狄 荻，王 欣，李晨曦，李宗杰，李蓓蓓，劉 珂，邵東華，邱亞峰，魏建超，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，是黃病毒屬的成員之一，其基因組全長(zhǎng)約為11 kb[1]。乙型腦炎（Japanese encephalitis, JE）是由JEV引起的一種蚊媒傳染病，主要經(jīng)三帶喙庫蚊傳播，是一種重要的人獸共患病，被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）列為重點(diǎn)控制的傳染病之一[2]。JE以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性炎癥及血腦屏障的破壞為主要特征，可以導(dǎo)致25%的死亡率，并且15%～30%的患者會(huì)伴隨嚴(yán)重的預(yù)后不良[3-5]。在自然界中，豬和水禽是JEV的主要擴(kuò)增宿主，人類和馬是終末宿主，包括鴨子在內(nèi)的水禽在感染后可以產(chǎn)生高水平的病毒血癥，并通過蚊子等節(jié)肢動(dòng)物將JEV傳播給人類[6-8]。有研究表明，JEV同時(shí)對(duì)雛鴨具有潛在的致病性[9]。本研究旨在檢測(cè)規(guī)?；B(yǎng)殖鴨群中JEV的感染情況，為JE的防控提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 病料與血清學(xué)樣品 所有樣品均于2019年10月從中國江蘇省中部地區(qū)某種鴨場(chǎng)采集得到，其中產(chǎn)蛋種鴨血清樣本20份以及抗凝血樣本各20份，不明原因死亡的1～3日齡雛鴨病料19份，所有樣品保存在-80℃冰箱待檢測(cè)。該養(yǎng)鴨場(chǎng)并未使用過任何JEV疫苗及相關(guān)產(chǎn)品。

1.2 主要試劑及引物 JEV酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司。陰性鴨血清和陽性鴨血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；2×LATaqPCR Master Mix、Prime Script RT Master Mix、Premix ExTaq?（Probe qPCR）、ROX Reference Dye購自TaKaRa公司；DL2000 DNA marker購自寶生生物（大連）工程有限公司。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）引物根據(jù)GenBank中JEV（MH753127）高度保守的E基因片段設(shè)計(jì)，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)約475 bp，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列JEV-F：5'-TTGGTCGCTCCGGCTTACA-3'；JEV-R：5'-GGTTTTCCGAGGTAGTGGTTC-3'；E基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank中JEV（MH753127）高度保守的E基因片段設(shè)計(jì)，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)約1500 bp，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，JEV-E-F：5'-TGYTGGTCGCTCCGGCTTA-3'；JEV-E-R：5'-GATGTCAATGGCACATCCAGT-3'[10]。熒光定量RT-PCR引物JEV-P-F/R、JEV I/III型探針由上海華津生物技術(shù)公司合成。

1.3 血清樣品JEV抗體檢測(cè) 采用ELISA對(duì)20份產(chǎn)蛋種鴨血清進(jìn)行JEV特異性抗體檢測(cè)，健康SPF鴨血清為陰性對(duì)照，JEV感染鴨血清為陽性對(duì)照，每個(gè)樣本設(shè)一組平行重復(fù)檢測(cè)。方法如下：使用血清稀釋液以體積比1∶40稀釋待檢血清和對(duì)照血清；根據(jù)樣品數(shù)量取用JEV抗原包被板板條，在所需孔中加入200 μL沖洗液，靜置3 min，倒出沖洗液后在吸水紙上輕輕拍干；在每個(gè)孔中對(duì)應(yīng)加入100 μL對(duì)照血清和待檢血清，在37℃恒溫箱中孵育30 min，棄去孔中溶液，加入200 μL沖洗液，靜置3 min，倒出沖洗液后在吸水紙上輕輕拍干，重復(fù)洗滌5次；每孔加入稀釋后的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的羊抗鴨IgG，37℃孵育30 min，棄去孔中溶液并按上述方法洗滌5次；每孔加入50 μL顯色液A和顯色液B，室溫避光靜置10 min；待顯色完成后加入終止液，在630 nm處測(cè)量光密度OD值；根據(jù)S/P公式計(jì)算樣品陽性率。

