林顯文 喬國艷

(成飛醫(yī)院 1干部保健科，四川 成都 610031；2神經(jīng)內(nèi)科)

缺氧性心臟病是由冠狀動脈硬化所致血管管腔狹窄阻塞，或冠狀動脈功能改變引起心臟正常供血功能受阻，進而發(fā)生心肌缺血缺氧導致心肌細胞損傷〔1〕。作為心臟生理功能的基礎(chǔ)單元，心肌細胞處于損傷狀態(tài)時，心肌細胞的基礎(chǔ)代謝受到影響，心臟物質(zhì)及能量交換均處于不正常狀態(tài)，甚至基本的心臟形態(tài)也會隨之改變，誘發(fā)惡性心臟事件出現(xiàn)〔2〕。缺血再灌注損傷是阻礙缺氧性心臟病患者在再灌注治療中獲益的主要問題，研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注會提高心肌細胞凋亡的比例〔3〕，因此明確心肌細胞在缺血再灌注中的損傷及凋亡機制一直是心血管疾病研究的熱點。心肌細胞損傷和凋亡，受許多信號通路和調(diào)控因子的影響，是體內(nèi)的一種復雜的生物反應過程〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)Ras同源基因家族蛋白(Rho)A/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)在心血管疾病中表現(xiàn)出來的對心肌細胞的保護作用引起關(guān)注〔5〕。研究表明通過抑制RhoA/ROCK能夠促進心肌梗死后充質(zhì)肝細胞的歸巢，減輕心肌梗死的癥狀〔6〕。RhoA/ROCK已成為心血管疾病分子靶向治療的研究新方向。但是RhoA/ROCK信號通路在心肌缺血再灌注損傷中的作用鮮有報道。本研究通過體外構(gòu)建心肌細胞缺氧/復氧模型，探討RhoA/ROCK在缺血再灌注的心肌細胞損傷與凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑和儀器 H9C2細胞(上海中科院細胞庫)；RhoA-siRNA重組腺病毒載體及空載質(zhì)粒Ad5-EGFP購自上海吉瑪生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基(TOYOBO)；Trizol 試劑盒(TaKaRa)；Hoechst 33258 染色試劑、DCFH-DA 染液、Rh123染色劑(美國Abcamn公司)；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、RhoA、SDF-1α、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Jackson公司)；Transwell小室(美國BD公司)； Western印跡試劑盒(美國Sigma公司)；全蛋白抽提試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)含量試劑盒(德國QIAGEN公司)；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(美國vector公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Amresco公司)；蘇凈Airtech超凈工作臺(北京六一儀器廠)；SANYO MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱(美國強生公司)；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司)；5810R 型高速離心機(日本島津公司)；微量移液槍(美國Promega公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，美國Corning公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Beckma公司)。

1.2方法

1.2.1心肌缺氧復氧損傷模型的建立及分組處理 細胞分為正常組、模型組、對照組(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒Ad5-EGFP)、RhoA-siRNA組(轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA)。將H9C2細胞接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件37℃，5%CO2，當貼壁細胞生長密度達85%時，25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期H9C2細胞進行轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine3000通過脂質(zhì)體介導法，將濃度均為200 nmol/L的空載質(zhì)粒Ad5-EGFP和RhoA-siRNA重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染至H9C2細胞，轉(zhuǎn)染操作完成后，37℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)細胞48 h后進行后續(xù)實驗。

除正常組外，模型組、對照組、RhoA-siRNA組細胞構(gòu)建心肌缺氧復氧損傷模型，方法如下： 在37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2 細胞，當細胞生長密度超過60%以后，更換培養(yǎng)基，添加等量不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，將細胞放在37℃、5%CO2、95%N2的缺氧培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)板，用移液槍把原來的培養(yǎng)液吸除后，再次更換培養(yǎng)基，添加相同體積的10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，將細胞放在37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，即為缺氧復氧心肌細胞模型。正常組H9C2細胞始終常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2顯微鏡下觀察細胞H9C2形態(tài)學變化 調(diào)整細胞濃度至1×104個/ml接種于6孔板中，分組處理同上， 37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細胞生長狀態(tài)及形態(tài)變化。

1.2.3各組心肌細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的檢測 調(diào)整細胞濃度至3×106個/ml接種于24孔板中，分組處理同上，37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗2次，轉(zhuǎn)移至5 ml無菌EP管中，1 000 r/min離心5 min，留取沉淀，添加5 μl的10 μmol/L DCFH-DA 染液，37℃避光孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min。上熒光顯微鏡觀察，并且用Image J1.41軟件對綠色熒光強度進行統(tǒng)計分析。

