薛振宇 張世亮

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心病科,山東 濟(jì)南 250014)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者中，排除高血壓、缺血性心臟病后，存在明確的心肌結(jié)構(gòu)和功能變化的特異性心肌病[1]。終末期常并發(fā)心衰及心律失常，預(yù)后不良。目前治療以西藥為主，不良作用較多，糖脂代謝紊亂明顯，難以整體調(diào)節(jié)。

中醫(yī)學(xué)中，DCM相當(dāng)于“消渴”并發(fā)“真心痛”“胸痹”“心悸”的范疇[2]。復(fù)方丹參滴丸由丹參、三七、冰片組成，是心血管疾病臨床常用藥，臨床治療糖尿病合并心臟病方面也取得了一定成果[3]。但DCM臨床病理復(fù)雜，復(fù)方丹參滴丸治療DCM有效藥物成分作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過對(duì)藥物、靶點(diǎn)、蛋白互作用集成分析發(fā)現(xiàn),多數(shù)藥物是間接作用于多個(gè)靶點(diǎn),且靶點(diǎn)間也相互作用[4]，與中藥組方配伍，協(xié)同作用、系統(tǒng)治療的思想不謀而合。本研究應(yīng)用該方法，為明確復(fù)方丹參滴丸治療DCM機(jī)制提供臨床研究思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 復(fù)方丹參滴丸活性成分篩選 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取復(fù)方丹參滴丸藥物活性成分，以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測有效活性成分潛在作用靶點(diǎn)。并通過unitprot數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 糖尿病心肌病疾病靶點(diǎn)獲取與篩選 以“Diabetic cardiomyopathy”為關(guān)鍵詞，在OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索獲得DCM疾病靶點(diǎn)。同樣進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將藥物、成分、疾病和交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將藥物與DCM的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線平臺(tái)，物種限定為“Homo sapiens”(人)，構(gòu)建蛋白互作用關(guān)系圖；將上述數(shù)據(jù)以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，以大于Degree值平均值篩選核心作用靶點(diǎn)。

1.5GO功能和KEGG通路富集分析 將藥物與DCM交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，以P<0.05和FDR<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到復(fù)方丹參滴丸治療DCM的所有GO生物過程選取前10條制成條形圖，KEGG通路選取前20條制成氣泡圖展示。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方丹參滴丸有效活性成分及靶點(diǎn)收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢藥物活性成分，并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件，共得到復(fù)方丹參滴丸有效活性成分73個(gè)、潛在作用靶點(diǎn)133個(gè)。

2.2 復(fù)方丹參滴丸與糖尿病心肌病交集靶點(diǎn)Venn圖構(gòu)建 在OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索獲取DCM的疾病靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值后得到3652個(gè)靶點(diǎn)，將復(fù)方丹參滴丸有效藥物成分可作用的133個(gè)靶點(diǎn)映射到疾病中，獲得復(fù)方丹參滴丸治療糖尿病心肌病的102個(gè)潛在直接作用靶點(diǎn)，制成Venn圖展示。見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點(diǎn)Venn圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有179個(gè)節(jié)點(diǎn)，1341條邊。不同形狀、顏色的節(jié)點(diǎn)分別代表藥物、成分、DCM和交集靶點(diǎn)；邊代表互作用關(guān)系，以Degree值表示[5]。其中木犀草素(MOL000006)、槲皮素(MOL000098)、β-谷甾醇(MOL000358)、隱丹參酮(MOL007088)等成分的degree值較高，更可能是在復(fù)方丹參滴丸治療DCM時(shí)的核心活性成分。見圖2。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將藥物與DCM的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STING數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。圖中共102個(gè)節(jié)點(diǎn)，1050條邊，平均Degree值為27。得到的數(shù)據(jù)以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，將Degree值>27的靶點(diǎn)按值大小排序。見圖4。可見藥物成分與疾病靶點(diǎn)IL-6、VEGFA、TNF、TP53等的相關(guān)性更大，更具核心價(jià)值。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果 將復(fù)方丹參滴丸與DCM的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID在線數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得GO條目147條，其中生物過程(BP)36條、細(xì)胞組分(CC)44條、分子功能(MF)67條，交集靶點(diǎn)主要參與了對(duì)藥物的反應(yīng)、NO生物合成正調(diào)節(jié)、質(zhì)膜、細(xì)胞外空間、酶結(jié)合、藥物結(jié)合等生物過程。分別選取前10條制成條形圖展示。見圖5。到KEGG通路95條，靶基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、TNF信號(hào)途徑、癌癥信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，說明復(fù)方丹參滴丸可能通過以上通路參與治療DCM。見圖6。

