楊 飛 ,覃 果 ,黃翠琴
(1.西藏農牧學院動物科學學院,林芝 860000;2.龍巖學院生命科學學院 福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室,龍巖 364012)
目前,我國豬寄生蟲病研究呈現(xiàn)上升的趨勢,諸多研究表明寄生蟲病是威脅豬養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一,特別是腸道寄生蟲病。腸道寄生蟲又叫腸道內寄生蟲,主要寄生于盲腸和結腸,豬感染腸道寄生蟲后伴隨腹瀉、腹痛、厭食、結膜炎、腸炎等癥狀[1],導致患畜體型消瘦、貧血、脫水,
甚至到后期出現(xiàn)呼吸神經癥狀,甚至導致病患死亡[2]。寄生于豬腸道的寄生蟲主要有原蟲、絳蟲、線蟲和吸蟲。目前大部分豬場的驅蟲方案只是針對線蟲類寄生蟲,對原蟲類寄生蟲由于其生活史很短,難于完全控制,其中豬結腸小袋纖毛蟲(B.coli)感染的癥狀不是很明顯,也是人結腸小袋纖毛蟲病的主要感染來源[3]。豬囊等孢球蟲(C.suis)感染常見于母豬與仔豬,引發(fā)哺乳仔豬腸炎和腹瀉的流行,造成了全球范圍豬產業(yè)經濟損失嚴重[4]。
本次研究以龍巖部分豬場為對象,采用Mini-Flotac檢測法對不同規(guī)模、不同年齡階段的豬糞便進行寄生蟲蟲卵或卵囊檢測,分析其感染情況,以及流行特點,以期為有效防控豬場腸道寄生蟲病提供科學依據(jù)。
1.1 樣品采集與保存 分別在龍巖新羅區(qū)、長汀、上杭、漳平地區(qū)(豬場1、豬場2、豬場3、豬場4)共采集1029份新鮮糞樣,其中豬場1、2是規(guī)?;i場,豬場3、4是中小型豬場。每個豬場按種公豬、后備母豬、懷孕母豬、哺乳母豬、哺乳仔豬、保育豬隨機進行糞便采集,每份約30 g,置于一次性塑料袋中,并標注豬的不同年齡階段、收集地點及日期。將樣品分為兩份,一份直接存放于4℃,用于蟲卵檢測,一份純化后用2.5%重鉻酸鉀溶液進行豬囊等孢球蟲卵囊體外培養(yǎng)至孢子化。
1.2 主要材料及試劑 載破片、Fill-Flotac、Mini-Flota(Univerity of naples federico II, made in Italy)、飽和NaCl溶液、蔗糖梯度溶液、2.5%重鉻酸鉀溶液,以上試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。
1.3 直接涂片檢測糞便寄生蟲 取普通水1~2滴放于載玻片上,通過牙簽挑取芝麻大小的被檢糞便與之混勻,剔除粗糞渣,加上蓋玻片鏡檢蟲卵,若能在糞樣中檢測到蟲卵或者卵囊,可判斷該豬感染寄生蟲。觀察蟲卵或卵囊的形狀及內部結構,并測量其大小,根據(jù)相關資料對蟲卵/卵囊加以鑒定。
1.4 Mini-Flotac檢測糞便寄生蟲 由Fill-Flotac和Mini-Flota裝置構成。Fill-Flotac裝置包括蓋子與刻度容器瓶兩個部件,蓋子部分由收集器(均化器桿)和過濾器組成;Mini-Flotac裝置包括基座和讀取盤兩個物理部件,以及旋轉的鑰匙和顯微鏡適配器兩個附件。依照www.flotac.unina.it網站上的操作說明進行組件裝配,樣品處理及實驗操作。對兩個浮選室的卵囊數(shù)量進行計數(shù),采用公式Oocysts per gramme /Eggs per gram of faeces(OPG/EPG)=兩個浮選室的卵囊個數(shù)之和×150,即可得到每克糞便中的卵囊數(shù)。