1.2.4各組心肌細胞線粒體膜電位的檢測 參照JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書，依次完成實驗步驟，將轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)48 h后，在不同波長下觀察細胞顯色水平，其中紅色熒光：激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長580 nm；綠色熒光：激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm 觀察。使用計算機采集熒光圖像，Image J軟件重疊紅綠熒光，將合成熒光的紅、綠色熒光光密度比值作為膜電位表達水平值。

1.2.5彗星實驗測定各組心肌細胞DNA損傷程度 調(diào)整細胞濃度至5×105個/ml接種于6孔板中，分組處理同上，37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將各組細胞分別與凝膠以1∶10比例混合后鋪片，經(jīng)制片、細胞裂解、解旋、電泳、中和、脫水等步驟后制成單細胞凝膠標本，標本經(jīng)SYBR膠體染料染色20 min后，實驗操作必須在避光下進行，以避免光線引起的DNA的額外損傷。在熒光顯微鏡下拍照觀察，并采用KOMET8.0圖像軟件分析圖像以指標Olive尾矩來評價DNA的損傷程度。

1.2.6各組心肌細胞凋亡的測定 調(diào)整細胞濃度至1×105個/ml接種于24孔板中，分組處理同上，37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS 緩沖液沖洗2 次，每次5 min，4%甲醛固定10 min，PBS 沖洗3次，每次5 min，加入5 mg/L Hoechst 33258 染色試劑，室溫下封閉孵育30 min，PBS 沖洗2次。在熒光顯微鏡下觀察，熒光顯微鏡下，正常細胞因為染色質(zhì)分布均勻，細胞核被染成均勻藍色，而凋亡細胞由于核質(zhì)固縮嚴重、核膜碎裂被染成明亮的藍色。

1.2.7Western印跡檢測各組心肌細胞中Bax、Bcl-2、RhoA、ROCK1、ROCK2的表達 調(diào)整細胞濃度，分組處理同上，37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照細胞濃度1×106個/ml加入300 μl的放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min，離心10 min，收集上清液，采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和結(jié)合緩沖液混合，進行SDS-PAGE(5%濃縮膠，10%分離膠)，每孔上樣量25 μl，電泳結(jié)束后，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，加入預稀釋的一抗，4℃過夜，TBST充分洗膜后加入二抗，37℃孕育2 h，加入ECL顯色液，室溫避光顯色30 min，采用E-Gel Imager自動凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細胞形態(tài)學變化觀察 倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)學改變，正常組細胞生長旺盛，形狀規(guī)整，多呈梭形，排列均一，細胞核形狀規(guī)則且清晰可辨，核質(zhì)間隙清楚，細胞內(nèi)容物均勻透明，細胞膜結(jié)構(gòu)完整，膜表面平滑無褶皺；與正常組細胞相比，模型組、對照組、RhoA-siRNA組細胞生長出現(xiàn)不同程度的緩慢，模型組細胞呈現(xiàn)十分明顯凋亡特征，大多數(shù)細胞已成圓形，胞體嚴重皺縮，細胞核固縮明顯，部分核膜已經(jīng)破裂，細胞膜雖然完整，但皺縮嚴重，胞膜結(jié)構(gòu)變性明顯，圓形漂浮細胞數(shù)目增多；對照組與模型組細胞相差不大，出現(xiàn)大量凋亡細胞；與模型組和對照組相比，RhoA-siRNA組細胞生長狀態(tài)良好，圓形漂浮細胞明顯減少，細胞核形狀趨于規(guī)則，核膜基本完整，凋亡現(xiàn)象較輕。見圖1。

圖1 顯微鏡觀察各組H9C2細胞的形態(tài)學變化(×200)

2.2細胞內(nèi)ROS水平的檢測 模型組H9C2細胞綠色熒光強度〔(7.80±0.56)×105U/ml〕明顯強于正常組〔(2.10±0.42)×105U/ml，P<0.05〕；RhoA-siRNA組H9C2細胞綠色熒光強度明顯弱于模型組(P<0.05)，對照組〔(7.65±0.64)×105U/ml〕與模型組差異不明顯(P>0.05)，見圖2。

圖2 各組心肌細胞內(nèi)活性氧水平的檢測(DCFH-DA染色，×400)

2.3各組心肌細胞線粒體膜電位的檢測 模型組H9C2細胞線粒體膜電位〔(80.50±7.78)%〕明顯高于正常組〔(6.58±0.42)%，P<0.05〕；RhoA-siRNA組H9C2細胞線粒體膜電位〔(41.50±4.95)%〕明顯低于模型組(P<0.05)，對照組〔(78.50±4.19)%〕與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 各組心肌細胞線粒體膜電位的檢測(JC-1染色，×400)

