尚慶煜，孫慧琳，梁露靜，鞠曉紅

（吉林醫(yī)藥學院，吉林 132013）

MTB是一類引起人獸共患慢性消耗性傳染病-結核病的病原體，嚴重威脅人類健康，引起人類結核病的主要有人結核分枝桿菌和牛結核分枝桿菌，據(jù)報道約10%的人類結核病由牛分枝桿菌引起[1-2]。1998年，英國Sanger中心和法國Pasteur研究所聯(lián)合完成了結核分枝桿菌H37Rv菌株全基因組測序，開啟了MTB的基因組學研究歷程，從而發(fā)現(xiàn)了一大類富含甘氨酸、N端有保守脯氨酸-谷氨酸序列（Proline-Glutamate, PE）的蛋白家族，命名為PE家族，約占全部基因組編碼基因的6%[3]。PE家族又根據(jù)編碼蛋白質C端含有串聯(lián)重復序列的不同，進一步分為單獨PE（PE_only）和PE_PGRS兩個相近亞家族。PE_PGRS家族因C端編碼基因富含鳥嘌呤-胞嘧啶基序（polymorphic guanine-cytosine rich sequences，PGRS）而得名，是MTB獨有的多基因亞家族，只存在于分枝桿菌屬，且絕大多數(shù)僅存在于致病性分枝桿菌中，與分枝桿菌的致病性與毒力密切相關。因此，近年來成為世界范圍的研究熱點之一，作為開發(fā)藥物、研制疫苗和診斷試劑的特異性靶點[4-5]，在結核病的預防、治療和檢測領域具有廣闊的發(fā)展前景，極具研究價值。故本文對PE_PGRS家族蛋白的組成、結構、表達及功能進行簡要綜述，為PE_PGRS蛋白的研究應用提供參考。

1 PE_PGRS家族成員

PE_PGRS家族蛋白為一組酸性蛋白，長度約104～1901個氨基酸，主要定位于細胞壁和細胞膜上，構成MTB的表面抗原成分，參與免疫逃逸和抗原變異，對MTB胞內存活極其重要；部分成員也可以以胞外囊泡的形式釋放到細胞外環(huán)境發(fā)揮作用。目前，已命名的PE_PGRS家族成員有63個，分別稱為PE_PGRS1-PE_PGRS63，研究中也經常使用其在H37Rv菌株基因組中的基因序號代替PE_PGRS名稱，如Rv1818c即指PE_PGRS33。其中，PE_PGRS12只有137個氨基酸，發(fā)生移碼突變后與PE_PGRS13的749個氨基酸發(fā)生融合。二者具體對應關系見表1[6]。

表1 結核分枝桿菌PE_PGRS家族成員及基因定位Table 1 member and gene of PE_PGRS in Mycobacterium tuberculosis

2 PE_PGRS家族蛋白結構

PE_PGRS家族蛋白主要包括高度保守的PE結構域和極富多態(tài)性的PGRS結構域，在兩個結構域之間有一個短的、由幾十個氨基酸組成的連接區(qū)，可能與蛋白質在細胞壁上的錨定作用有關。有的家族成員在PGRS結構域之后的C末端還有一個獨特結構域（unique domain），其大小可從幾個氨基酸到300多個氨基酸數(shù)量不等，功能各異。PE_PGRS33蛋白的C末端有血凝素活性，PE_PGRS16和PE_PGRS35蛋白C末端有兩個胃蛋白酶特征性基序DTG和DSG，可能是天冬氨酸蛋白酶結構域，稱為Mtb-AP[7]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，所有包含這一結構域的蛋白均屬于PE蛋白家族，正常狀態(tài)下以無活性形式存在，推測可能與PE_PGRS蛋白引發(fā)的免疫保護作用有關。家族成員中PE_PGRS62和PE_PGRS63較為特殊，缺乏PGRS結構域，PE_PGRS62 C末端是一段獨特的結構域，PE_PGRS63 PE結構域之后序列是脂肪酶活性編碼區(qū)。