1.5 孢子化卵囊的培養(yǎng) 將糞便中檢測到的豬囊等孢球蟲卵囊,用飽和NaCl溶液進行單卵囊分離,蔗糖濃度梯度溶液純化后,將未孢子化卵囊在2.5%重鉻酸鉀溶液中于28℃恒溫培養(yǎng)箱進行體外培養(yǎng)48 h,期間每隔6 h取出部分進行顯微鏡觀察其孢子化的形態(tài),測量豬囊等孢球蟲的卵囊、胚孢子、孢子囊的大小及卵囊長度與卵囊寬度等,結合卵囊形態(tài)、孢子囊、子孢子的形態(tài)特征與個數(shù),對其進行形態(tài)學鑒定。
2.1 蟲卵形態(tài)學觀察結果 蟲卵形態(tài)學觀察結果表明,在100倍觀察到豬結腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體滋養(yǎng)體形態(tài)呈橢圓形,清晰透明,有輕微的活動,其大小不一,全身覆有纖毛;在400倍觀察到豬結腸小袋纖毛蟲包囊,包囊近似圓形或者橢圓形,包囊由兩層囊膜,一個大核一個小核構成,呈現(xiàn)淡黃色(圖1)。
圖1 豬場糞便中的部分寄生蟲蟲卵Fig.1 Some parasite eggs in pig manure
2.2 卵囊形態(tài)學觀察結果 在400倍觀察到豬囊等孢球蟲未孢子化卵囊,卵囊呈球形或者亞球形,具有光滑的雙層壁,囊里面存在的殘渣由大小不一顆粒組成;將未孢子化的卵囊用飽和NaCl溶液分離,用蔗糖濃度梯度溶液純化后,經2.5%重鉻酸鉀培養(yǎng)后的觀察豬囊等孢球蟲孢子化卵囊,該卵囊含有兩個孢子囊,每個孢子囊含有四個子孢子,卵囊的每一個孢子囊可見兩個子孢子和一個大圓形殘體(圖2)。
圖2 豬場糞便中的部分寄生蟲蟲卵卵囊Fig.2 Egg sacs of some parasites in pig manure
2.3 不同豬場感染情況 Mini-Flotac漂浮法檢測結果顯示,4個豬場共1029份新鮮糞便樣品,其中有457份為陽性樣品,總的感染率為44.41.%,最低感染強度(OPG值)為150,最高感染強度達7800,表明福建龍巖地區(qū)部分豬場腸道寄生蟲感染嚴重。其中規(guī)?;i場感染率為41.83%(302/722),普通豬場感染率為50.49%(155/307);結腸小袋纖毛蟲的總感染率為33.43%(344/1029),最高OPG值為7800,囊等孢球蟲的總感染率為10.98%(113/1029),最高OPG值為5550,其中豬場1、4只感染了結腸小袋纖毛蟲,豬場2、3主要為豬結腸小袋纖毛蟲與豬囊等孢球蟲的混合感染。各豬場腸道寄生蟲感染率和感染強度見表1。
表1 不同豬場豬腸道寄生蟲感染率及感染強度Table 1 Intestinal parasite infection rate and infection intensity of pigs in different pig farms
2.4不同年齡階段感染情況 根據(jù)不同年齡階段豬腸道寄生蟲感染率及感染強度結果顯示,6個年齡階段共1029份新鮮糞便樣品,每個年齡階段豬結腸小袋纖毛蟲均有感染,最高感染率為51.64%,最低感染強度(OPG值)為 150,最高達 7800;其中種公豬感染率為51.64%(63/122),最高OPG值3450;后備母豬感染率為20.00%(21/105),最高OPG值2550;懷孕母豬感染率為50.00%(193/386),最高OPG值為5400;哺乳母豬感染率為43.28%(29/67),最高OPG值為7800;哺乳仔豬感染率為10.71%(9/84),最高OPG值為600;保育豬感染率為10.94%(29/265),最高OPG值為3750。懷孕母豬、哺乳仔豬和保育豬為豬結腸小袋纖毛蟲與豬囊等孢球蟲的混合感染,其中哺乳仔豬囊等孢球蟲感染率最高為50.00%(42/84),感染強度(OPG值)最高達 5500;保育豬感染率為18.87%(50/265),最高OPG值為4200;懷孕母豬感染率為5.44%(21/386),最高OPG值為1650。
