周智明, 李 靜, 陳張好, 伍英英, 陸土柳, 肖樹雄

(國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣東省藥品檢驗(yàn)所), 廣東 廣州 510525)

氧化型染料主要為苯胺類及苯酚類化合物,這些化合物有著不同程度的致敏和致畸性[1],在化妝品中使用時(shí)需嚴(yán)格控制,這一直是監(jiān)管的重點(diǎn)[2]。氧化型染料的準(zhǔn)確定量是分析檢測(cè)的難點(diǎn),一是由于染發(fā)膏膏體黏稠、基體溶散困難,溶散不充分會(huì)影響提取率;二是氧化型染料光、熱穩(wěn)定性差,樣品處理及分析時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)組分可能降解,測(cè)得含量偏低;三是染料組分多、使用濃度跨度大,檢測(cè)時(shí)各組分間往往存在相互干擾且可能同時(shí)需要進(jìn)行常量和痕量測(cè)定,并要求檢驗(yàn)結(jié)果與配方、標(biāo)簽比對(duì);四是苯胺類堿性物質(zhì)在流動(dòng)相中易離子化,色譜保留弱,固定相的鍵合方式及流動(dòng)相的酸堿度對(duì)峰形和保留影響明顯。所以針對(duì)氧化型染料,開發(fā)操作簡(jiǎn)便、定性定量準(zhǔn)確、適用不同應(yīng)用場(chǎng)景和檢測(cè)需求的檢測(cè)方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

大部分染料揮發(fā)性弱,氣相色譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法應(yīng)用受限[3,4],標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道中氧化型染料的測(cè)定以高效液相色譜(HPLC)[5,6]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[7,8]為主;樣品中不同染料含量差異大,同時(shí)進(jìn)行常量及痕量檢測(cè)易造成離子源污染,不適于采用HPLC-MS/MS直接測(cè)定,一般采用HPLC定量檢測(cè)、HPLC-MS/MS確證的解決方案?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)(以下簡(jiǎn)稱《規(guī)范》)[9]收錄了75種準(zhǔn)用染料及兩種液相色譜法:“7.1對(duì)苯二胺等8種組分”涵蓋組分少,已不能滿足監(jiān)督檢驗(yàn)的需求;“7.2對(duì)苯二胺等32種組分”覆蓋種類多、定量準(zhǔn)確,但需要分3個(gè)HPLC系統(tǒng);采用的C16柱和離子對(duì)試劑耐用性欠佳;樣品測(cè)定時(shí)存在干擾;缺乏質(zhì)譜確證方法,未能滿足監(jiān)督檢驗(yàn)未知物確認(rèn)程序需要。嚴(yán)巍等[10]采用C18柱,分3個(gè)HPLC系統(tǒng),根據(jù)pKa值調(diào)整流動(dòng)相及pH值的方式改善了峰形,但仍不能避免樣品的干擾問題。左雪等[11,12]建立了單一HPLC系統(tǒng)分別分離33種和40種染料,避免了樣品檢測(cè)中的干擾,但只覆蓋了《規(guī)范》中法定檢測(cè)的32種染料中的27種和29種常用成分,不能涵蓋目前監(jiān)督檢驗(yàn)要求的所有組分。

本研究?jī)?yōu)化了《規(guī)范》中法定檢測(cè)的32種氧化型染料的HPLC定量測(cè)定方法,并建立了HPLC-MS/MS確證方法。HPLC法將17種常用染料及3種較少用染料共20種組分作為Ⅰ組在HPLC條件1下完成分離,8種禁用染料及4種較少用染料共12種組分作為Ⅱ組在HPLC條件2下分離,其中一個(gè)HPLC條件中的相互干擾組分均在另一個(gè)HPLC條件下完全分離,避免了實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)組分間的干擾,并排除了32種以外的其他15種常用染料的干擾。在日常檢測(cè)時(shí),建議可優(yōu)先選擇HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定;當(dāng)出現(xiàn)相同保留時(shí)間下光譜吸收匹配存疑、檢出結(jié)果與標(biāo)簽/注冊(cè)資料不符時(shí),可采用HPLC-MS/MS法進(jìn)一步定性確證;當(dāng)樣品某組分含量低于HPLC法的定量濃度、存在雜質(zhì)峰干擾導(dǎo)致HPLC法無法準(zhǔn)確定量時(shí),可采用HPLC-MS/MS法定量確證。方法準(zhǔn)確可靠,專屬性強(qiáng),具有較好的適用性和通用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

