陶勁 何益平 趙常春 樊藝

(重慶市中醫(yī)院 1腫瘤科，重慶 400021；2重癥醫(yī)學(xué)科)

在肝切除、肝移植、肝創(chuàng)傷修復(fù)等臨床手術(shù)中，肝門阻斷引起肝臟的缺血再灌注損傷幾乎是不可避免的〔1〕，會產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起各種病理生理問題，嚴(yán)重威脅患者身心健康〔2〕。Kupffer細(xì)胞(KCs)是定居于肝血竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞，具有吞噬功能、處理和傳遞抗原、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答等作用〔3〕，其在調(diào)節(jié)肝臟免疫中起重要作用〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，KCs參與介導(dǎo)肝臟再灌注損傷，激活的KCs即可通過高表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB及表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86等誘導(dǎo)分泌炎癥因子及大量的氧自由基、Th1類細(xì)胞因子，引起急性炎癥反應(yīng)及肝臟缺血再灌注損傷〔5〕，又可通過上調(diào)細(xì)胞相關(guān)自殺因子(FasL)表達(dá)，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡及促進(jìn)Th2分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而通過抑制免疫反應(yīng)負(fù)向調(diào)控肝臟缺血再灌注損傷〔6〕。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白(Tim)-4可在KCs表達(dá)，在調(diào)控機(jī)體免疫功能中發(fā)揮著重要作用〔7〕。Tim-4與Tim-1相結(jié)合，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，誘導(dǎo)Th1/Th2免疫平衡向Th2偏移，參與哮喘、過敏及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程〔8〕，因此推測Tim-4參與調(diào)解KCs的免疫功能。本研究通過過表達(dá)Tim-4、Tim-4-shRNAs質(zhì)粒及Tim-4單克隆抗體處理KCs，探討Tim-4對KCs分泌Th1/Th2類細(xì)胞因子及抗原呈遞功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性BALB/c小鼠3只，8～10周齡，體重16～22 g，許可證號：SCXK(川)2017-0041，成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供。在自然光照，清潔、安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)，定時(shí)更換飼料、飲水、清理鼠籠。

1.2主要試劑與儀器 TIM-4、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Percoll原液(批號SY0531-CRI)購自北京百奧萊博科技有限公司；小鼠Tim-4Tim-4-shRNAs質(zhì)粒(批號ABIN3540482)、Tim-4過表達(dá)質(zhì)粒(批號ABIN3336325)購自Genemics-online公司；脂多糖(LPS，批號L8880)、RPMI1640培養(yǎng)基(批號31800)、胎牛血清(FBS，批號11011-8611)、磷酸鹽緩沖液(PBS，批號P1022)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(批號T1300)、100×青鏈霉素混合液(批號P1400)、凝血酶(批號T8021)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(批號P1200-50T)均購自Solarbio公司；CD80-PE(批號130-102-613)、CD86-PE(批號130-102-604)、CD40-異硫氰酸熒光素(FITC，批號130-102-533)購自上海恒斐生物科技有限公司；MCH-Ⅱ-FITC(批號130-081-601)購自天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基(批號51985091)、LipofectamineTM2000(批號11668019)購自美國Invitrogen公司；卵清蛋白(批號9006-59-1)購自Sigma公司；T細(xì)胞分離用尼龍毛柱(批號143-07041)購自上海新睿生物科技有限公司；RNAiso Plus(批號9108)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號RR037Q/A/B)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(批號639519)均購自TaKaRa公司；兔源GAPDH一抗(批號ab181602)、兔源Tim-4一抗(批號ab47637)、兔源CD68一抗(批號ab125212)、羊抗兔二抗(批號ab150077)、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(批號ab208348)、白細(xì)胞介素(IL)-1β ELISA試劑盒(批號ab100704)、IFN-γ ELISA試劑盒(批號ab252352)、IL-10 ELISA試劑盒(批號ab108870)均購自Abcam公司；親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)免疫組化試劑盒(批號PK-6100)購自美國Vector Laboratories公司；膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV)-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(批號V13242)購自美國Cell Singaling Technology公司；CKK-8試劑盒(批號C0037)、RIPA裂解液(批號P0013K)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號P0011)購自碧云天生物技術(shù)研究所。Eclipse E200實(shí)驗(yàn)室教學(xué)生物顯微鏡購自日本尼康公司；小型垂直電泳系統(tǒng)、Elx800酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；3900型高通量DNA合成儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)購自德國 Eppendorf 股份公司；XB-70制冰機(jī)、恒溫水浴鍋，購自上海析達(dá)儀器有限公司。