圖5 GO功能富集分析結(jié)果

圖6 KEGG通路富集分析結(jié)果

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)分析，對(duì)復(fù)方丹參滴丸治療DCM的機(jī)制進(jìn)行較為全面的探討。分析結(jié)果顯示，復(fù)方丹參滴丸中有效化學(xué)成分共73種，其中木犀草素、槲皮素、β-谷甾醇、丹參隱酮等的degree值較高，在復(fù)方丹參滴丸治療DCM過程中更可能發(fā)揮核心作用。木犀草素可顯著增強(qiáng)胰島素敏感度，改善DM患者糖脂代謝紊亂[6]；抑制NO的釋放，阻斷氧化應(yīng)激，保護(hù)心肌細(xì)胞；降低TNF-α、IL-6的水平，減輕心肌炎癥反應(yīng)[7]。王建禮等[8]研究證明，槲皮素可以通過MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)糖脂代謝，減輕胰島素抵抗。同時(shí)減少炎癥因子分泌，阻礙心肌纖維化，減緩DCM疾病進(jìn)程[9]。β-谷甾醇有調(diào)控血脂、抗炎、抑瘤等功能[10]。隱丹參酮可減少TNF-α、IL-6等的產(chǎn)生，抗炎、調(diào)脂[11，12]。

由PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖可知，復(fù)方丹參滴丸在治療DCM過程中核心靶標(biāo)主要涉及IL-6、VEGFA、TNF、TP53等基因。IL-6的細(xì)胞毒性能損害胰島細(xì)胞，誘發(fā)胰島素抵抗；促進(jìn)成纖維細(xì)胞成熟，易引發(fā)心血管系統(tǒng)并發(fā)癥[13]。趙雁煥等[14]發(fā)現(xiàn)，丹參可降低血清IL-6、TGF-β1水平，抗心肌纖維化。DM患者VEGFA表達(dá)上調(diào),血管通透性增加，心肌纖維化加速[15]。范雅雯等[16]發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參滴丸可降低VEGF、TGF-β水平,調(diào)節(jié)脂代謝，改善心肌纖維化；TNF可激活MAPK通路，導(dǎo)致心肌纖維化，介導(dǎo)胰島細(xì)胞免疫損傷。陽玲[17]發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參滴丸可降低DM大鼠血清TNF-α、IL-6水平，改善糖脂代謝紊亂，降低胰島素抵抗發(fā)生率。TP53參與平滑肌細(xì)胞凋亡調(diào)控，高表達(dá)可減少心血管疾病發(fā)生；參與糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控[18]。

GO富集分析可見，復(fù)方丹參滴丸對(duì)DCM的治療，主要參與了NO生物合成過程的正調(diào)節(jié)、藥物反應(yīng)等生物過程，其中NO生物可用性降低是糖尿病性心肌病的標(biāo)志[19]。主要涉及質(zhì)膜、細(xì)胞外空間等細(xì)胞組分，酶結(jié)合、藥物結(jié)合等分子功能。KEGG富集分析顯示，核心靶點(diǎn)多富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用，這是包含所有發(fā)生于質(zhì)膜上的信號(hào)通路中受體配體相互作用的過程[20]。此外有TNF信號(hào)途徑、癌癥信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。TNF信號(hào)通路可參與心肌纖維化和對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[21]。經(jīng)典的癌癥通路包括PI3k-Akt信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等，涉及細(xì)胞生長、凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多過程。HIF信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)，協(xié)助心肌細(xì)胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)。但DCM患者HIF-1信號(hào)通路受損，心肌保護(hù)作用消失[22]。PI3K-Akt信號(hào)通路被抑制,可誘導(dǎo)DCM的發(fā)生發(fā)展[23]。綜上，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的生物過程及信號(hào)通路與相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究所示藥理作用吻合度較高。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和查閱相關(guān)文獻(xiàn)，明確了復(fù)方丹參滴丸治療DCM潛在作用機(jī)制多涉及抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制成纖維細(xì)胞生成、調(diào)節(jié)糖脂代謝等方面，可見藥物成分與DCM疾病靶點(diǎn)間聯(lián)系復(fù)雜，體現(xiàn)出中藥協(xié)同作用的特點(diǎn)?？蔀閺?fù)方丹參滴丸治療DCM提供臨床應(yīng)用依據(jù)，為后續(xù)機(jī)制研究提供思路和方向。