SHIMADZU LC-20AT液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器); SCIEX Triple Quad 5500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;IkaLabDancer型渦旋混合器;Millipore Milli Q Reference型超純水發(fā)生器;Elma S300H超聲波清洗器;Mettler MSDU電子天平(十萬分之一)。

p-苯二胺、p-氨基苯酚、o-苯二胺、o-氨基苯酚、2-硝基-p-苯二胺、甲苯-3,4-二胺、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-3-羥基吡啶、p-甲基氨基苯酚硫酸鹽、2,6-二氨基吡啶、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、1-萘酚均購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司;甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、m-氨基苯酚、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、間苯二酚、4-氨基-2-羥基甲苯、2-甲基雷瑣辛、6-氨基-m-甲酚、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺鹽酸鹽、m-苯二胺、氫醌、4-硝基-o-苯二胺、4-氯雷瑣辛、2,7-萘二酚、N-苯基-p-苯二胺、1,5-萘二酚均購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(TCI); 2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、6-羥基吲哚均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司(MACKLIN)。所有對(duì)照品純度均大于96%。

甲醇、乙腈均為色譜純,購(gòu)自霍尼韋爾(中國(guó))有限公司;磷酸氫二鉀、無水乙醇、亞硫酸氫鈉、磷酸均為分析純,購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

磷酸鹽緩沖液:稱取三水合磷酸氫二鉀4.56 g,加水1 L溶解,混勻,制成20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.5,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

樣品為市售氧化型染發(fā)產(chǎn)品,含染發(fā)膏和氧化乳,取染發(fā)膏供含量測(cè)定。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

稱取各染料對(duì)照品0.1 g(精確到0.000 1 g),分別置于10 mL容量瓶中。由于溶解性差異,甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液溶解定容;甲苯-3,4-二胺用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液和甲醇(1∶9, v/v)溶解定容;2-硝基-p-苯二胺和4-硝基-o-苯二胺將稱樣量減至25 mg(精確到0.000 01 g),用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶9, v/v)溶解定容,配制成質(zhì)量濃度約2.5 g/L的溶液。其余27種染料以2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)溶解定容,配制成質(zhì)量濃度約為10 g/L的各染料單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液保存于0～4 ℃冰箱中,48 h內(nèi)使用。

1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

32種染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:取32種染料的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量于10 mL容量瓶中,用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為250 mg/L的32種染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

Ⅰ組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:取p-苯二胺、p-氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、m-氨基苯酚、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、間苯二酚、2-硝基-p-苯二胺、4-氨基-2-羥基甲苯、2-甲基雷瑣辛、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、4-氨基-m-甲酚、2-氨基-3-羥基吡啶、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、2,6-二氨基吡啶、6-羥基吲哚、4-氯雷瑣辛、1,5-萘二酚、1-萘酚的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量于10 mL容量瓶中,用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的Ⅰ組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

Ⅱ組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:取o-苯二胺、o-氨基苯酚、甲苯-3,4-二胺、6-氨基-m-甲酚、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺鹽酸鹽、m-苯二胺、氫醌、p-甲基氨基苯酚硫酸鹽、4-硝基-o-苯二胺、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、2,7-萘二酚、N-苯基-p-苯二胺的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量于10 mL容量瓶中,用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的Ⅱ組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