1.3完全培養(yǎng)基的配制及KCs的分離、培養(yǎng)、鑒定 完全培養(yǎng)基：在RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、鏈霉素混合液混勻。參照文獻(xiàn)〔9〕，采用乙醚吸入麻醉BALB/c小鼠，固定于鼠板上，75%酒精噴灑消毒，在無菌操作臺中逐層打開腹腔，暴露下腔靜脈、門靜脈，用10 ml注射器吸入37℃預(yù)熱的D-Hank液，穿刺門靜脈近端，剪斷下腔靜脈放血，緩慢灌注肝臟，待肝臟顏色從紅色變成黃白色，改用5 ml 37℃預(yù)熱的Ⅳ型膠原酶灌注，然后無菌取得肝臟，以PBS漂洗后剪碎，轉(zhuǎn)入50 ml離心管中加入10 ml Ⅳ型膠原酶，37℃水浴中孵育消化30 min，200目篩網(wǎng)過濾得細(xì)胞懸液，加入PBS至50 ml，4℃離心，300 g，5 min，重復(fù)4次，所得細(xì)胞沉淀備用。以PBS稀釋Percoll原液得到75%、25%濃度的Percoll液，75%濃度的在底層，25%濃度的在中層，頂層緩慢加入細(xì)胞懸液2 ml，4℃離心，500 r/min，15 min，兩層Percoll液層面之間出現(xiàn)一層白色絮狀物，吸管小心吸出，置于另一離心管，加入PBS，4℃離心，300 r/min，5 min，重復(fù)1次，取細(xì)胞沉淀，加入完全培養(yǎng)基重懸后備用。取上述細(xì)胞液接種于24孔板，置于37℃、5%CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至85%左右時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗，6個(gè)孔細(xì)胞以4%多聚甲醛固定，加入1%過氧化氫，室溫孵育5 min，加入1.5%血清，室溫封閉2 h，加入CD68一抗，4℃孵育過夜，然后使用ABC免疫組化試劑盒進(jìn)行免疫組化染色，操作步驟按照說明書，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況并拍照。配制0.4%臺盼藍(lán)染液，加入6個(gè)培養(yǎng)孔，對細(xì)胞進(jìn)行染色，死亡細(xì)胞可被染為藍(lán)色，活細(xì)胞拒絕藍(lán)染，以此觀察判斷細(xì)胞活性。

1.4細(xì)胞分組1.3中的細(xì)胞液接種至12孔板，置于37℃、5%CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，隨機(jī)分為對照組、Tim-4過表達(dá)組、Tim-4-shRNAs組、Tim-4單克隆抗體組。Tim-4過表達(dá)組、Tim-4-shRNAs組細(xì)胞各取50 μl Opti-MEM減血清培養(yǎng)基置于2個(gè)Ep管中，分別向其中加入1 μl LipofectamineTM2000、質(zhì)粒(Tim-4過表達(dá)或Tim-4-shRNAs質(zhì)粒)輕輕混勻，靜置5 min后將2個(gè)Ep管中溶液小心混勻，繼續(xù)靜置20 min，最后將其加入培養(yǎng)板中處理細(xì)胞，6 h后將Opti-MEM培養(yǎng)基換為細(xì)胞完全培養(yǎng)基，以100 ng/ml LPS活化〔10〕，在24 h后收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)基(質(zhì)粒濃度及處理時(shí)間參照說明書及前期預(yù)實(shí)驗(yàn))。Tim-4單克隆抗體組細(xì)胞根據(jù)抗體說明書的推薦及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，以終濃度2.5 μg/ml，的單克隆抗體處理細(xì)胞，以100 ng/ml LPS活化，24 h后收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)基。

