曲長萍 田君 王寧 霍會蠶 盧慧芳

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 開封 475000)

子宮頸癌是威脅婦女健康的第四位惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，全球年新發(fā)病例約60.4萬例，死亡約34.2萬例〔1〕。在發(fā)達(dá)國家，行之有效的篩查方案及人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗的普及將宮頸癌的發(fā)生率和死亡率減半，調(diào)查結(jié)果顯示目前約85%的新發(fā)病例及90%的死亡病例發(fā)生在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)〔2，3〕。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的始動因素〔4〕。80%的女性一生中至少感染過一次HPV，但發(fā)展為宮頸癌的風(fēng)險不到1%〔5〕，因此單純HPV感染不足以使宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及無限增殖，由此，針對宮頸癌發(fā)生的相關(guān)分子機制一直都是研究的熱點。Hippo信號通路與人類多種惡性腫瘤有關(guān)，且與腫瘤的惡性表型及患者預(yù)后密切相關(guān)〔6〕,Yes相關(guān)蛋白(YAP)與轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基(TAZ)是Hippo通路下游的主要效應(yīng)因子，作為細(xì)胞外應(yīng)力作用調(diào)控細(xì)胞命運的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，二者在調(diào)節(jié)組織再生及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔7〕。本研究探討YAP/TAZ蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)及二者與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。一是為Hippo信號通路參與宮頸癌的發(fā)病機制提供一定的參考依據(jù)，二是為尋找宮頸癌新的腫瘤分子標(biāo)記物及潛在的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床樣本收集 選取2020年1月至2021年12月河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦科行手術(shù)治療的宮頸癌患者98例，其中65例病理診斷為宮頸癌并行廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的患者。其中鱗癌57例，腺癌8例；宮頸癌分期采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2018年的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰb2期13例，Ⅱa1期35例,Ⅱa2期17例；按腫瘤分化程度分為高分化10例，中分化36例，低分化19例；根據(jù)病理證明盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為有轉(zhuǎn)移22例，無轉(zhuǎn)移43例。對照組33例選自同期因子宮良性病變(子宮平滑肌瘤、子宮腺肌病等)行子宮全切術(shù)的正常宮頸標(biāo)本，術(shù)前HPV檢測陰性，術(shù)后病理證實無宮頸病變。宮頸癌組年齡33～71歲，平均54.15歲，對照組年齡34～57歲，平均52.58歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、急性生殖道感染或其他嚴(yán)重疾病、就診前接受放化療等特殊治療、精神異?；蛴袦贤ㄕ系K，臨床及病理資料完整。所有參加本研究對象或其法定代理人自愿接受此項研究并簽署知情同意書，并已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2試劑與方法 主要試劑：兔抗人YAP多克隆抗體(APR10774G)、兔抗人TAZ多克隆抗體(APR10378G)均購自Proteintech公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠通用二抗(ab97040)購自DAKO公司；組化試劑盒二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3檢測YAP、TAZ的表達(dá) 兔抗人YAP多克隆抗體、兔抗人TAZ多克隆抗體均以1∶600稀釋。免疫組化SP法參照試劑盒說明書操作，包括脫蠟、水化，抗原修復(fù)，3% H2O2孵育5～10 min，3%牛血清白蛋白(BSA)血清封閉，滴加一抗37℃孵育1 h，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、二甲苯透明、封片等。

1.4結(jié)果判斷 采用免疫組化法檢測YAP和TAZ蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果判讀〔8,9〕由2名病理科醫(yī)師獨立完成，共同商議最終結(jié)果，YAP和TAZ均表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞染色為棕黃色，根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)目計分，染色強度：不染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細(xì)胞<25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；兩者乘積為最終結(jié)果：0～1分為陰性表達(dá)，2分及以上為陽性表達(dá)。

1.5統(tǒng)計分析 使用SPSS20.0進(jìn)行χ2檢驗及秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1YAP在宮頸癌組織與正常宮頸組織中表達(dá) YAP在宮頸癌組織中表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，在正常宮頸組織中不表達(dá)(圖1)。宮頸癌組YAP陽性表達(dá)率〔54例(83.07%)〕與正常組〔7例(21.21%)〕差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-5.940，P=0.000)。

2.2TAZ在宮頸癌組織與正常宮頸組織中表達(dá) TAZ在宮頸癌組織中表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，而在正常宮頸組織中很少表達(dá)或不表達(dá)(圖1)。宮頸癌組TAZ陽性表達(dá)率〔49例(75.38%)〕與正常組〔4例(12.12%)〕差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-5.909，P=0.000)。

宮頸癌組YAP

2.3YAP和TAZ表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系 YAP陽性表達(dá)與組織浸潤深度、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；TAZ與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期有統(tǒng)計學(xué)意義，而二者與年齡因素?zé)o統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 YAP和TAZ陽性表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系(n)