分別取Ⅰ組和Ⅱ組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為10、25、50、100、250、500 mg/L的Ⅰ組和Ⅱ組混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液臨用現(xiàn)配。

1.3 樣品處理

稱取樣品0.5 g(精確至0.001 g)于25 mL具塞比色管中,加入10 g/L亞硫酸氫鈉水溶液2.0 mL,用無水乙醇-水(1∶1, v/v)混合溶液溶解并定容,渦旋振蕩30 s使試樣與提取溶劑充分混勻,冰浴超聲提取10 min,如樣品渾濁可在10 000 r/min下離心5 min。取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,濾液作為待測(cè)溶液,并盡快測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1HPLC條件

色譜柱:Shimadzu Shim-pack GIST C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:25 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。分兩個(gè)HPLC條件(條件1、條件2)分離,流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表1。

表 1 32種染料的HPLC及HPLC-MS/MS流動(dòng)相梯度條件Table 1 Mobile phase gradient conditions of HPLC and HPLC-MS/MS for the 32 dyes

1.4.2HPLC-MS/MS條件

色譜柱:Waters atlant T3(150 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:2 μL;流速:0.3 mL/min;流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表1。離子源:電噴霧離子(ESI)源;監(jiān)測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表2;霧化氣流速:3 L/min;干燥氣流速:15 L/min;脫溶劑管溫度:250 ℃;離子源加熱溫度:400 ℃;碰撞氣:Ar, 230 kPa。

表 2 32種染料的電離模式、母離子、子離子、碰撞能及保留時(shí)間Table 2 Ionization modes, parent ions, daughter ions, collision energies, and retention times (tR) of the 32 dyes

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 分組的確定

基于文獻(xiàn)[13-15]數(shù)據(jù)、91批注冊(cè)樣品的標(biāo)識(shí)配方及1 462批監(jiān)督抽檢樣品的檢測(cè)結(jié)果,總結(jié)了染發(fā)類產(chǎn)品中32種染料的使用情況,其中常用染料17種(平均使用頻率>1%),較少用染料7種(平均使用頻率<1%),禁用染料8種。在《規(guī)范》中,17種常用染料分3個(gè)HPLC體系測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)溶液分3組配制避免相互干擾,但實(shí)際樣品測(cè)定時(shí),樣品中所含有的處于不同分組的染料相互間往往存在干擾。本方法將32種染料分為兩組,分別在兩個(gè)HPLC條件下檢測(cè):將17種常用染料及3種較少用染料分在Ⅰ組,使用HPLC條件1分離;8種禁用染料及4種較少用染料分在Ⅱ組,使用HPLC條件2分離。32種染料的使用頻率及分組見表3。

表 3 32種染料的使用頻率及分組Table 3 Application frequency and grouping of the 32 dyes

2.2 干擾研究

2.2.132種染料間的干擾情況

32種染料在兩個(gè)HPLC體系下的分離圖譜如圖1、圖2所示。在HPLC條件1下,有10個(gè)組分未完全分離,分別為2,6-二氨基吡啶和間苯二胺、o-氨基苯酚和間苯二酚、p-甲基氨基苯酚硫酸鹽和N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、甲苯-3,4-二胺和4-硝基-o-苯二胺、1,5-萘二酚和2,7-萘二酚。其中,除o-氨基苯酚和間苯二酚需要用HPLC-MS/MS確證外,其余8個(gè)組分均可在HPLC條件2中完全分離,這兩個(gè)組分中o-氨基苯酚在2015年被列為禁用染料,因此,本方法的分組條件能夠避免32種染料組分間的相互干擾。

圖 1 HPLC條件1下32種染料的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 32 dyes under HPLC condition 1For peak numbers, see Table 2.

圖 2 HPLC條件2下32種染料的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the 32 dyes under HPLC condition 2For peak numbers, see Table 2.