1.4 樣品中核酸提取 病死雛鴨解剖后取心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟及腦組織，加入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）后研磨混勻，取組織勻漿液備用；抗凝血每份取100 μL備用。所有樣品加入適量的TRIzol，按照說明書提取病毒總RNA，使用ddH2O溶解。反轉(zhuǎn)錄體系如下：RNA模板1 μL，7 μL ddH20，Prime Script RT Master Mix 2 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃冰箱待檢。

1.5 RT-PCR檢測(cè)JEV基因 采用RT-PCR對(duì)組織樣品和全血樣品進(jìn)行JEV的E基因檢測(cè)，擴(kuò)增體系為：2×LATaqPCR Master Mix 10 μL，JEV-F/R各0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA 2 μL。程序設(shè)定：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存，使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，挑選出JEV樣品進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.6 全長(zhǎng)E基因的擴(kuò)增及測(cè)序 對(duì)陽性樣品進(jìn)行JEVE基因全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2×LATaqPCR Master Mix 20 μL，JEV-F/R各0.2 μL，ddH2O 17.6 μL，2 μL cDNA。程序設(shè)定：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存，使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析上述RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的片段并送上海桑尼公司測(cè)序。

1.7 熒光定量RT-PCR檢測(cè)病毒組織分布 對(duì)9號(hào)陽性雛鴨組織樣品進(jìn)行絕對(duì)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)加樣體系：PremixEx Taq?（Probe qPCR）10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，Primer JEV-P-F 0.4 μL，Primer JEV-P-R 0.2 μL，JEVI/Ⅲ型探針0.3 μL，ddH2O 6.5 μL、cDNA 2 μL。StepOne Software v2.3程序設(shè)定：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火55 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)病毒拷貝數(shù)計(jì)算JEV在不同組織分布。

1.8E基因序列遺傳進(jìn)化分析 將測(cè)序所得結(jié)果與GenBank中JEVE基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析。使用MEGA 6.0軟件對(duì)E基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1000來評(píng)估進(jìn)化樹的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 JEV抗體檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA方法對(duì)20份產(chǎn)蛋種鴨血清樣本進(jìn)行JEV抗體檢測(cè)，測(cè)量OD值，根據(jù)S/P公式計(jì)算樣品陽性率：S/P平均值≥0.21判定為陽性，S/P平均值＜0.21判斷為陰性，結(jié)果見圖1。所檢測(cè)的20份樣品中，有15份為陽性，JEV抗體陽性率為75.0%。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 我們研究發(fā)現(xiàn)，雛鴨實(shí)驗(yàn)性感染JEV后脾臟的病毒載量最高（未發(fā)表結(jié)果），所以本研究首先選擇雛鴨脾臟樣品進(jìn)行JEV檢測(cè)。RTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，JEVE基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后可見約475 bp的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。在所檢測(cè)的19份未知原因死亡雛鴨脾臟中，9號(hào)雛鴨脾臟為陽性，5號(hào)和7號(hào)樣品為弱陽性，其他樣品為陰性（圖1）。此外，JEV感染鴨后，可形成病毒血癥，因此，本研究對(duì)鴨血液樣本進(jìn)行JEV檢測(cè)，在20份產(chǎn)蛋種鴨抗凝血樣本中均未擴(kuò)增到目的片段，表示均為陰性。

圖1 乙型腦炎病毒抗體檢測(cè)OD值Fig.1 OD value of antibody against JEV

對(duì)RT-PCR結(jié)果陽性的9號(hào)雛鴨的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織樣品進(jìn)一步進(jìn)行了絕對(duì)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的被檢組織中都可檢測(cè)到JEVE基因，其中病毒拷貝數(shù)最高的是脾臟組織，其次是肝臟（圖2）。正常對(duì)照雛鴨組織未檢測(cè)到JEVE基因。

圖2 乙型腦炎病毒E基因片段的RT-PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR-amplified part of E gene from JEV