1.5qRT-PCR及Western印跡檢測細(xì)胞中Tim-4表達(dá) 取1.4中收集的細(xì)胞，以RNAiso Plus提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在熒光PCR儀中進(jìn)行熒光定量PCR，操作步驟，反應(yīng)體系的配制，反應(yīng)條件的設(shè)定嚴(yán)格按照各個(gè)試劑盒的說明書進(jìn)行，使用GAPDH基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt算法分析數(shù)據(jù)，qRT-PCR引物序列為：GAPDH：正義鏈5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′,反義鏈5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′；Tim-4正義鏈5′-CTACAGACATAGCCGTACTCA-3′，反義鏈5′-GGATCCGAGAGTGAAGATCCCGTC-3′。取1.4中收集的細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，操作步驟嚴(yán)格按照各自說明書進(jìn)行，各組蛋白根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整濃度使之相同，使用SDS-PAGE試劑盒配制濃縮、分離膠，配制方法參照說明書，取20 μg蛋白進(jìn)行電泳分離，得到的目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，兔源GAPDH、Tim-4一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，羊抗兔二抗室溫孵育2 h，以電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，使用BioRad系統(tǒng)觀察拍攝條帶，以Quantity one軟件分析結(jié)果。

1.6流式細(xì)胞儀檢測各組KCs表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達(dá)水平 取1.4中收集的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基吹打均勻制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整密度為1×106個(gè)/ml，吸取1 ml細(xì)胞液置于EP管中，1 000 r/min離心5 min，細(xì)胞沉淀加入300 ml緩沖液及抗體CD80-PE、CD86-PE、CD40-FITC、MCH-Ⅱ-FITC輕輕吹打混勻，常溫避光孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，然后加入200 ml緩沖液混勻，使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.7ELISA檢測KCs分泌Th1/Th2類細(xì)胞因子水平 取1.4中收集的各組細(xì)胞培養(yǎng)液，使用ELISA檢測試劑盒檢測細(xì)胞因子水平，操作步驟參照說明書。

1.8混合培養(yǎng)KCs及T細(xì)胞后T細(xì)胞增殖、凋亡的檢測 參照文獻(xiàn)〔11〕，取BALB/c小鼠皮下注入卵清蛋白免疫2次，吸入乙醚麻醉，解剖取出脾臟，剪碎后，加入胰酶消化，過濾后得脾細(xì)胞懸液，取小鼠淋巴細(xì)胞分離液3 ml置于10 ml離心管中，向其中緩慢加入脾細(xì)胞懸液3 ml，2 000 r/min，4℃離心20 min，吸管輕輕吸取分離液與細(xì)胞懸液之間的一層白色絮狀物，置于另一離心管中以PBS洗滌細(xì)胞2次，4℃離心，1 500 r/min，5 min；加入完全培養(yǎng)基混勻得細(xì)胞懸液。根據(jù)文獻(xiàn)的方法，細(xì)胞懸液使用尼龍毛柱過濾后可得到純化的T細(xì)胞。純化的T細(xì)胞加入培養(yǎng)基吹打均勻制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整密度為5×105個(gè)/ml，將其與1.4中收集的各組KCs以10∶1的比例混合接種在96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)72 h后，加入CCK-8， 2 h后使用全自動酶標(biāo)儀中測定450 nm波長下各孔吸光度(OD)，計(jì)算各組T細(xì)胞的相對增殖率。相對增殖率(%)=處理組OD值/對照組OD值×100%。將5×105個(gè)/ml的T細(xì)胞與1.4中收集的各組KCs以10∶1的比例〔12〕混合接種在12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)72 h后，收集懸浮的T細(xì)胞，使用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，在流式細(xì)胞儀中檢測T細(xì)胞凋亡情況，操作步驟參照試劑盒說明書。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1KCs鑒定及活性檢測 KCs CD68強(qiáng)表達(dá)，免疫組化染色呈現(xiàn)深棕色；KCs呈貼壁生長，形態(tài)完整，輪廓清晰，拒絕臺盼藍(lán)染色，活性高，見圖1。

圖1 KCs鑒定及活性檢測(×200)

2.2各組KCs Tim-4 mRNA表達(dá) 與對照組相比，過表達(dá)Tim-4組細(xì)胞Tim-4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Tim-4-shRNAs組細(xì)胞Tim-4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Tim-4單克隆抗體組細(xì)胞Tim-4表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，見圖2、表1。

1～4：對照組，過表達(dá)Tim-4組，Tim-4-shRNAs組，Tim-4單克隆抗體組圖2 各組Tim-4蛋白表達(dá)

