李 雪，李旭欣，GiRi B R，劉靜宜，劉軍濤，夏天奇，杜鵬飛，李慧民，李 舜，程國鋒

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

血吸蟲病是由血吸蟲尾蚴感染引起的一種人畜共患寄生蟲病，對宿主產(chǎn)生嚴(yán)重病理性損害，是WHO發(fā)布的六大重點(diǎn)熱帶病之一[1]，也是僅次于瘧疾的全球第二大寄生蟲病[2]。據(jù)估計(jì)，全球有超過2.3億人曾患有血吸蟲病[3]。目前，血吸蟲病的防控主要依賴化學(xué)藥物吡喹酮[4]，單一藥物長期大量使用有可能導(dǎo)致耐藥蟲株的產(chǎn)生。由于血吸蟲的多階段發(fā)育生活史比較復(fù)雜，蟲體誘發(fā)宿主的免疫應(yīng)答機(jī)制以及逃避機(jī)制不甚清晰，使獲得良好保護(hù)效果的血吸蟲病疫苗研究被制約。因此，尋找更有效的疫苗抗原候選分子或許成為研發(fā)抗血吸蟲病疫苗的一種重要途徑。

跨膜蛋白位于生物膜，貫穿膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，連接膜的內(nèi)外環(huán)境，具有介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換等多種重要功能[5]。據(jù)估計(jì)，膜蛋白約在所有編碼蛋白中占30%。目前，在藥物研發(fā)領(lǐng)域約有70%的藥物靶點(diǎn)為膜蛋白[6]。血吸蟲體被直接與宿主相接觸，被視為蟲體與宿主信息交流的重要界面。研究表明位于體被的膜蛋白也是抗血吸蟲疫苗候選的重要分子。開展體被膜蛋白的功能研究對日本血吸蟲疫苗的研發(fā)有益。

本文對日本血吸蟲TEME66P蛋白進(jìn)行了初步探索，利用生物信息學(xué)分析 TMEM66P，并對其編碼cDNA進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，制備了抗血清，并通過Western blot對抗血清的特異性進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1.生物材料 昆明雄性小鼠（8周齡）購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；小鼠通過腹部貼片法感染日本血吸蟲尾蚴，在感染后42 d，通過肝門靜脈灌注法收集蟲體，收集的蟲體置于液氮中保存。

1.2 引物合成和DNA測序 引物合成由上海賽默飛生物有限公司合成；重組質(zhì)粒測序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3 試劑與耗材 異丙醇購自上海旭慶工貿(mào)有限公司；三氯甲烷購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；HRP標(biāo)記小鼠抗His標(biāo)簽抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；RNAiso Plus購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；感受態(tài)細(xì)胞均購自上海少辛生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自擎科生物技術(shù)有限公司；一步法快速克隆試劑盒購自翌圣生物科技有限公司；HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Omega質(zhì)粒小提試劑盒購自上海拜爾生物科技有限公司。

1.4 生物信息學(xué)分析 通過DNAStar軟件查找TMEM66P序列的閱讀框，翻譯為氨基酸，預(yù)測蛋白的大小。利用TMHMM網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析TMEM66P有無跨膜區(qū)。在NCBI網(wǎng)站上利用在線工具Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查找TMEM66P在其他物種中的同源序列，使用ClustalW對TMEM66P及其同源序列進(jìn)行多重序列比對分析[7]，使用MEGA 7.0軟件，通過鄰接法，采用默認(rèn)參數(shù)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8-9]。

1.5 重組蛋白的構(gòu)建、表達(dá)與純化 提取日本血吸蟲的總RNA，采用HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備日本血吸蟲的cDNA。以此cDNA為模板，根據(jù)TMEM66P（GenBank登錄號(hào)：CAX69776.1）的cDNA序列，使用翊圣無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件（http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/）設(shè)計(jì)包含KpnI和HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（F：5'-GACAGCCCAGATCTGGGTAC CATGTTATTATATTTTGTTTTGA-3'；R：5'-TGC TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTATCTCCGAGAT GTACCACCG-3'）。將擴(kuò)增產(chǎn)物與雙酶切的載體通過Hieff Clone?Plus One Step Cloning Kit構(gòu)建重組質(zhì)粒，將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，置于37℃培養(yǎng)，挑單菌落進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序正確的菌液利用FastPure? Plasmid Mini Kit提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)中，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分析。將成功表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行可溶性鑒定，通過切膠法純化蛋白。用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定純化效果。用抗His標(biāo)簽抗體作為一抗進(jìn)行Western blot對重組蛋白進(jìn)行鑒定。

1.6 抗血清的制備 免疫抗原的制備：將蛋白與Montanide ISA 206 VG佐劑同時(shí)放在32℃水浴鍋中平衡30 min，然后按體積比例（佐劑∶蛋白=54∶46）在渦懸震蕩蛋白時(shí)逐滴滴加206佐劑，混合后水平5000 ×g震蕩5次，每次1 min，待油相與水相完全融合，25℃條件下靜置1 h，觀察是否有水油分離及在水相中溶解情況。將免疫原在小鼠頸背部多點(diǎn)注射，50 μg/只，一共免疫3次，每次間隔14 d。在免疫前收集空白血清，采用眼眶靜脈叢采血的方法，每只小鼠采集約200 μL。在第3次免疫后第10 d采集血清進(jìn)行Western blot檢測。稀釋于1%脫脂牛奶的PBST溶液中室溫孵育1 h，PBST洗膜4次，每次10 min。將PVDF膜置于HRP底物ECL發(fā)光液中避光孵育3-5 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

