張世杰，米榮升，張曉麗，王進(jìn)香，孫 滔，黃 燕，韓先干，龔海燕，趙 權(quán)，陳兆國(guó)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海）農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；3.寧夏回族自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，銀川 750011）

隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidiumspp.）是人獸共患腸道寄生性原蟲(chóng)，能夠引起隱孢子蟲(chóng)?。╟ryptosporidiosis），以腹瀉為主要臨床癥狀。該病屬于自限性疾病，正常個(gè)體感染后一般腹瀉7～14 d即可自愈，然而對(duì)免疫低下或免疫缺陷的個(gè)體可致急性腹瀉，甚至死亡，或轉(zhuǎn)為慢性持續(xù)感染。該病在世界性范圍內(nèi)均有報(bào)道，危害極大，嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物的健康[1]。但是，目前尚沒(méi)有有效的疫苗或藥物可有效預(yù)防和治療該病[2]。

微小隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium parvum）是重要的人獸共患的隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種[3]，該蟲(chóng)種最早是1912年Tyzzer在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的[4]。研究報(bào)道，C.parvum具有廣泛的宿主，可以感染包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物，例如牛、羊、馬、羊駝、犬、大鼠、小鼠、松鼠、浣熊、兔等[5-7]。由于C.parvum是感染人的主要蟲(chóng)種之一，因此當(dāng)前關(guān)于隱孢子蟲(chóng)致病機(jī)理、藥物篩選、疫苗研發(fā)等方面的研究，絕大多數(shù)以C.parvum為研究對(duì)象[8]。然而，C.parvum目前并沒(méi)有合適的細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，當(dāng)前的培養(yǎng)體系僅能夠完成隱孢子蟲(chóng)一個(gè)生活史階段，并不能持續(xù)進(jìn)行傳代[1]。因此，隱孢子蟲(chóng)的傳代保種還是以動(dòng)物體內(nèi)繁殖為主。目前報(bào)道的C.parvum感染動(dòng)物模型主要有牛、羊、豬、大鼠、小鼠等[9-16]，但并不是所有動(dòng)物模型均適合C.parvum的繁殖，一些動(dòng)物需要進(jìn)行免疫抑制或免疫缺陷才能夠產(chǎn)生少量的C.parvum卵囊?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，犢牛是C.parvum的最適宿主，感染后能排出大量的卵囊[9]，然而利用犢牛做動(dòng)物模型，對(duì)試驗(yàn)場(chǎng)地要求比較高，而且價(jià)格昂貴。為尋找合適的、價(jià)格低廉的C.parvum動(dòng)物感染模型，本實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行了C.parvum感染ICR小鼠和綿羊的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小鼠免疫抑制后僅能產(chǎn)生少量的卵囊，不適合C.parvum的傳代保種（未發(fā)表）；而綿羊接種1×106個(gè)C.parvum卵囊就能致病，并排出大量的卵囊，適合作為C.parvum的感染模型[17]。

血常規(guī)檢查是臨床上最常用的化驗(yàn)方法之一，在人醫(yī)的臨床檢查中普遍應(yīng)用，而獸醫(yī)臨床上的則應(yīng)用的較少，檢查結(jié)果能夠?yàn)榧膊〉脑\斷提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)臨床和科研都具有重要意義[18]。本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期建立的C.parvum綿羊感染模型，對(duì)新生羔羊進(jìn)行C.parvum接種，觀察綿羊感染隱孢子蟲(chóng)后的臨床癥狀、血液生理指標(biāo)和血清抗體變化情況，為今后進(jìn)行羊感染隱孢子蟲(chóng)的臨床診斷和抗體診斷提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料C.parvum卵囊、貝氏隱孢子蟲(chóng)（C.baileyi）DNA和C.parvum全抗原免疫兔陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物源性病原生物學(xué)及食品安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；2日齡綿羊購(gòu)自上海永輝羊業(yè)有限公司；羔羊代乳粉購(gòu)自杭州思我特農(nóng)業(yè)科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、兔抗羊IgG H&L（HRP）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；脫脂奶粉（Difco Skim Milk）購(gòu)自美國(guó)BD公司；TMB顯色液購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA提取試劑盒（Fast DNA SPIN Kit for Soil）購(gòu)自美國(guó)MP公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；pMD18-T載體、PremixEx TaqTM酶、100 bp DNA marker購(gòu)自寶日醫(yī)生物（北京）有限公司；Trans1 T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為市售、國(guó)產(chǎn)分析純或更高級(jí)別試劑。