2.3各組KCs分泌Th1/Th2類細(xì)胞因子水平 與對照組相比，過表達(dá)Tim-4組細(xì)胞分泌Th1類細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平明顯降低，分泌Th2類細(xì)胞因子IL-10水平明顯升高(P<0.05)；Tim-4-shRNAs組、Tim-4單克隆抗體組細(xì)胞分泌Th1類細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平明顯升高，分泌Th2類細(xì)胞因子IL-10水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組KCs Tim-4 mRNA及蛋白表達(dá)和KCs分泌Th1/Th2類細(xì)胞因子水平比較

2.4各組KCs表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達(dá)水平 與對照組相比，過表達(dá)Tim-4組細(xì)胞表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；Tim-4-shRNAs組、Tim-4單克隆抗體組細(xì)胞表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見圖3、表2。

2.5各組KCs混合T細(xì)胞培養(yǎng)后T細(xì)胞增殖、凋亡比較 與對照組相比，過表達(dá)Tim-4組T細(xì)胞相對增殖率明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)；Tim-4-shRNAs組、Tim-4單克隆抗體組T細(xì)胞相對增殖率明顯升高，凋亡率明顯降低(P<0.05)，見表2、圖4。

表2 各組KCs表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD40、CD86表達(dá)和KCs混合T細(xì)胞培養(yǎng)后T細(xì)胞相對增殖率與凋亡率比較

圖4 各組KCs混合T細(xì)胞培養(yǎng)后T細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

缺血再灌注損傷是導(dǎo)致臨床各種肝臟手術(shù)后肝功能受損甚至肝衰竭的重要原因〔13〕。炎癥因子過度表達(dá)、炎癥細(xì)胞浸潤引起炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡是肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，KCs在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔14〕。KCs可改變促炎及抑炎細(xì)胞因子分泌水平、調(diào)控Th1/Th2平衡、介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的吞噬清除等過程〔15〕。KCs是體內(nèi)最大的抗原提呈細(xì)胞群，重要功能是抗原提呈及誘導(dǎo)初始T細(xì)胞活化、亞群分化及炎性細(xì)胞因子分泌等〔16〕，將LPS活化后的KCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)，通過檢測T細(xì)胞的增殖、凋亡情況可判斷KCs抗原提呈能力。Tim-4選擇性表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞群中，比如髓系來源的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，在機(jī)體免疫功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用，Tim-4是Tim-1的天然配體，Tim-1優(yōu)先表達(dá)于 Th2 細(xì)胞表面，兩者相結(jié)合，可激活Th2細(xì)胞，使之分泌IL-10抑炎因子，減輕炎癥反應(yīng)〔17〕。Tim-4還可與凋亡細(xì)胞表面分子(PtdSer)結(jié)合，促使凋亡抗原特異性T細(xì)胞及時(shí)有效清除凋亡細(xì)胞〔18〕，并可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌免疫抑制因子，誘導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞向Treg偏移，從而發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控效應(yīng)〔19〕，參照以上研究，可推測Tim-4可調(diào)控KCs分泌Th1/Th2類細(xì)胞因子及其抗原呈遞功能。本研究結(jié)果表示研究中分離得到的KCs純度高，活性好，為后續(xù)研究提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

本文后續(xù)研究結(jié)果表明，上調(diào)Tim-4可促使活化的KCs分泌IL-10，抑制其分泌TNF-α、IL-1β、IFN-γ，抑制其表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達(dá)，活化的KCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，上調(diào)Tim-4可抑制T細(xì)胞增殖，促使其凋亡。IL-10為Th2類抑炎因子，TNF-α、IL-1β、IFN-γ為Th1類促炎因子〔20〕，本文研究結(jié)果揭示Tim可誘導(dǎo)活化的KCs因子分泌譜向Th2類細(xì)胞因子偏移，減輕炎癥反應(yīng)，降低其抗原呈遞功能，對免疫起負(fù)調(diào)控作用。下調(diào)Tim-4可逆轉(zhuǎn)上述作用，為臨床預(yù)防及治療肝臟缺血再灌注損傷提供了新思路，但本文對Tim-4調(diào)控KCs抗原提呈功能的研究僅限于現(xiàn)象觀察，其詳細(xì)分子作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步探索。