2.1 PE結構域 PE結構域位于N端，長度相對穩(wěn)定，約含110個氨基酸殘基，高度保守，具有特征性脯氨酸-谷氨酸序列，主要負責蛋白的轉運和定位，同時也是人類T細胞識別的主要抗原表位。完全缺失PE結構域和丟失N端最前面30個氨基酸的PE_PGRS33蛋白不能轉位到細胞表面，只能在細菌的細胞質中找到，蛋白功能喪失；在兩個相當保守區(qū)域的單個氨基酸替換對蛋白質穩(wěn)定性有一定影響，但不影響其細胞定位，說明決定胞內合成PE-PGRS蛋白轉位的關鍵序列存在于PE結構域前30個氨基酸中[8]。然而，在完全缺失PGRS結構域的情況下，不同分枝桿菌PE結構域的存在方式發(fā)生改變，基因重組恥垢分枝桿菌、MTB和牛分枝桿菌卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）的PE結構域仍定位于細胞壁，而海分枝桿菌則通過ESX5被分泌到培養(yǎng)基上清液中，說明PE結構域的定位作用需要PGRS結構域輔助完成。

PE_PGRS家族所有成員在PE結構域均含有一個保守的四肽基序DEVS或DXXS（X為任意氨基酸），除PE_PGRS63外，其他蛋白四肽基序均位于N端43-46氨基酸，PE_PGRS63位于N端第17個氨基酸處。其中51個家族成員的核心四肽基序是DEVS，與caspase-3識別基序DEVD/E高度相似，絲氨酸殘基磷酸化后可競爭性與caspase-3蛋白結合，抑制宿主啟動程序化死亡程序，可能是MTB進化出的又一種生存機制[9]。

2.2 PGRS結構域 PGRS結構域位于PE結構域之后，長度不定（十幾個到幾百個氨基酸不等），極富多態(tài)性并有極強的免疫原性，是與宿主細胞成分相互作用的暴露區(qū)域，也是表達B細胞表位的主要區(qū)域。PE_PGRS33的PGRS結構域是小鼠和人體體液免疫反應的靶點，PE_PGRS33抗血清能抑制MTB進入巨噬細胞，在體外能中和PE_PGRS33的促炎活性，可作為抗結核治療的抗原靶位[10]。此外，該結構域還有許多個性化序列，賦予不同家族成員獨特性功能。如PE_PGRS5，在該結構域存在內質網定位序列，有助于MTB定位于內質網中，功能發(fā)揮主要依賴于TLR4[11]；PE_PGRS33依賴該區(qū)域定位于宿主細胞線粒體膜，導致細胞死亡，功能發(fā)揮主要依賴于TLR2[12]。

富含大量甘氨酸和丙氨酸重復序列是PGRS結構域的特征性標志，通常以Gly-Gly-Ala或Gly-Gly-X（X為任意氨基酸）形式存在，甘氨酸約占氨基酸總量的50%以上，該重復序列在除PE_PGRS63外的成員中至少出現(xiàn)30次。其中，富含甘氨酸的GGXGXD/NXUX（U指非極性或疏水性大殘基）非肽序列（nonapeptide sequence）形成一個連接鈣的平行β滾筒或平行β螺旋結構，呈典型的鈣連接蛋白（calcium binding proteins）特征，MTB和宿主細胞間存在由PE_PGRS介導的依賴于Ca2+的相互作用，通過Ca2+與PE_PGRS蛋白結合，導致巨噬細胞中Ca2+濃度顯著下降，抑制吞噬溶酶體的成熟，幫助MTB達到持續(xù)感染的目的[13-14]。家族中PE_PGRS8、PE_PGRS12、PE_PGRS17、PE_PGRS60和PE_PGRS62 5個成員該結構缺失，不能與Ca2+結合。

3 PE_PGRS家族編碼基因

PE_PGRS家族起源目前還不清楚，可能是細菌在長期進化過程中為適應環(huán)境發(fā)生基因重組與基因突變雙重作用的陽性選擇結果，不同選擇壓力對個體pe_pgrs基因作用不同，最終導致家族成員功能和表達各異[15]。也有人認為可能與新近發(fā)現(xiàn)的Ⅶ型分泌系統(tǒng)ESX（early secretory antigenic system）編碼基因有關。MTB ESX分泌系統(tǒng)包括5個基因簇，Akhter等[16]認為pe基因可能起源于esx祖先基因區(qū)復制一系列esx基因簇的過程。系統(tǒng)發(fā)育重建表明，esx基因簇通過多基因復制擴展的同時伴隨著PE家族基因的擴展。因而，PE_PGRS家族蛋白可能是ESX5分泌系統(tǒng)特異性底物，合成的蛋白通過ESX5分泌系統(tǒng)轉運到細胞膜上，目前已在多個PE_PGRS蛋白的轉運中得到證實。pgrs基因散布于致病性MTB整個基因組中，大多數(shù)不與其他基因共同轉錄，由一組異質的轉錄調控因子控制。