1.2 羔羊接種 選取4只體重接近的2日齡羔羊，分籠飼養(yǎng)，連續(xù)3 d收集羔羊糞便，用飽和蔗糖漂浮法進(jìn)行鏡檢[19]，隱孢子蟲(chóng)為陰性的羔羊用于后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為感染組和對(duì)照組，每組2只。感染組將新繁殖的C.parvum卵囊與少量羊奶混合，經(jīng)口飼喂羔羊，每只羊接種1×106個(gè)卵囊；對(duì)照組以等量羊奶飼喂。

1.3 羔羊臨床癥狀觀察及樣品采集 每天記錄羔羊的采食量，并觀察羔羊的臨床癥狀。每3 d測(cè)量羔羊的體溫和體重，用無(wú)菌棉拭子直接從肛門(mén)采集糞便樣品，放入10 mL離心管中，-20℃凍存，用于排卵囊數(shù)檢測(cè)。每3 d頸靜脈采血，一部分加入含乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑的離心管中混勻，1 h內(nèi)進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)；另一部分轉(zhuǎn)入無(wú)菌1.5 mL離心管中，37℃靜置2 h，5000 ×g離心5 min，分離血清，-20℃保存，用于抗體效價(jià)檢測(cè)。

1.4 羔羊臨床癥狀計(jì)分 根據(jù)羔羊的精神狀態(tài)、食欲和排便情況進(jìn)行計(jì)分，計(jì)分方法如下[20]：1）精神狀態(tài)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：反應(yīng)正常，計(jì)1分；反應(yīng)遲緩、能夠站立，計(jì)2分；反應(yīng)遲緩、人工幫助可以站立，計(jì)3分；反應(yīng)遲緩、無(wú)法站立，計(jì)4分。2）羔羊的食欲評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：食欲正常，計(jì)1分；食欲減退、可以自己吸允，計(jì)2分；食欲明顯減退、需要人工灌喂，計(jì)3分；食欲廢絕、人工灌喂難以進(jìn)食，計(jì)4分。3）羔羊排便情況計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：固體、成型，計(jì)1分、糞便松散、不成型，計(jì)2分、輕度腹瀉，計(jì)3分、水樣便，計(jì)4分。

1.5 羔羊感染隱孢子蟲(chóng)的鑒定 收集腹瀉階段的羔羊糞便，用飽和蔗糖漂浮法進(jìn)行富集[21]，鏡檢（400×）是否含有隱孢子蟲(chóng)。同時(shí)，提取糞便樣品DNA，用隱孢子蟲(chóng)小亞基核糖體DNA（SSU rDNA）基因的套式PCR進(jìn)行擴(kuò)增[22]，膠回收目的片段，送賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司進(jìn)行測(cè)序，鑒定綿羊感染的隱孢子蟲(chóng)是否為C.parvum。

