范加琳 來賀歡 李荷 李歡歡 周海云 吳紹長(zhǎng)

(1麗水市第二人民醫(yī)院，浙江 麗水 323000；2麗水市中心醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)是以認(rèn)知障礙和晚期癡呆為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，是當(dāng)今最大的流行病和健康挑戰(zhàn)之一。目前AD的病理特征普遍認(rèn)為是淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經(jīng)原纖維(NFT，主要為高度磷酸化的tau蛋白)纏結(jié)和不同大腦區(qū)域的退行性改變〔1〕。AD具有復(fù)雜的多種致病因素，如遺傳因素、環(huán)境因素、免疫因素、抑郁癥或高血壓等〔2～4〕。這些因素中，遺傳因素約占AD風(fēng)險(xiǎn)的70%〔5〕。已知的引起AD的遺傳原因包括編碼淀粉樣前體蛋白(APP)，早老素(PSEN)1和PSEN2基因的顯著改變，這些基因增強(qiáng)了Aβ的產(chǎn)生和聚集。然而，APP、PSEN1和PSEN2僅是AD致病機(jī)制的一部分〔6，7〕。此外，遺傳學(xué)分析表明，AD的個(gè)體差異可能是由多個(gè)基因及其變異引起，這些基因發(fā)揮各種生物學(xué)功能，以協(xié)同調(diào)節(jié)疾病風(fēng)險(xiǎn)〔8〕。除了與AD發(fā)病機(jī)制有關(guān)的識(shí)別機(jī)制外，對(duì)潛在候選基因的全面分析可能會(huì)為AD的預(yù)測(cè)或診斷測(cè)試提供新策略。本文擬利用生物信息學(xué)分析挖掘AD相關(guān)基因芯片，尋找其差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，為AD的診斷及治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1基因表達(dá)芯片 GSE132903基因表達(dá)譜從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)下載。該表達(dá)譜來自GPL10558(Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip)。GSE132903數(shù)據(jù)集中包含195個(gè)樣本，包括正常對(duì)照組和AD患者的微陣列數(shù)據(jù)，樣本全部來自顳中回。

1.2差異基因分析 采用R語言和Bioconductor中的Limma數(shù)據(jù)包分析數(shù)據(jù)集中的差異基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05且差異倍數(shù)>0.5。

1.3差異基因功能富集分析 利用DAVID在線工具對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.4差異基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5關(guān)鍵基因(Hub)的篩選 利用Cytoscape在線軟件中的插件CytoHubba進(jìn)行篩選，其中包含11種關(guān)鍵基因篩選的算法。本研究選擇其中常用的6種算法，通過取交集得到最終的關(guān)鍵基因。

2 結(jié) 果

2.1差異表達(dá)基因 共得到319個(gè)差異表達(dá)基因，其中有201個(gè)下調(diào)基因，118個(gè)上調(diào)基因，見圖1。

紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因圖1 AD患者樣本與健康對(duì)照樣本差異表達(dá)基因的火山圖

2.2功能富集結(jié)果 AD患者與正常對(duì)照差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果表明，信號(hào)釋放、神經(jīng)遞質(zhì)功能、突觸功能等生物學(xué)過程與AD密切相關(guān)。突觸膜、運(yùn)輸小泡、運(yùn)輸囊泡膜、神經(jīng)元等細(xì)胞組分與AD的發(fā)生密切相關(guān)。GO富集分析的分子功能主要富集于鈣調(diào)素結(jié)合、SNARE復(fù)合體結(jié)合、突觸融合蛋白結(jié)合、離子通道活性等，見圖2。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織的配體-受體相互作用、突觸囊泡循環(huán)、胰島素分泌等通路對(duì)AD的發(fā)生密切相關(guān)，見圖3。

圖2 AD患者樣本與正常對(duì)照樣本差異表達(dá)基因GO富集和注釋結(jié)果

圖3 AD患者樣本與正常對(duì)照樣本差異表達(dá)基因KEGG富集和注釋結(jié)果

2.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用差異基因構(gòu)建的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中有239個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，與其他蛋白質(zhì)相互作用越多，節(jié)點(diǎn)越大，作用越強(qiáng)，連線越粗，見圖4。