2.3 序列遺傳進(jìn)化分析 選取9號(hào)雛鴨脾臟樣品，采用RT-PCR方法擴(kuò)增全長(zhǎng)E基因，并進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行Blast同源性分析。結(jié)果顯示，擴(kuò)增所得序列與多株JEV基因I型毒株的E基因同源性在95%以上，表明本研究擴(kuò)增得到的JEV序列可確定為JEV基因I型病毒株，命名為JS201910。利用MEGA6.0構(gòu)建擴(kuò)增所得序列JS201910與GenBank下載的不同基因型的參考毒株的E基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，其中FJ495189.1株與JS201910屬于同一分支。

圖3 乙型腦炎病毒在不同組織的分布Fig.3 The distribution of virus in different tissues

3 討論

鳥類是JEV的擴(kuò)增宿主之一，包括鴨子在內(nèi)的水鳥在感染后可攜帶病毒血癥，并通過節(jié)肢動(dòng)物將JEV傳播給人類[7]。鳥類在乙型腦炎的傳播中起著重要的作用，而家禽如雞、鴨等經(jīng)常與人類和蚊子密切接觸[11]；在一些JEV流行地區(qū)，人類生活地附近飼養(yǎng)著大量的雞、鴨，龐大的擴(kuò)增宿主群體為JEV的傳播提供了便利，加劇了JEV傳播的風(fēng)險(xiǎn)[12-13]?？紤]到這種傳播威脅，本研究調(diào)查了鴨群中JEV的感染情況以及是否對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)存在危害，為JEV的防控提供新的思路與見解。

血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，位于江蘇省中部地區(qū)的該養(yǎng)鴨場(chǎng)JEV感染率為75%（15/20）。根據(jù)中國國家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫的2006-2012年中國豬群JEV流行病學(xué)數(shù)據(jù)，在中國18個(gè)省和自治區(qū)的22 343樣本中，JEV平均陽性率為39.4%（8807/22343），JEV的最高陽性率為2010年的59.2%（3286/5548）[14]。在1979年云南省開展的一項(xiàng)研究中顯示JEV在鴨子中的抗體陽性率也達(dá)到了75%[15]。本次調(diào)查結(jié)果反映了在東部沿海地區(qū)的鴨群中同樣存在較高的JEV陽性率，高于豬群，雖然江蘇省內(nèi)JE的發(fā)生已有下降趨勢(shì)，但媒介昆蟲和宿主動(dòng)物仍然存在，傳播條件依舊具備，風(fēng)險(xiǎn)仍舊存在[16-18]。

圖4 基于E基因核酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of E gene

本次研究在病死雛鴨組織中檢出了JEV基因，但未能分離病毒，究其原因，可能是由于病死雛鴨的病料是由鴨場(chǎng)采集，病料未能及時(shí)凍存導(dǎo)致病毒失活。在19份病死雛鴨病料中只檢出了1份陽性和2份弱陽性，我們尚不能據(jù)此判斷JEV對(duì)雛鴨的危害，但前期實(shí)驗(yàn)性感染研究證明，JEV對(duì)雛鴨具有致病性，并可引起雛鴨生長(zhǎng)遲緩和死亡[9]，說明JEV對(duì)禽類養(yǎng)殖存在潛在的威脅。同屬于黃病毒科的西尼羅河病毒（West nile virus, WNV）和坦布蘇病毒（Tambusu virus, TMUV）都對(duì)禽類具有致病性[19-20]，隨著大規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，黃病毒包括JEV對(duì)禽類養(yǎng)殖產(chǎn)生的影響值得重視。

江蘇省中部地區(qū)毗鄰長(zhǎng)江三角人口稠密地區(qū)，氣候地理?xiàng)l件復(fù)雜，是多種自然疫源性疾病的疫源地和流行區(qū)[16]。JE作為一種自然疫源性疾病，宿主繁多[21]，對(duì)人類和動(dòng)物健康威脅巨大。應(yīng)當(dāng)在鴨群等水禽群體中開展對(duì)JEV的長(zhǎng)期密切監(jiān)測(cè)，建立完整的疾病預(yù)防監(jiān)測(cè)體系；同時(shí)在春夏季交替蚊蟲較多的季節(jié)加強(qiáng)防蚊措施，控制和消滅媒介昆蟲，做好JE的防制措施。