2.2.2其他常用染料的干擾情況

方法開發(fā)時(shí)還應(yīng)盡量避免32種以外可能使用的染料對(duì)樣品檢測(cè)的干擾。本文試驗(yàn)了32種以外的其他15種常用染料對(duì)被測(cè)組分的干擾情況,保留時(shí)間(tR)及干擾結(jié)果如表4所示,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚和羥苯并嗎啉對(duì)苯基甲基吡唑啉酮的檢測(cè)在兩個(gè)HPLC條件下存在干擾,其余組分均無干擾或可用其中一個(gè)色譜條件排除。

表 4 其他15種常用染料的HPLC保留時(shí)間及可能干擾的32種染料的序號(hào)Table 4 HPLC retention times of 15 other common dyes and interference dye Nos. of the 32 dyes

2.3 色譜條件優(yōu)化

2.3.1色譜柱的選擇

《規(guī)范》采用酰胺類C16柱,適合分離苯胺類染料,但通用性欠佳且離子對(duì)試劑對(duì)色譜柱損傷大。本文選擇雜化、包膜或聚合物封端技術(shù)的C18柱,可屏蔽硅羥基及金屬離子影響,通過用磷酸鹽改善苯胺類峰形,嘗試了5 μm粒徑柱及2.7 μm粒徑核殼柱,兩種色譜柱均可滿足分離要求。核殼C18柱分離時(shí)間短、效率高,但出峰密集且粒徑小易堵塞,考慮大規(guī)模監(jiān)督抽檢使用及實(shí)際樣品中可能存在的雜質(zhì)干擾,故選擇5 μm粒徑C18柱。市售3種具有雜化或者封端技術(shù)的5 μm粒徑C18柱(規(guī)格為250 mm×4.6 mm, 5 μm)在HPLC條件1下Ⅰ組20種染料的分離結(jié)果如圖3所示,方法通用性及分離效果均能滿足要求。

圖 3 采用不同品牌色譜柱時(shí)HPLC條件1下Ⅰ組染料的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of dye group Ⅰ with different brands of columns under HPLC condition 1 For peak numbers, see Table 2.

2.3.2流動(dòng)相的選擇

以Ⅰ組染料成分的分離效果作為流動(dòng)相種類、pH值和柱溫選擇的判定標(biāo)準(zhǔn)。在有機(jī)相的選擇上,甲醇和乙腈選擇性各異,對(duì)相鄰組分的分離效果不同,單獨(dú)使用甲醇或乙腈均不能完全分離:使用甲醇時(shí),組分出峰時(shí)間后移,分離效果差;使用乙腈時(shí),N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽和2-甲基雷瑣辛不能完全分離,同時(shí)使用甲醇和乙腈時(shí)分離效果可滿足要求。對(duì)于磷酸鹽緩沖液,經(jīng)試驗(yàn),鉀鹽分離效果較鈉鹽、銨鹽好,尤其對(duì)間苯二酚、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽和2-甲基雷瑣辛組分的分離。兩種鉀鹽比較,使用磷酸氫二鉀時(shí),2-氯-p-苯二胺硫酸鹽和間苯二酚峰形更佳。采用不同流動(dòng)相種類時(shí)HPLC條件1下Ⅰ組20種染料的分離結(jié)果見圖4。綜上,使用三元梯度分析,選擇磷酸氫二鉀-甲醇-乙腈作為流動(dòng)相。

圖 4 采用不同流動(dòng)相種類時(shí)HPLC條件1下Ⅰ組染料的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of dye group Ⅰ with different types of the mobile phase under HPLC condition 1