1.7 抗血清的Western blot分析 抗血清對日本血吸蟲全蟲蛋白中的TMEM66P進(jìn)行Western blot鑒定。全蟲蛋白在10%SDS-PAGE中電泳，將蛋白通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在5%脫脂奶粉的PBST溶液室溫封閉2 h，一抗為血清，以1∶80稀釋于1%脫脂奶粉的PBST溶液中4℃過夜，用PBST洗膜4次，每次10 min。二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，1∶1500

2.1 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析表明日本血吸蟲TMEM66P蛋白1-148位氨基酸位于膜表面，149-168位氨基酸之間形成一個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)（圖1），序列與曼氏血吸蟲同源性為67.79%，與小鼠同源性為44.54%。通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，TMEM66P與曼氏血吸蟲距離最近，與多房棘球絳蟲距離較遠(yuǎn)（圖2）。

圖1 TMEM66P的跨膜區(qū)預(yù)測Fig.1 Prediction of TMEM66P transmembrane region

圖2 TMEM66P的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of TMEM66P

2.2 重組蛋白構(gòu)建、表達(dá)、純化與驗(yàn)證 根據(jù)日本血吸蟲TMEM66P基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增其CDS序列，并構(gòu)建pET32a（+）-TMEM66P的原核重組表達(dá)質(zhì)粒。以日本血吸蟲成蟲的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.0%瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定（圖3），結(jié)果表明擴(kuò)增到約1000 bp的DNA片段，與預(yù)期大小一致。利用HindⅢ和kpnI限制性內(nèi)切酶，將擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆至表達(dá)載體pET32a（+），并轉(zhuǎn)化到DH5α中，在含氨芐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取數(shù)個(gè)單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，將陽性菌落送測序，進(jìn)行序列比對。測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）-TMEM66P。將重組質(zhì)粒pET32a（+）-TMEM66P轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，SDS-PAGE分析含有重組質(zhì)粒的菌體表明rTMEM66P蛋白能在BL21菌中表達(dá)（圖4A）。經(jīng)可溶性鑒定發(fā)現(xiàn)其為包涵體蛋白（圖4B）。通過蛋白切膠法純化獲得重組蛋白，分子量約為52 kDa（圖4C）。

圖3 TMEM66P編碼cDNA的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of TMEM66P encoding cDNA

圖4 rTEM66P重組蛋白的表達(dá)及純化Fig.4 Expression and purification of rTMEM66P

2.3 抗血清的Western blot分析 Western blot分析表明抗血清能夠識(shí)別出全蟲蛋白中的TMEM66P，大小為38 kDa（與重組蛋白相比缺少Trix-S-his標(biāo)簽），大小與生物信息學(xué)預(yù)測一致，說明該抗血清具有良好的特異性（圖6）。

圖5 Western blot鑒定重組蛋白Fig.5 Identification of rTMEM66P by Western blot

圖6 Western blot鑒定抗血清的特異性Fig.6 Western blot analysis of the specificity of antiserum

3 討論

跨膜蛋白廣泛存在于細(xì)胞膜，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、和高爾基體等，對機(jī)體健康具有重大意義。研究發(fā)現(xiàn)在消化系統(tǒng)中，跨膜蛋白對惡性腫瘤的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用[10]；跨膜蛋白43的編碼基因突變會(huì)導(dǎo)致肌營養(yǎng)不良和心率失常[11]；干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白存在于病毒侵入細(xì)胞的主要靶點(diǎn)，如質(zhì)膜、溶酶體等，能夠通過抑制宿主細(xì)胞與病毒膜融合來抵抗病毒侵染[12]；牛支原體膜蛋白對宿主的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生有刺激作用[13]；乳脂球膜蛋白能夠抑制癌細(xì)胞生長、對冠心病自閉癥等疾病有重要作用[14]；四跨膜蛋白Tspan1、Tspan8、CD82和CD151與肝癌的產(chǎn)生密切相關(guān)[15]。許多膜蛋白被作為血吸蟲疫苗候選分子進(jìn)行研究，例如：鈣激活中性蛋白激酶、血吸蟲副肌球蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、Mr23 kDa膜蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶、日本血吸蟲14-3-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等[16]。這些膜蛋白能夠參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，是抗血吸蟲病疫苗研究中理想的免疫靶標(biāo)。

抗血清是一種含有多克隆抗體的血清。通過注射抗血清可以傳遞被動(dòng)免疫，治療許多疾病。目前唯一能夠治療埃博拉病毒患者的方法就是通過注射前一個(gè)患者的抗血清到體內(nèi)?？寡宓淖饔迷谟谄浣臃N注射后直接增加動(dòng)物體機(jī)體內(nèi)的抗體含量，產(chǎn)生防治效果快而顯著，而且在一個(gè)地區(qū)，往往發(fā)病的血清型一致，因而特異性很強(qiáng)，效果顯著。

本文對rTMEM66P進(jìn)行純化并制備了抗血清，為TMEM66P在日本血吸蟲中的功能研究奠定基礎(chǔ)。