1.6 羔羊血常規(guī)檢測(cè) 用全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司，型號(hào)BC-5300Vet）進(jìn)行血液指標(biāo)分析，主要包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板三大類。其中白細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)包括白細(xì)胞（white blood cell, WBC）總數(shù)，中性粒細(xì)胞（neutrophil, Neu）、淋巴細(xì)胞（lymphocy,Lym）、單核細(xì)胞（monocytes, Mon）、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils, Eos）、嗜堿性粒細(xì)胞（Bas）數(shù)目，中性粒細(xì)胞（Neu）、淋巴細(xì)胞（Lym）、單核細(xì)胞（Mon）、嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）和嗜堿性粒細(xì)胞（Bas）百分比等11項(xiàng)；紅細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)包括紅細(xì)胞數(shù)目（red blood cell, RBC）、血紅蛋白濃度（hemoglobin, HGB）、紅細(xì)胞壓積（Hematocri,HCT）、平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume, MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin, MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDWCV%）和紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）等8項(xiàng)；血小板檢測(cè)指標(biāo)包括血小板數(shù)目（blood platelet patients, PLT）、平均血小板體積（mean platelet volume, MPV）、血小板分布寬度（Platelet distribution width, PDW）和血小板壓積（PCT%）等4項(xiàng)。檢測(cè)方法如下：移液器吸取含EDTA-K2抗凝劑的綿羊血液樣品20 μL，置于儀器吸樣針垂直下方（注意吸樣針不能接觸離心管底部，樣品不能有凝血塊），啟動(dòng)儀器，吸取樣品，進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3次。

1.7 羔羊特異性血清IgG檢測(cè)

1.7.1 微小隱孢子蟲(chóng)卵囊可溶性抗原的制備 取保存在2.5%重鉻酸鉀溶液中的C.parvum卵囊，進(jìn)行Sheather's蔗糖密度梯度離心純化[21]，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。取純化后的卵囊1×108個(gè)，液氮反復(fù)凍融5次，超聲破碎30 min，24 000 ×g離心30 min，收集上清液[23]。BCA試劑盒測(cè)定全抗原濃度，分裝，保存于-80℃，備用。

1.7.2 羔羊特異性IgG抗體檢測(cè) 用ELISA方法進(jìn)行羔羊特異性IgG抗體水平檢測(cè)[24]，其中全抗原的包被濃度為2 μg/mL，羔羊血清用5%脫脂奶粉按1∶100稀釋，兔抗羊二抗進(jìn)行1∶5000稀釋，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450數(shù)值。每孔重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（C.parvum全抗原免疫兔陽(yáng)性血清）、陰性對(duì)照（實(shí)驗(yàn)室保存隱孢子蟲(chóng)陰性健康綿羊血清）和空白對(duì)照（以PBST代替血清做一抗孵育）。當(dāng)陽(yáng)性孔OD450≥0.5，且陰性孔＜0.5視為有效，待測(cè)樣品孔OD450值/陰性孔OD450值≥2.1，判斷為陽(yáng)性。

1.8 糞便樣品排卵囊情況檢測(cè)

1.8.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 取1×108個(gè)C.parvum卵囊，提取DNA；擴(kuò)增SSU rDNA基因全長(zhǎng)，連接到pMD18-T載體，制備pMD-CpSSUrDNA重組質(zhì)粒[25]；用NanoDrop測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度，計(jì)算拷貝數(shù)；將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋（102～108copies/μL），作為標(biāo)準(zhǔn)品[25]。