2.3.3pH的選擇

32種染料覆蓋酸/堿性物質(zhì),降低流動(dòng)相pH值有利于防止酸性物質(zhì)離子化,使其以分子形式存在于色譜柱上得到分離,而提高pH值則相反,故需確定能同時(shí)滿足兩性物質(zhì)檢測(cè)的pH條件。未使用離子對(duì),流動(dòng)相的酸度變化顯著影響出峰時(shí)間,堿性條件更有利于分離,尤其是2-硝基-p-苯二胺和苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-2-羥基甲苯和4-氨基-3-硝基苯酚、4-氯雷瑣辛和6-羥基吲哚的分離。經(jīng)試驗(yàn),HPLC條件1下不同流動(dòng)相pH條件時(shí)Ⅰ組20種染料的分離結(jié)果見圖5。pH為7.5時(shí)能實(shí)現(xiàn)20種組分的完全分離,故選擇流動(dòng)相pH為7.5。

圖 5 采用不同流動(dòng)相pH時(shí)HPLC條件1下Ⅰ組染料的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of dye group Ⅰ with different pH levels of the mobile phase under HPLC condition 1

2.3.4柱溫的選擇

考察了20、25、30、40 ℃下Ⅰ組20種染料在HPLC條件1下的分離情況,溫度過高會(huì)影響色譜柱的使用壽命,且隨著溫度升高,各染料組分保留時(shí)間逐漸縮短,分離度下降,20和25 ℃分離效果較好,綜合考慮溫度控制的難易程度和組分的分離度,選擇色譜柱溫度為25 ℃。

2.4 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.4.1抗氧化劑種類及使用量的選擇

市售染發(fā)類產(chǎn)品中抗氧化劑主要有亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸和異抗壞血酸。本研究以自制不含抗氧化劑、染料及其中間體的樣品(主要成分為水、鯨蠟硬脂醇、礦油、平平加、西曲氯胺、聚二甲基硅氧烷、EDTA二鈉)作為空白樣品,稱取0.5 g于25 mL比色管中,加入500 mg/L的Ⅰ組20種染料的儲(chǔ)備溶液1.0 mL,以此作為加標(biāo)樣品考察了上述4種抗氧化劑及亞硫酸氫鈉-抗壞血酸混合使用對(duì)Ⅰ組20種染料的抗氧化能力,結(jié)果表明,5種抗氧化溶液在48 h內(nèi)抗氧化能力相當(dāng),抗壞血酸和異抗壞血酸溶劑峰較大,亞硫酸氫鈉溶劑峰最小,因此確定為樣品前處理的抗氧化劑。

在加標(biāo)樣品中分別加入10 g/L亞硫酸氫鈉溶液0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL, 48 h穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明,在不添加抗氧化劑的條件下,2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、2-甲基雷瑣辛4種組分在第二天檢測(cè)時(shí)降解明顯,回收率下降。亞硫酸氫鈉添加量在1.0 mL以上時(shí)結(jié)果穩(wěn)定,為了保證不同樣品基質(zhì)下抗氧化能力的穩(wěn)定性,采用亞硫酸氫鈉添加量為2.0 mL。

2.4.2提取溶劑的選擇

試驗(yàn)了無水乙醇-水(1∶1, v/v)溶液、甲醇-水(1∶1, v/v)溶液、乙腈-水(1∶1, v/v)溶液3種提取溶劑對(duì)Ⅰ組染料的提取效果。3種提取溶劑均能取得理想的回收率,結(jié)果無顯著差異,考慮溶劑的安全性,采用無水乙醇-水(1∶1, v/v)溶液作為樣品處理的提取溶劑。

2.5 HPLC-MS/MS條件的選擇

HPLC采用保留時(shí)間和光譜吸收定性,具有非唯一性,在實(shí)際樣品檢測(cè)中,如出現(xiàn)相同保留時(shí)間下光譜吸收匹配存疑、雜質(zhì)峰干擾或檢出結(jié)果與標(biāo)簽、注冊(cè)資料不符等情況,可按照未知物確認(rèn)程序采用HPLC-MS/MS方法進(jìn)行確證。