3 討 論

Hippo信號通路是最先在果蠅里通過遺傳篩選發(fā)現(xiàn)的〔10〕，該通路是1條由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶鏈，YAP/TAZ是該通路的主要效應(yīng)器，可調(diào)控組織穩(wěn)態(tài)、器官大小、組織再生和腫瘤進(jìn)展〔11〕，以可控的方式穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)〔12〕。Hippo通路處于激活狀態(tài)時，會磷酸化YAP/TAZ蛋白，從而保持細(xì)胞的自我更新與凋亡之間的平衡，當(dāng)Hippo通路失活時，去磷酸化的YAP/TAZ蛋白會打破這個平衡，因此Hippo通路的失控導(dǎo)致細(xì)胞和器官的過度生長，突顯了其在癌癥生物學(xué)中的重要意義〔13，14〕,目前已知，YAP/TAZ蛋白在直腸癌〔14〕、乳腺癌〔15〕、胃癌〔16〕、腎癌〔17〕等惡性腫瘤中呈過表達(dá),并且與癌癥患者低生存率呈正相關(guān)。因此，YAP/TAZ這兩種轉(zhuǎn)錄激活因子的抑制劑可能被用于癌癥的治療。

高危型HPV16和HPV18相關(guān)宮頸癌占宮頸癌總數(shù)的70%以上〔18〕。而HPV基因的2個早期基因區(qū)的E6和E7基因在細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是病毒致癌的主要驅(qū)動力，除了它們很好地抑制了p53和pRb腫瘤抑制基因的失活外，還調(diào)節(jié)部分基因轉(zhuǎn)化的信號通路〔19，20〕。研究表明，YAP表達(dá)與HPV感染有關(guān)，HPV E6蛋白可抑制YAP蛋白降解，HPV E7蛋白通過靶向PTPN14促進(jìn)YAP蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)，HPV E6/E7誘導(dǎo)的YAP蛋白累積并釋放至細(xì)胞核，這可能是通過Hippo通路促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞增殖并導(dǎo)致癌變的機制〔21，22〕。因此，HPV可通過誘導(dǎo)Hippo-YAP/TAZ通路中YAP的激活共同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

He等〔23〕研究顯示，69例宮頸癌YAP的強陽性表達(dá)高達(dá)71.88%，弱陽性表達(dá)率為18.80%。Xiao等〔24〕的研究顯示，免疫組化法研究YAP在10例宮頸炎標(biāo)本、104例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ～Ⅱ及34例宮頸鱗癌標(biāo)本中表達(dá)情況，在慢性宮頸炎標(biāo)本細(xì)胞質(zhì)中YAP呈陰性或弱表達(dá)，宮頸癌組織較CIN組織中YAP的表達(dá)較強。另外在一個樣本量194例宮頸癌標(biāo)本中的研究顯示，TAZ陽性表達(dá)率為84.54%〔25〕。本研究結(jié)果與上述研究相符。

張雯等〔26〕通過免疫組化法和細(xì)胞轉(zhuǎn)染及干擾實驗對80例宮頸癌標(biāo)本的研究顯示，Hippo通路最主要的激酶組分大腫瘤抑制基因(LATS)1蛋白在45%的宮頸癌組織中低表達(dá)，LATS1的低表達(dá)與FIGO分期及腫瘤分級呈正相關(guān)，提示LATS1表達(dá)下調(diào)與宮頸癌腫瘤發(fā)展進(jìn)程相關(guān)。因LATS1/2是激酶級聯(lián)反應(yīng)鏈中的作用元件，是YAP的上游調(diào)控因子，磷酸化的LATS1/2與Mps-結(jié)合者激酶激活因子(MOB)1形成LATS1/2-MOB復(fù)合物，進(jìn)一步促進(jìn)YAP、TAZ發(fā)生磷酸化，而當(dāng)LATS1表達(dá)下調(diào)，YAP/TAZ去磷酸化核轉(zhuǎn)位后與轉(zhuǎn)錄因子TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(TEAD)1～4結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、抑制凋亡等〔27〕，Sun等〔28〕研究表明通過敲除LATS1基因，增加了YAP積累，促進(jìn)原發(fā)性肝癌的遷移和侵襲，這與YAP調(diào)節(jié)有關(guān)。Li等〔29〕研究發(fā)現(xiàn)許多微小RNA通過抑制LATS1/2的轉(zhuǎn)錄，增加YAP的活性，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和耐藥能力。Li等〔30〕發(fā)現(xiàn)通過增強YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌生長，并且YAP過表達(dá)與其預(yù)后不良因素相關(guān)。本研究進(jìn)一步證實了YAP/TAZ在宮頸癌組織中高表達(dá)，且與宮頸癌不良預(yù)后相關(guān)。同時揭示了YAP與TAZ同為Hippo信號通路中同源輔助轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)作用，共同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，今后深入探究其調(diào)控機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將為宮頸癌患者預(yù)后的評估及尋找治療的潛在藥物靶點提供依據(jù)。