1.8.2 樣品檢測(cè) 采集羔羊感染前和感染后糞便樣品，其中感染后樣品從第3 d開(kāi)始采集，每3 d采集一次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第30 d。提取所有糞便樣品DNA，應(yīng)用基于TaqMan探針的熒光定量PCR方法，擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)本和待檢樣品，計(jì)算排卵囊數(shù)量[25]。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析 血常規(guī)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（||±s）表示，通過(guò)SPSS 21.0軟件，對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用最小顯著差異法（least significant difference, LSD）比較同一時(shí)期的感染組和對(duì)照組各個(gè)血常規(guī)數(shù)值是否存在顯著性差異[26]。當(dāng)P＞0.05時(shí)，判定為差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P≤0.05時(shí)，判定為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P＜0.01時(shí)，判定為差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察 對(duì)羔羊進(jìn)行的體溫檢測(cè)結(jié)果表明，感染組和對(duì)照組羔羊體溫變化不明顯，均在綿羊正常的體溫變化范圍內(nèi)（38.3℃～39.9℃）波動(dòng)，其中感染組羔羊體溫在38.6℃～38.9℃之間波動(dòng)，對(duì)照組在38.5～38.9℃之間波動(dòng)（圖1A）。感染組羔羊在隱孢子蟲(chóng)感染初期（3～12 d）體重增加緩慢，后期逐漸增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后感染組羔羊的體重（5.44±0.05 kg）顯著低于對(duì)照組（5.96±0.18 kg）（P＜0.05）（圖1B）。羔羊每日的攝奶量呈逐漸增多趨勢(shì)，兩組羔羊初期的攝奶量均在5.5 L/d左右，但是感染組羔羊在感染后的第3～5 d明顯下降，最低只有1.9 L/d，隨后逐漸上升，中間會(huì)出現(xiàn)小幅度的下降，而對(duì)照組羔羊攝奶量則每日穩(wěn)步升高，期間個(gè)別天出現(xiàn)少量的下降（圖1C）；食欲評(píng)分結(jié)果與攝奶量結(jié)果相似，感染組3～12 d出現(xiàn)不同程度的厭食情況，4～5 d食欲明顯降低，而對(duì)照組食欲正常（圖1D）。糞便評(píng)分結(jié)果顯示，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中感染組羔羊糞便以松散、不成型狀態(tài)為主，其中6～9 d出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，但是未見(jiàn)明顯的水樣便，而對(duì)照組羔羊糞便多數(shù)時(shí)間正常，但個(gè)別時(shí)間出現(xiàn)松散不成型現(xiàn)象（圖1E）。感染組羔羊在第3～12 d出現(xiàn)反應(yīng)遲緩現(xiàn)象，其余時(shí)間狀態(tài)正常，未出現(xiàn)羔羊無(wú)法站立現(xiàn)象；而對(duì)照組羔羊在絕大多數(shù)時(shí)間內(nèi)精神狀態(tài)均正常，但是在3～7 d出現(xiàn)輕微的反應(yīng)遲緩現(xiàn)象（圖1F）。

圖1 綿羊感染隱孢子蟲(chóng)的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of Cryptosporidium infection in sheep

2.2 羔羊感染隱孢子蟲(chóng)的鏡檢及分子鑒定 在感染組羔羊腹瀉嚴(yán)重期，同時(shí)收集感染組和對(duì)照組糞便，用Sheather's蔗糖漂浮法進(jìn)行鏡檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組羔羊樣品在顯微鏡下觀察到隱孢子蟲(chóng)卵囊（圖2），而對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(chóng)卵囊。提取兩組樣品的DNA，用套式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并且對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組的兩只羔羊樣品均能夠擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，與目的片段的大小一致（830 bp），而對(duì)照組兩只羔羊樣品擴(kuò)增結(jié)果為陰性（圖3）。對(duì)陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列經(jīng)BLAST比對(duì)為C.parvum。

圖2 隱孢子蟲(chóng)顯微鏡檢結(jié)果Fig.2 The results of microscopic examination of Cryptosporidium

圖3 隱孢子蟲(chóng)分子鑒定結(jié)果Fig.3 The results of molecular identification of Cryptosporidium oocysts

