系4中的引物配置，推測(cè)由于體系1和體系2中包含了16S的擴(kuò)增引物，從而影響了COI的擴(kuò)增效果。引物的選擇與優(yōu)化被認(rèn)為是影響多重PCR效果的最主要因素(Elnifroetal.,2000)。由于COI和16S同屬于線粒體基因，且大多數(shù)昆蟲線粒體基因組排列與昆蟲線粒體基因組原始排列順序一致(Cameron,2014)，因此這兩個(gè)片段的引物可能會(huì)發(fā)生相互干擾。由于本研究中的多重PCR反應(yīng)體系為50 μL，使得仍可以通過膠回收獲取足量的COI擴(kuò)增產(chǎn)物以滿足測(cè)序的要求。為解決在多重PCR反應(yīng)中部分條帶較弱的問題，一些研究提出在反應(yīng)體系中增加對(duì)應(yīng)引物的量，可以有效的增加引物與模板結(jié)合的概率(Elnifroetal.,2000;郝少東等,2015)。

本研究證實(shí)了多重PCR應(yīng)用于昆蟲分子鑒定的可行性。在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中產(chǎn)生的多條分子序列，不僅提高了物種鑒定的準(zhǔn)確率，而且節(jié)省了PCR反應(yīng)所需時(shí)間和模板的消耗；在樣品材料十分珍貴的情況下，這兩點(diǎn)顯得尤為重要。此外，通過COI、16S和28S提供的序列信息和多重PCR方法，建立了小圓胸小蠹的分子鑒定方法，為開展小圓胸小蠹的準(zhǔn)確鑒定及綜合防治等奠定了基礎(chǔ)?？紤]到當(dāng)前數(shù)據(jù)庫(kù)豐富的分子序列和引物設(shè)計(jì)的便捷，建議在研究不同類群時(shí)挑選合適的基因和不同的引物組合，采用多重PCR開展物種的鑒定工作，以增加物種鑒定的準(zhǔn)確性。