分別配制32種染料溶液(氫醌質(zhì)量濃度為10 mg/L,其他組分質(zhì)量濃度為1 mg/L),以甲醇-水(1∶1, v/v)為基準(zhǔn)流動(dòng)相,采用直接進(jìn)樣方式將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源,對(duì)32種染料的MRM條件進(jìn)行優(yōu)化,母離子m/z、子離子m/z、碰撞能和保留時(shí)間見表2。

分別選用5 mmol/L乙酸-乙腈、5 mmol/L乙酸銨-乙腈、5 mmol/L甲酸-乙腈、水-乙腈、0.1%氨水-乙腈等優(yōu)化流動(dòng)相組成。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,甲酸-乙腈條件下峰形欠佳;水-乙腈和氨水-乙腈條件下,負(fù)離子模式檢測(cè)的組分拖尾嚴(yán)重。乙酸-乙腈條件下質(zhì)譜響應(yīng)最大、峰形最好,但在正離子模式下,部分組分的色譜峰基本不保留,分離困難。乙酸銨-乙腈為流動(dòng)相時(shí),各組分的色譜保留和分離度較好,但負(fù)離子模式下響應(yīng)低,尤其是間苯二酚、2-甲基雷瑣辛、4-氨基-3-硝基苯酚和氫醌等組分。綜合質(zhì)譜響應(yīng)和質(zhì)譜保留,選用乙酸銨-乙腈為正離子模式下的流動(dòng)相;乙酸-乙腈為負(fù)離子模式下的流動(dòng)相。

比較了不同濃度的乙酸和乙酸銨(5、10、20 mmol/L)的效果,結(jié)果表明,提高乙酸和乙酸銨的濃度,組分的分離和響應(yīng)沒有顯著影響,過高濃度的酸和鹽損害色譜柱的使用壽命,因此,選擇乙酸和乙酸銨的濃度為5 mmol/L。

32種染料中包含的6對(duì)同分異構(gòu)體分別是p-苯二胺、o-苯二胺和m-苯二胺;p-氨基苯酚、m-氨基苯酚和o-氨基苯酚;甲苯-2,5-二胺硫酸鹽和甲苯-3,4-二胺;4-氨基-2-羥基甲苯、6-氨基-m-甲酚、4-氨基-m-甲酚和p-甲基氨基苯酚硫酸鹽;間苯二酚和氫醌;2,7-萘二酚和1,5-萘二酚。在上述HPLC條件下,各同分異構(gòu)體組分的保留時(shí)間如表2所示,6對(duì)同分異構(gòu)體均完全分離。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出濃度

在本方法條件下考察一定濃度范圍內(nèi)HPLC和HPLC-MS/MS法測(cè)得的各被測(cè)物質(zhì)峰面積對(duì)應(yīng)濃度的線性相關(guān)性。在信噪比為3、樣品稱樣量0.5 g、稀釋25倍條件下計(jì)算本方法的檢出限。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限見表5。

表 5 HPLC和HPLC-MS/MS方法中32種染料的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 5 Linear ranges, correlation coefficients (r2), and limits of detection (LODs) of the 32 dyes determined using HPLC and HPLC-MS/MS

表 5 (續(xù))Table 5 (Continued)

結(jié)果表明,HPLC方法中32種染料在大約10～500 mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好(r2>0.99),檢出限為9.7～40.1 μg/g; HPLC-MS/MS方法中氫醌的線性范圍為2.0～79.7 mg/L,檢出限為8.0 μg/g,其他組分的線性范圍約為0.1～4 mg/L,檢出限為0.01～0.4 μg/g。

2.6.2精密度及穩(wěn)定性

分別以10、500 mg/L和0.1、4 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液考察HPLC和HPLC-MS/MS法的精密度和標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD,3天內(nèi)每天連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算日間精密度的RSD;于0、2、4、8、12、24、48、72 h進(jìn)樣,計(jì)算48 h和72 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD。日內(nèi)、日間精密度和穩(wěn)定性結(jié)果見表6。