2.3 羔羊感染隱孢子蟲(chóng)的血常規(guī)分析

2.3.1 白細(xì)胞變化情況 本研究對(duì)11項(xiàng)白細(xì)胞指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組WBC#顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），WBC的平均數(shù)量在5×1010/L左右，而對(duì)照組在2.5×1010/L左右（圖4A）。感染組WBC和Neu的數(shù)量均是在感染后的第3 d開(kāi)始升高，第9 d達(dá)到最高，隨后開(kāi)始下降，其中WBC在第21 d降至最低，隨后繼續(xù)升高（圖4A），而Neu在感染后的第24 d降至最低，隨后繼續(xù)升高（圖4B）。Neu%變化趨勢(shì)和Neu變化趨勢(shì)相同，均是第9 d達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始下降，第24 d降至最低，隨后再升高，但是對(duì)照組Neu%也出現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)（圖4C）。感染組和對(duì)照組Lym的數(shù)量呈交替變化趨勢(shì)（圖4D），但是Lym%則是對(duì)照組高于感染組，并且呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)（圖4E）。感染組和對(duì)照組中Mon、Mon%、Eos和Eos%均相似，均是前期變化很小，但是21 d以后出現(xiàn)不同程度的升高（圖4F～I(xiàn)）。與之相反，感染組和對(duì)照組中Bas，除第21 d降低之外，總體呈上升趨勢(shì)（圖4J），但是兩組中的Bas%相似，均在0.1%左右（圖4K）。

圖4 綿羊白細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化情況Fig.4 Dynamic changes of white blood cells in sheep

2.3.2 紅細(xì)胞變化情況 對(duì)紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的分析，發(fā)現(xiàn)RBC的數(shù)量、HGB和HCT變化均是感染組低于對(duì)照組，在感染后的第6～9 d達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始下降，感染后期又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖5A-C）。而MCV、MCH、RDW-CV和RDW-SD均是感染組高于對(duì)照組（圖5D、5E、5G、5H）；其中MCV和RDW-SD呈逐漸下降的趨勢(shì)（圖5D、5H），在第21 d稍微升高；MCH則是緩慢下降（圖5E）；而RDW-CV開(kāi)始變化不明顯，在第21 d急劇下降（圖5G）。感染組MCHC在感染初期濃度逐漸上升，12 d達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始逐漸下降，而對(duì)照組MCHC呈緩慢上升趨勢(shì)（圖5F）。

圖5 綿羊紅細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化情況Fig.5 Dynamic changes of red blood cells in sheep

2.3.3 血小板變化情況 本研究對(duì)4個(gè)血小板指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組PLT和PCT均高于對(duì)照組，其中感染組PLT在第9 d和第18 d出現(xiàn)兩個(gè)高峰，PCT在第9 d和第24 d出現(xiàn)兩個(gè)高峰，而對(duì)照組中PLT和PCT均在第6 d出現(xiàn)一次高峰，隨后開(kāi)始下降，至第12 d降至最低，隨后開(kāi)始逐漸升高（圖6A、6D）。對(duì)照組的MPV和PDW均高于感染組，并且兩組數(shù)值在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中基本保持恒定，只有個(gè)別時(shí)間出現(xiàn)變化，其中感染組和對(duì)照組MPV均在第24 d升高，而對(duì)照組PDW在第3 d和第27 d均下降（圖6B、6C）。

圖6 綿羊血小板動(dòng)態(tài)變化情況Fig.6 Dynamic changes of platelet in sheep

2.4 血清中特異性IgG抗體動(dòng)態(tài)變化 利用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，陽(yáng)性孔OD450平均值為0.78，陰性孔平均值為0.16，空白孔平均值為0.13，陽(yáng)性孔/陰性孔（P/N）=4.90，大于2.1，表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效。對(duì)感染組和對(duì)照組血清IgG的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染組于感染后第3 d即呈陽(yáng)性，隨后開(kāi)始下降，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，而對(duì)照組血清抗體P/N比值均小于2.1，均為陰性。感染組血清抗體水平除第18 d出現(xiàn)小的上升以外，整體呈下降趨勢(shì)，其中第3 d的抗體水平最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，第3 d和第6 d抗體效價(jià)差異不顯著（P＞0.05），9～30 d抗體效價(jià)與第3 d差異極顯著（P＜0.01）（圖7）。