圖4 AD患者樣本與正常對(duì)照樣本差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4關(guān)鍵基因篩選 基于cytoHubba中的6種算法，分別選取前10個(gè)關(guān)鍵基因然后取交集，最大集團(tuán)中心性(MCC)：SNAP25、SYP、SYN2、CPLX2、SYT4、CPLX1、STXBP1、NSF、SYT1、STX1A；最大鄰域分量(MNC)：SNAP25、SYP、GABRG2、SYT4、SYT1、GABRA1、GAD2、VAMP2、SYN2、NRXN1；度數(shù)(Degree)：SNAP25、SYP、SYT1、GABRG2、SYT4、GABRA1、GAD2、NRXN1、SYN2、GFAP；邊緣滲透分量(EPC)：SNAP25、SYP、GABRG2、SYN2、SYT4、SYT1、GAD2、NRXN1、GABRA1、CPLX2；接近中心性(Closeness)：SNAP25、SYP、GABRG2、GABRA1、GAD2、GFAP、SYT1、SYT4、STMN2、NRXN1；輻射度(Radiality)：SNAP25、SYP、GABRG2、GFAP、GABRA1、GAD2、STMN2、SYT1、SYT4、GAD1。最終得到SNAP25、SYP、SYT1、SYT4。

3 討 論

AD是一種遺傳上復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，雖然目前已有許多治療方法，但其治療效果差，給家庭和社會(huì)帶來很大負(fù)擔(dān)。到目前為止AD的發(fā)病原因尚不清楚，但tau蛋白的高度磷酸化、Aβ沉積等諸多因素，在AD的病理生理學(xué)中扮演重要角色。由于AD病因的多樣性，也因此提出了許多關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的假說。目前比較被認(rèn)可的假說包括膽堿能假說、Aβ假說、Tau 蛋白假說等〔9〕。

隨著研究的進(jìn)展，高通量微陣列技術(shù)與生物信息學(xué)分析相結(jié)合已被廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)各種疾病的潛在分子治療靶點(diǎn)中。本研究結(jié)果提示突觸功能在AD中發(fā)揮重要作用。突觸是大腦中記憶存儲(chǔ)和信息傳遞的基本單元，由突觸前部和突觸后部組成〔10〕。在AD患者大腦中各種突觸蛋白，如突觸前蛋白(SNAP)-25、突觸后蛋白(PSD)-95及突觸蛋白1和嗜鉻粒蛋白B(突觸小泡蛋白)，都在發(fā)生改變〔11，12〕。研究發(fā)現(xiàn)在AD動(dòng)物模型中存在LTP和LTD受損及突觸傳遞缺失〔13〕。神經(jīng)病理學(xué)研究表明，在輕度認(rèn)知障礙(MCI)階段，突觸功能異常已很明顯〔14〕。另外，突觸功能障礙與臨床疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)〔15〕。

進(jìn)一步進(jìn)行關(guān)鍵基因篩選獲得4個(gè)關(guān)鍵基因(SNAP25、SYP、SYT1、SYT4)均為突觸蛋白，共同參與突觸傳遞。SNAP25是一種廣泛分布的膜相關(guān)突觸前蛋白。SNAP25參與突觸小泡與質(zhì)膜的對(duì)接和融合，也是可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著蛋白受體(SNARE)復(fù)合物的重要組成部分，在神經(jīng)元的存活和認(rèn)知中起重要作用〔16～18〕。提示SNAP25可能是反映突觸可塑性的有用生物標(biāo)志物。SYP是一種突觸前囊泡膜蛋白，與神經(jīng)生長(zhǎng)、修復(fù)再生、突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性調(diào)節(jié)有關(guān)，是突觸前特異的標(biāo)志性蛋白，SYP的密度、分布間接反映突觸的數(shù)量和分布情況〔19〕。研究發(fā)現(xiàn)，SYP可通過神經(jīng)遞質(zhì)的磷酸化和釋放而影響突觸結(jié)構(gòu)并在突觸可塑性中起作用，進(jìn)而在AD的發(fā)展中起關(guān)鍵作用〔20，21〕。SYT1與SYT4屬于突觸結(jié)合蛋白家族，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放和腦的學(xué)習(xí)記憶等生理功能的主要蛋白之一。SYT1包含兩個(gè)Ca2+結(jié)合域C2A和C2B，且是突觸中主要的鈣傳感器之一〔22，23〕。研究發(fā)現(xiàn)，在AD小鼠模型和AD患者的大腦中，SYT1蛋白的表達(dá)降低，提示SYT1可能與AD中神經(jīng)功能的退化有關(guān)〔24〕。目前SYT4在AD患者發(fā)病過程中的作用尚未見報(bào)道，提示可能發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與AD發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因。