PGRS結構域的編碼基因極具多態(tài)性，也被稱為多態(tài)性序列，富含源自9 bp重復序列CGGCGGCAA串聯(lián)而成的鳥嘌呤（G）-胞嘧啶（C）基序，是一個不完善的短的重復序列，隨機聚集于MTB復合群染色體的多個區(qū)域，但在染色體中相當穩(wěn)定，現(xiàn)已作為DNA指紋圖譜的遺傳標志，用于MTB菌株分型。

比較實驗室菌株H37Rv與臨床菌株CDC1551pe_pgrs基因序列結果顯示[17]，pe基因完全相同，最易發(fā)生變異的是pgrs基因區(qū)的重復序列，以插入和缺失為主，編碼產物表現(xiàn)為蛋白缺失或大小差異，甘氨酸和丙氨酸重復序列編碼基因的缺失或插入是導致變異的主要原因，推測pgrs的多態(tài)性是細菌逃避宿主免疫反應的主要手段。Copin等[18]對94株臨床分離菌株的27個pe_pgrs基因序列的差異分析發(fā)現(xiàn)，與其他基因組比較，pe_pgrs表現(xiàn)出明顯的基因變異，在核苷酸、插入/缺失多樣性和dN/dS比值方面均存在顯著差異，說明不同家族成員存在廣泛的中性選擇（neutral selection）、純化選擇（purifyling selection）和多樣性選擇（diversifying selection），意味家族成員功能的獨特性。Camassa等[19]對135株臨床分離菌株的研究同樣發(fā)現(xiàn)，pe_pgrs基因存在單核苷酸突變和低dN/dS比值（0.64），推測純化突變是MTB對抗有害基因變異的結果。廣泛存在的pgrs基因變異結果說明，PGRS結構域是MTB復合群多樣性的主要來源，是導致MTB抗原變異的主要原因。

4 PE_PGRS家族蛋白表達

PE_PGRS蛋白表達受生長環(huán)境控制，主要包括低氧、營養(yǎng)匱乏和低pH值等因素，不同環(huán)境因素對不同PE_PGRS蛋白表達的影響亦不相同，蛋白的差異表達可能在結核病的發(fā)病機制和改變宿主對感染的反應方式中發(fā)揮作用不同。

Dheenadhayalan等[20]對16個PE_PGRS家族成員表達的研究發(fā)現(xiàn)，PE_PGRS27和PE_PGRS50在任何情況下（對數(shù)期、低氧、營養(yǎng)匱乏、低pH值、巨噬細胞內）都不表達；PE_PGRS14、PE_PGRS24、PE_PGRS30、PE_PGRS33、PE_PGRS34、PE_PGRS35和PE_PGRS45在體外任何培養(yǎng)條件下均呈組成性表達；PE_PGRS44和PE_PGRS51在對數(shù)生長期和富含營養(yǎng)環(huán)境中正常表達，在其他生長環(huán)境不表達；PE_PGRS26和PE_PGRS55在體外各種培養(yǎng)環(huán)境表達均明顯下降，PE_PGRS55在低氧環(huán)境中培養(yǎng)至30 d不表達；在培養(yǎng)6 d的巨噬細胞內，PE_PGRS1、PE_PGRS26、PE_PGRS55表達明顯下調，而PE_PGRS16表達升高8倍，在感染MTB幾個月的小鼠組織中也觀察到PE_PGRS16和PE_PGRS26的逆向調節(jié)，推測可能與細菌在巨噬細胞內持續(xù)存活有關。如果能進一步證實PE_PGRS16和PE_PGRS26在感染中的表達特點，那么檢測二者的逆向表達性就可能成為診斷MTB潛伏感染的標志，為結核病的早期診斷提供新方向。用表達PE_PGRS16、PE_PGRS26和PE_PGRS33的恥垢分枝桿菌感染人巨噬細胞后6 d，表達PE_PGRS33和PE_PGRS26的菌株存活數(shù)量明顯高于PE_PGRS16；小鼠感染后10 d，PE_PGRS33和PE_PGRS26菌株在小鼠脾臟和肝臟亦表現(xiàn)為持續(xù)高水平生長。PE_PGRS33和PE_PGRS26菌株的持續(xù)高存活與細胞死亡相關，細胞培養(yǎng)液檢測，乳酸脫氫酶釋放增加，IL-10水平升高，而IL-12和NO低水平存在[20]。相反，PE_PGRS16菌株存活率較低與巨噬細胞培養(yǎng)液和小鼠體內NO、IL-12水平較高有關。說明不同PE_PGRS蛋白在宿主細胞中的表達差異可能同時影響MTB病原菌和宿主雙方命運，提示研究PE_PGRS家族單個成員功能和表達的重要意義。