圖7 綿羊血清抗體變化情況Fig.7 The variety of serum antibody (IgG) in sheep

2.5 羔羊排卵囊情況 為檢測(cè)羔羊排卵囊情況，取1×108個(gè)C.parvum卵囊，制備基于C.parvumSSU rDNA基因全長(zhǎng)的重組質(zhì)粒（pMD-CpSSUrDNA），以不同稀釋度的pMD-CpSSUrDNA為模板，用熒光定量PCR方法擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)樣品，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值為0.9982，可以用于未知樣品的檢測(cè)（圖8A）。提取感染組兩只羔羊糞便樣品DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明1號(hào)羔羊第6 d為排卵囊高峰，2號(hào)羔羊第9 d為排卵囊高峰期，后面均出現(xiàn)一個(gè)小的排卵囊高峰（圖8B）。

圖8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及綿羊排卵囊情況Fig.8 Standard curve of quantitative real-time PCR method and the number of oocysts excretion in sheep

3 討論

隱孢子蟲(chóng)是重要的人獸共患寄生蟲(chóng)，能夠感染包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物，全世界范圍內(nèi)均有畜禽感染隱孢子蟲(chóng)的報(bào)道，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[27]。目前隱孢子蟲(chóng)并沒(méi)有有效的疫苗和藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，對(duì)該病的及早診斷具有重要意義。雖然已經(jīng)有很多關(guān)于綿羊感染C.parvum的報(bào)道，甚至一些地區(qū)C.parvum是綿羊感染的優(yōu)勢(shì)種[28]，但是自然感染的綿羊，多數(shù)體內(nèi)隱孢子蟲(chóng)的數(shù)量較少，綿羊的癥狀并不明顯，所以目前尚不清楚綿羊感染隱孢子蟲(chóng)的臨床癥狀。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)綿羊進(jìn)行人工感染C.parvum，觀察綿羊感染后的攝奶量、體溫、精神狀態(tài)、排便情況等臨床指標(biāo)的變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羔羊感染1×106個(gè)卵囊，體溫變化不明顯，但能夠延緩羔羊增重，感染高峰期會(huì)影響羔羊的攝奶量。但是，羔羊并未出現(xiàn)非常嚴(yán)重的水樣腹瀉，食欲廢絕等癥狀，這可能與接種劑量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn)，羔羊接種1×107個(gè)卵囊，能夠顯著致病，羔羊發(fā)生嚴(yán)重的水樣腹瀉，并在第10 d左右發(fā)生死亡；而接種1×106個(gè)卵囊，僅在第一次排卵囊高峰期癥狀比較明顯，后期羔羊會(huì)逐漸恢復(fù)正常[17]。與綿羊的研究相反，對(duì)1日齡山羊進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口接種1×106個(gè)卵囊，羔羊出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉，并且第14 d發(fā)生死亡[14]，而對(duì)兩只4日齡山羊接種1×105個(gè)卵囊的研究發(fā)現(xiàn)山羊的臨床癥狀并不明顯[10]。這些差異可能與羊的品種有關(guān)，不同種類的羊，C.parvum的致病性不同。