2.4彗星實驗測定各組心肌細胞DNA損傷程度 模型組H9C2細胞的Olive尾矩〔(77.82±7.07)μm〕明顯長于正常組〔(15.56±2.24)μm，P<0.05〕，RhoA-siRNA組H9C2細胞的心肌細胞Olive尾矩〔(47.54±4.78)μm〕明顯短于模型組(P<0.05)，對照組〔(74.68±8.36)μm〕與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

2.5各組心肌細胞凋亡的測定 模型組細胞凋亡率、Bax的表達水平明顯高于正常組(P<0.05)，Bcl-2的表達水平明顯低于正常組(P<0.05)；RhoA-siRNA組細胞凋亡率、Bax的表達水平明顯低于模型組(P<0.05)，Bcl-2的表達水平明顯高于模型組(P<0.05)；對照組與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5、6，表1。

圖5 各組心肌細胞凋亡的測定(Hoechst33258染色，×200)

圖6 Western印跡檢測與凋亡相關(guān)的蛋白Bax、Bcl-2的表達

2.6Western印跡檢測各組心肌細胞中RhoA、ROCK1、ROCK2的表達 模型組心肌細胞RhoA、ROCK1、ROCK2的表達水平明顯高于正常組(P<0.05)，RhoA-siRNA組RhoA、ROCK1、ROCK2的表達水平明顯低于模型組(P<0.05)，對照組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖7。

表1 各組心肌細胞凋亡率、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達的比較

圖7 Western印跡檢測RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白的表達

3 討 論

心肌細胞凋亡失常是心血管疾病中最重要的病理學改變，尤其是心臟再灌注治療之后的心肌細胞凋亡已成為手術(shù)成敗的關(guān)鍵因素〔7〕，國內(nèi)外的眾多學者就心肌細胞的異常凋亡開展大量的研究。已有研究表明阻止心肌細胞在遭受刺激時引發(fā)的損傷能夠明顯的抑制心肌細胞的凋亡〔8〕。已有研究證實機體內(nèi)多種信號分子調(diào)控或者參與心肌細胞的損傷及凋亡〔9〕。心臟是能量消耗較高的器官，線粒體是細胞進行能量代謝的場所。研究表明心臟能量代謝失常是心肌細胞凋亡的始動事件，線粒體膜電位的下降是心肌細胞早期凋亡的標志性事件，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的比值降低是啟動線粒體凋亡途徑的開關(guān)〔10〕。研究報道稱缺血再灌注后心肌細胞Bcl-2的表達減少， Bax的表達增加，心肌細胞凋亡率升高〔11〕。有學者研究證實在對心肌缺血再灌注大鼠進行抗細胞凋亡干預后，明顯改善了大鼠的心功能及減小其心臟發(fā)生微梗死的面積〔12〕。另有研究報道改善缺血再灌注大鼠的線粒體功能，調(diào)控Bcl-2與Bax的表達比值，提高其線粒體膜電位，恢復心肌細胞線粒體的能量代謝過程，能明顯降低心肌細胞的凋亡率〔13〕。此外，氧化應激在細胞的生長過程中發(fā)揮重要作用，而由自由基介導的細胞過氧化損傷可嚴重損傷細胞DNA，線粒體是含有大量抗氧化酶的細胞器，可及時清除活性氧自由基，一旦受到損傷，不僅造成功能降低，還會使細胞因過高的氧化應激水平而發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果說明在缺氧/復氧過程中，心肌細胞會因線粒體損傷而提高細胞氧化應激水平從而發(fā)生凋亡。

RhoA/ROCK通路是機體內(nèi)重要的信號通路，Rho是小分子G蛋白的成員之一，常作為信號轉(zhuǎn)導的分子開關(guān)，直接參與調(diào)控細胞形態(tài)維持、細胞黏附與遷移、平滑肌收縮等多種細胞生物效應〔14〕。ROCK主要包括ROCK1和ROCK2兩種亞型，是RhoA下游最重要的效應器，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，在細胞增殖與凋亡，黏附與分裂中發(fā)揮重要作用〔15〕。Yasue等〔16〕臨床研究表明RhoA/ROCK通路與冠狀動脈的病變密切相關(guān)。實驗數(shù)據(jù)證明抑制RhoA/Rho通路后，ROCK的轉(zhuǎn)錄功能降低，能夠明顯抑制心肌細胞的凋亡，改善慢性心力衰竭大鼠的左心室重構(gòu)〔17〕。Cui等〔18〕研究證實對缺血再灌注大鼠進行法舒地爾(RhoA/ROCK通路抑制劑)治療后，其線粒體功能明顯恢復，心臟的能量代謝和心功能明顯改善。另有研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK通路可通過促進線粒體損傷而提高細胞的氧化應激水平〔19〕。本研究結(jié)果表明抑制RhoA/ROCK通路，能明顯改善缺氧/復氧心肌細胞的損傷。