5 PE_PGRS家族蛋白功能

PE_PGRS家族成員眾多、功能各異，其核心目標是對抗宿主的免疫防御系統(tǒng)，逃避免疫殺傷獲得胞內繁殖和生存能力，因而與MTB的存活和毒力密切相關，在結核病的發(fā)病和臨床進程中發(fā)揮重要作用，是影響疾病轉歸的關鍵因素。

5.1 介導細菌黏附入侵 黏附定殖能力是MTB感染宿主細胞的先決條件。PE_PGRS家族蛋白大多數(shù)屬于MTB表面抗原，在介導細菌的黏附并侵入宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用，這也是其與MTB毒力密切相關的原因之一。PE_PGRS3蛋白在低磷酸鹽濃度下特異性表達于菌體表面，其C末端有富含精氨酸的結構域，在重組恥垢分枝桿菌中全長表達時，明顯增強細菌對小鼠巨噬細胞和人上皮細胞的黏附能力，感染小鼠后提高了細菌在脾臟組織存留的持久性[21]。PE_PGRS33蛋白通過與宿主細胞表面TLR2結合誘導炎癥信號并促進細菌進入巨噬細胞，缺乏PE_PGRS33的菌株進入巨噬細胞的能力嚴重受損[22]。PE_PGRS60和PE_PGRS61具有纖連蛋白結合蛋白（fibronectin-binding protein, FnBP）特性，可充當與宿主細胞相互作用的黏附分子和信號分子，通過FnBP識別宿主細胞纖連蛋白（fibronectin, Fn）介導細菌黏附宿主細胞[23]。

5.2 調節(jié)宿主細胞凋亡 PE_PGRS家族蛋白具有抑制和促進宿主細胞凋亡的雙重作用。細胞凋亡通常被認為是在感染早期保護宿主免受MTB侵襲的一種防御機制，然而肺部感染MTB引起的肉芽腫晚期的細胞凋亡則可能更有利于細菌的擴散傳播。PE_PGRS家族蛋白在宿主體內形成肉芽腫時可在巨噬細胞中表達，但在肉芽腫形成的不同階段PE_PGRS蛋白表達的種類和水平存在差異。據(jù)此推測，在感染早期表達的PE_PGRS蛋白主要作用是增強MTB的增殖和胞內存活能力，同時抑制宿主細胞凋亡為細菌的繁殖贏得空間和時間；而晚期肉芽腫使胞內寄生菌生存環(huán)境進一步惡化時，MTB則表達以促進宿主細胞凋亡為主的家族蛋白，幫助細菌擴散并尋找新宿主。

5.2.1 抑制凋亡 誘導感染細胞凋亡是宿主抵抗MTB的重要手段，然而毒力強的MTB在感染早期有能力抑制宿主細胞的凋亡進程，防止被宿主防御系統(tǒng)殺死，使其在細胞內繼續(xù)存活和增殖。PE結構域普遍存在保守的DEVS基序中的絲氨酸翻譯修飾后，作為底物競爭性結合caspase-3，抑制細胞凋亡，加強了對MTB休眠期和感染狀態(tài)的控制能力；同時在PGRS結構域存在鈣螯合基序，抑制因鈣離子內流誘導的細胞凋亡，可能是MTB抑制宿主細胞凋亡的平行策略[9]。

PE_PGRS41通過阻斷固有免疫應答和抑制宿主的防御功能來增強細菌在巨噬細胞內的生存能力，主要表現(xiàn)為抑制巨噬細胞活化、產生促炎細胞因子，從而抑制巨噬細胞發(fā)生凋亡和自噬，進而延長MTB在細胞內的存留時間，有助于MTB的潛伏性感染[24]。PE_PGRS62重組恥垢分枝桿菌感染巨噬細胞后，巨噬細胞的細胞因子表達受到干擾，細胞凋亡受到抑制，內質網應激反應明顯減弱，PE_PGRS62通過破壞內質網應激介導的細胞凋亡促進細菌在巨噬細胞內持續(xù)存活[25]。PE_PGRS18是細胞壁相關蛋白，改變宿主細胞產生細胞因子IL-6、IL-1β、IL-12p40和IL-10，減弱細胞凋亡，加強胞內寄生[26]。