血常規(guī)檢查是疾病診斷和監(jiān)測(cè)的重要參考指標(biāo)，其中白細(xì)胞主要功能是殺滅細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等異物，參與體內(nèi)免疫發(fā)生過(guò)程；紅細(xì)胞主要是攜帶和運(yùn)輸氧氣，以滿足機(jī)體生理活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)的需要；血小板在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過(guò)程中有重要作用[18,26,29-30]。本研究對(duì)綿羊感染C.parvum后的血常規(guī)分析表明，WBC和PLT數(shù)量增多，而RBC數(shù)量減少。WBC在第一次排卵囊高峰期（6～9 d）出現(xiàn)明顯的升高，說(shuō)明羔羊發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；而RBC降低，推測(cè)綿羊感染C.parvum后可能出現(xiàn)了貧血現(xiàn)象；PLT增多說(shuō)明血小板生成能力增強(qiáng)，參與宿主對(duì)炎癥反應(yīng)的抵抗。當(dāng)前，關(guān)于綿羊感染隱孢子蟲(chóng)后的血常規(guī)變化未見(jiàn)報(bào)道，但是其他動(dòng)物感染隱孢子蟲(chóng)后的血常規(guī)分析有少量報(bào)道。有研究表明，C.parvum感染大鼠后，對(duì)WBC、RBC和HGB進(jìn)行的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大鼠的RBC和HGB下降，WBC增多[15]，這與本研究在綿羊上獲得的結(jié)果一致。但是，用仔豬接種人隱孢子蟲(chóng)（C.hominis），在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第13 d進(jìn)行血常規(guī)分析，發(fā)現(xiàn)WBC增多、RBC減少，然而與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞ 0.05）[31]，由于該研究?jī)H在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行了檢測(cè)，并未在隱孢子蟲(chóng)感染的高峰期進(jìn)行檢測(cè)，這可能是本研究與該報(bào)道存在不同的原因。此外，對(duì)于其他寄生蟲(chóng)血常規(guī)的檢測(cè)，也存在差異。例如，用日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum）感染東方田鼠和BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)東方田鼠WBC在感染后的第1～16 d均顯著高于感染前（0 d），而B(niǎo)ALB/c小鼠只在第5 d和第16 d高于感染前[32]；用斯氏艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria stiedai）感染新西蘭兔，發(fā)現(xiàn)WBC顯著升高，但是PLT顯著減少[33]；用人芽囊原蟲(chóng)（Blastocystishominis）感染SD大鼠，發(fā)現(xiàn)WBC和PLT均增多，但是WBC#與對(duì)照組差異不顯著[34]。這些結(jié)果說(shuō)明，不同種屬寄生蟲(chóng)感染宿主以后，宿主血常規(guī)的變化存在差異，但是普遍WBC數(shù)量增多。

白細(xì)胞包括單核細(xì)胞（Mon）、淋巴細(xì)胞（Lym）、中性粒細(xì)胞（Neu）、嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）和嗜堿性粒細(xì)胞（Bas）等5種，不同細(xì)胞，功能存在差異。Neu具有活躍的變形運(yùn)動(dòng)和吞噬功能，當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體時(shí)，Neu通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)從血管內(nèi)皮細(xì)胞間游出，趨向炎癥區(qū)，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)溶酶體釋放的蛋白水解酶將其消化，防止病原微生物在體內(nèi)的擴(kuò)散；Mon主要功能是激活淋巴細(xì)胞，還具有吞噬殺滅病原體等作用；Lym是重要的免疫活性細(xì)胞，參與動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞免疫，具有先天性的抗病能力；Eos能夠吞噬外源病原體，Bas主要是參與超敏反應(yīng)[26,29,30,35]。本研究發(fā)現(xiàn)綿羊感染C.parvum后，Neu和Neu%均顯著升高，這與之前用C.hominis感染仔豬后的研究結(jié)果相似，該研究也發(fā)現(xiàn)Neu%顯著升高[31]。對(duì)于其他寄生蟲(chóng)感染宿主的報(bào)道也存在相似的結(jié)果：例如，用東方田鼠感染S.japonicum后，Neu顯著升高，但是感染BALB/c小鼠后Neu差異不顯著[32]；用芽囊原蟲(chóng)感染SD大鼠后，Neu顯著高于對(duì)照組[35]。這些結(jié)果提示我們，Neu可能在抗寄生蟲(chóng)感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)感染組Mon和Bas增多，提示隱孢子蟲(chóng)感染后發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。然而，Lym基本上沒(méi)有變化，而Eos后期呈上升的趨勢(shì)，但是低于對(duì)照組。之前的研究結(jié)果顯示，人感染恰氏利什曼原蟲(chóng)（Leishmania chagasi）后，Eos顯著升高[36]；新西蘭兔感染E.stiedai，Eos顯著升高[33]；BALB/c小鼠感染S.japonicum后，Eos和Lym顯著升高；而東方田鼠感染S.japonicum后，Mon、Bas、Eos和Lym均顯著升高[32]。這些研究結(jié)果表明，不同種寄生蟲(chóng)感染宿主后，不同類型白細(xì)胞的變化存在很大差異。