目前常用的腸道寄生蟲檢測計數(shù)方法,如McMaster 技術[5]已廣泛運用于獸醫(yī)傳染病學中腸道寄生蟲的檢測,李翔程[6]在四種糞便檢查方法,報道中顯示McMaster 具有較高的準確性,是一種較為理想的檢測方法。目前一種新的檢測方法 Mini-Flotac[7]被應用于糞便中寄生蟲檢測。Barda等[8]評估最近開發(fā)的Mini-Flotac方法,并與目前更廣泛使用的技術進行比較,以診斷不同環(huán)境中的腸道寄生蟲感染。Mini-Flotac與McMaster 進行比較發(fā)現(xiàn),麥克馬斯特氏計數(shù)板的厚度為6.5 mm,但Mini-Flotac最大厚度僅為為5.5 mm,彌補了常規(guī)計數(shù)板不能再高倍顯微鏡觀察下的缺點;Mini-Flotac檢測方法的優(yōu)點在于時間上更加的高效,操作流程更加的便捷,對蟲卵的鑒定也更加的準確,其材質為聚碳酸酯無定形熱塑性塑料,不易將其打碎造成不必要的損失。Mini-Flotac檢測法在封閉系統(tǒng)中運行,使實驗員免受由于操作失誤造成的危害。
本研究采用Mini-Flotac對福建龍巖市部分豬場進行糞便漂浮法檢查,檢測結果顯示1029份新鮮糞便樣品,其中有457份為陽性樣品,總的感染率為44.41%,最低感染強度(OPG值)為150,最高感染強度達7800。檢測結果顯示,規(guī)?;i場感染率為41.83%(302/722),中小型豬場感染率為50.49%(155/307);豬結腸小袋纖毛蟲的總感染率為33.43%(344/1029),最高OPG值為7800, 豬囊等孢球蟲的總感染率為10.98%(113/1029),表明腸道寄生蟲的感染在龍巖地區(qū)不存在地區(qū)上的差異,與豬場的養(yǎng)殖規(guī)模關系不大。這一結論與翁亞彪等[9]對廣東集約化豬結腸小袋纖毛蟲感染情況調查得出的結論一致。根據(jù)不同年齡階段感染率及結果顯示,每個年齡階段結腸小袋纖毛蟲均有感染,感染率大小依次為公豬51.64%>懷孕母豬50.00%>哺乳母豬43.28%>后備母豬20.00%>保育豬10.94%>哺乳仔豬10.71%;唐禮德等[10]湖南省規(guī)?;i場結腸小袋纖毛蟲感染情況調查,結果顯示12個豬場全部都檢測到了結腸小袋纖毛蟲,李巧燕等[11]對規(guī)?;i場結腸小袋纖毛蟲感染情況調查,結果顯示結腸小袋纖毛蟲感染與豬年齡階段差異性不明顯,示哺乳仔豬豬囊等孢球蟲感染率最高為50.00%,感染強度最高
達5500,保育豬感染率為18.87%,懷孕母豬感染率為5.44%。這些數(shù)據(jù)表明,豬囊等孢球蟲主要感染懷孕母豬以及幼齡仔豬。
表2 不同年齡階段豬腸道寄生蟲感染率及感染強度Table 2 intestinal parasite infection rate and infection intensity of pigs at different ages
本次檢測結果提示福建龍巖市地區(qū)部分豬場豬結腸小袋纖毛蟲和豬囊等孢球蟲的感染情況。豬結腸小袋纖毛蟲發(fā)生于各個年齡階段豬種,糞便一經發(fā)現(xiàn)大量滋養(yǎng)體需立刻投藥治療;豬囊等孢球蟲主要發(fā)生于母豬與哺乳仔豬這一階段豬種;可采用2.5%妥曲珠利、磺胺類藥等藥物進行驅蟲;同時加強飼養(yǎng)管理,加強豬場圈舍的消毒,及時處理豬產生的糞便,防止投喂的食物接觸糞便,做好防鼠措施,容易導致寄生蟲的傳播和感染[12-14]。此外,本次調查結果表明,豬結腸小袋纖毛蟲存在人獸共患風險,同時在飼養(yǎng)過程中應當注意防范,注意個人衛(wèi)生,防止食源性污染是降低感染的有效途徑,切斷所有傳播媒介以及存在的安全隱患。