5.2.2 促進凋亡 PE_PGRS5是在基因水平轉移研究中發(fā)現(xiàn)存在于結核分枝桿菌復合群特異基因島區(qū)域的一種T淋巴細胞抗原。感染人類巨噬細胞后4 h表達下調；蛋白質組分析顯示，感染后90 d的肺部肉芽腫中存在PE_PGRS5蛋白。PE_PGRS5蛋白定位于宿主細胞內質網，上調未折疊蛋白反應（unfolded protein response, UPR）靶分子GRP78/GRP94和CHOP/ATF4表達，細胞內一氧化氮和活性氧類物質（reactive oxygen species, ROS）產生增多，致使內質網功能紊亂持續(xù)；同時，PGRS結構域通過TLR4介導胞內Ca2+釋放、破壞細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)，巨噬細胞最終啟動caspase8依賴的細胞程序死亡，肉芽腫內細菌得以釋放、傳播[11]。PE_PGRS33和PE_PGRS17通過上調TNF-α分泌，促進巨噬細胞凋亡[12]。

5.3 結合鈣離子 鈣結合蛋白通過與宿主細胞鈣離子結合，改變胞內Ca2+濃度，在介導巨噬細胞與病原體的黏附和信號活化方面發(fā)揮重要作用[27]。PE_PGRS家族蛋白的PGRS結構域普遍存在鈣結合蛋白序列，與Ca2+高親和，介導MTB與宿主細胞的相互作用，促進MTB入侵巨噬細胞，通過TLR2激活相應信號通路，調節(jié)一系列促炎因子和抗炎因子的分泌，維持細菌的胞內持續(xù)存留時間，細胞內鈣離子促進了MTB PE_PGRS蛋白與宿主細胞膜的結合。PE_PGRS33和PE_PGRS61與鈣結合后，上調抗炎因子IL-10的分泌，是結核病發(fā)病的關鍵因素。由此可見，拮抗PE_PGRS蛋白與鈣離子的結合可能是抗結核病治療的新方向。

5.4 其他 此外，PE_PGRS家族各成員還通過多種個性化手段抵抗宿主的免疫防御機制在巨噬細胞內生存繁殖。部分家族蛋白可通過調節(jié)炎癥細胞因子的分泌逃避免疫殺傷，持續(xù)在細胞內增殖存留。表達PE_PGRS30和PE_PGRS62的恥垢分枝桿菌感染巨噬細胞后明顯減少促炎因子IL-12、TNF-α和IL-6的釋放，增進細菌胞內存活能力，其基因失活后，分枝桿菌在巨噬細胞中的復制能力和在肉芽腫中的持留能力明顯降低[28]。PE_PGRS17通過改變巨噬細胞內致炎細胞因子的釋放而增強自身生存能力、加強致病菌的毒力。表達PE_PGRS17基因的重組恥垢分枝桿菌既能促進宿主細胞分泌IL-10抑制宿主免疫反應，又能誘導巨噬細胞依賴ERK活性上調TNF-α分泌，加速宿主細胞炎癥死亡，在促進巨噬細胞大量死亡的同時，通過聚集在少量存活的巨噬細胞中繼續(xù)存留，推測PE_PGRS17可能在MTB感染不同階段發(fā)揮不同的調節(jié)作用。PE_PGRS11 C末端編碼一種功能性磷酸甘油酸變位酶（phosphoglycerate mutase），在肺泡上皮細胞通過觸發(fā)TLR2依賴的Bcl2和COX-2的表達增強對氧化應激的抵抗力，有助于MTB在氧化應激條件下生存。PE_PGRS63在持續(xù)感染期間負責提供脂肪酸作為細菌生長的能量來源。PE_PGRS47在MTB入侵巨噬細胞后表達上調，分泌到感染細胞的胞質或胞膜，抑制巨噬細胞自噬，但具體機制尚不清楚[29]。

6 結語

PE_PGRS是一個功能極其復雜的MTB特異的多態(tài)性蛋白家族，成員眾多、序列多變、差異表達。迄今為止的多數(shù)研究只集中于其中少數(shù)幾個成員的結構和功能，揭示的只是這個龐大家族的冰山一角。家族成員之間的相互關系、基因表達調控方式、信號調節(jié)通路及在宿主免疫調節(jié)整體網絡中的確切機制均有待于進一步闡明，唯有此才能為結核病的治療、預防及檢測提供準確、特異靶位點，開啟結核病研究新領域。