應(yīng)用ELISA檢測(cè)方法，本研究對(duì)綿羊感染隱孢子蟲(chóng)后的血清IgG水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)綿羊感染的第3 d抗體即達(dá)到最高值，隨后開(kāi)始下降，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束抗體仍然維持在較高水平。該結(jié)果與之前對(duì)自然感染和人工感染的羔羊的抗體檢測(cè)結(jié)果相一致，該實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)綿羊感染C.parvum后，第3 d天就能夠檢出抗體，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第30 d抗體依然存在[12]。此外，以NMRI（Naval Medical Research Institute）小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停臃N5×105個(gè)C.parvum卵囊，從第6 d開(kāi)始檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)第6 d即為抗體效價(jià)的最高峰，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（18 d），抗體效價(jià)一直很高[37]。這些研究表明，隱孢子蟲(chóng)感染宿主后，宿主抗體效價(jià)會(huì)很快上升，而且能夠持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，但具體持續(xù)時(shí)間還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)綿羊感染隱孢子蟲(chóng)后的排卵囊情況進(jìn)行了檢測(cè)。該方法為本實(shí)驗(yàn)室前期建立，用基于隱孢子蟲(chóng)SSU rDNA基因的TaqMan探針進(jìn)行檢測(cè)，最低能檢出0.1個(gè)卵囊，具有很好敏感性和特異性，適合多種隱孢子蟲(chóng)感染的定量檢測(cè)[25]。應(yīng)用該方法，本研究發(fā)現(xiàn)綿羊存在兩個(gè)排卵囊高峰期，第1個(gè)高峰期為急性感染期（第6～9 d），綿羊排出大量的卵囊，第2個(gè)高峰期（第21～24 d）僅排出少量卵囊，這主要是由于隱孢子蟲(chóng)感染宿主以后，在排出體外之前，形成薄壁卵囊和厚壁卵囊，少量薄壁卵囊能夠再次感染宿主[1]。然而，該結(jié)果與之前本實(shí)驗(yàn)室對(duì)綿羊感染C.parvum的排卵囊曲線略有不同，之前發(fā)現(xiàn)C.parvum感染后存在3個(gè)排卵囊高峰期[17]，這可能與本實(shí)驗(yàn)是每3 d檢測(cè)一次有關(guān)，漏掉了中間可能出現(xiàn)的排卵囊高峰，而之前的研究是每天檢測(cè)一次。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以綿羊?yàn)閯?dòng)物模型，對(duì)綿羊接種C.parvum以后的臨床癥狀、血常規(guī)變化、抗體效價(jià)以及排卵囊情況進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)綿羊接種1×106個(gè)卵囊后，能夠影響羔羊的攝奶量和增重，而羔羊的食欲、精神狀態(tài)和排便情況在感染高峰期比較明顯，其他時(shí)間癥狀不明顯。對(duì)綿羊感染C.parvum后的血常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WBC和PLT數(shù)量增多，RBC數(shù)量下降，白細(xì)胞中Neu和Bas升高，提示羔羊感染隱孢子蟲(chóng)發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。此外，羔羊感染隱孢子蟲(chóng)后第3 d就可以產(chǎn)生抗體，而且持續(xù)存在。本研究首次對(duì)綿羊感染隱孢子蟲(chóng)后的血液學(xué)變化進(jìn)行了分析，研究結(jié)果能夠?yàn)殡[孢子蟲(chóng)的臨床診斷提供輔助參考。