表 6 HPLC和HPLC-MS/MS方法中32種染料的精密度(n=6)和穩(wěn)定性Table 6 Precisions (n=6) and stabilities of the 32 dyes determined using HPLC and HPLC-MS/MS RSD/%

表 6 (續(xù))Table 6 (Continued) RSD/%

結(jié)果表明,32種染料的精密度和48 h穩(wěn)定性的RSD在HPLC方法中小于5%, HPLC-MS/MS方法中小于10%,符合兩個(gè)檢測(cè)方法的精密度和穩(wěn)定性要求。部分組分72 h的穩(wěn)定性RSD>10%,建議配制染料組分的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液保存,混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在48 h內(nèi)使用。

2.6.3加標(biāo)回收率

取空白樣品0.5 g(精確到0.001 g)于25 mL具塞比色管中,分別精密加入500 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和5 g/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.0 mL,作為加標(biāo)量分別為1 000 μg/g和10 000 μg/g的HPLC方法加標(biāo)回收溶液;精密加入氫醌(500 mg/L)和其余組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(25 mg/L)0.5 mL,作為加標(biāo)量分別為25 μg/g的HPLC-MS/MS方法的加標(biāo)回收溶液。平行制備6份,HPLC和HPLC-MS/MS法的回收率及RSD結(jié)果如表7所示,兩個(gè)方法的回收率范圍分別為85.1%～114.7%(RSD<5%)和82.6%～114.9%(RSD<10%)。

表 7 HPLC和HPLC-MS/MS方法中32種染料的加標(biāo)回收率(n=6)Table 7 Spiked recoveries of the 32 dyes analyzed with HPLC and HPLC-MS/MS (n=6)

2.7 樣品測(cè)定

為比較3個(gè)方法對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的一致性,本實(shí)驗(yàn)收集10個(gè)市售氧化型染發(fā)產(chǎn)品,分別采用《規(guī)范》“7.2對(duì)苯二胺等32種組分”、本文的HPLC和HPLC-MS/MS方法進(jìn)行檢測(cè)。其中1個(gè)染發(fā)產(chǎn)品的HPLC條件1下的色譜圖見圖6。10批樣品共檢出16種染料,分別為p-苯二胺、p-氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、m-氨基苯酚、間苯二酚、4-氨基-2-羥基甲苯、2-甲基雷瑣辛、苯基甲基吡唑啉酮、2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、4-氨基-m-甲酚、2-氨基-3-羥基吡啶、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、2,6-二氨基吡啶、6-羥基吲哚、4-氯雷瑣辛、1-萘酚。檢出含量范圍為58～25 160 μg/g, 3個(gè)方法檢測(cè)結(jié)果的RSD為1.9%～10.1%。所有檢出組分均包含在本方法的Ⅰ組中。

圖 6 1個(gè)染發(fā)產(chǎn)品在HPLC條件1下的色譜圖Fig. 6 Chromatogram of a hair dye sample under HPLC condition 1For peak numbers, see Table 2.

3 結(jié)論

本文建立了32種氧化型染料的HPLC檢測(cè)方法和HPLC-MS/MS確證方法,相比《規(guī)范》標(biāo)準(zhǔn)方法,本方法使用常規(guī)C18柱替換酰胺類C16柱,不使用離子對(duì)試劑,增加了方法的通用性;基于染料使用頻率分組分離的HPLC方法能夠避免實(shí)際樣品中染料組分間的干擾,常用染料可在HPLC條件1中完成檢測(cè),減少了注冊(cè)檢驗(yàn)中染料組分檢測(cè)的工作量;與文獻(xiàn)[10-12]報(bào)道方法相比,本方法能夠全部覆蓋目前監(jiān)督抽檢要求的染料組分,并建立了HPLC-MS/MS確證方法,更好地滿足監(jiān)督檢驗(yàn)的需求。方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,通用性和穩(wěn)定性良好,能夠作為染發(fā)類產(chǎn)品中多種染料檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)推廣方法。