周 雯, 楊開廣, 張麗華, 梁 振, 張玉奎

(1. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室,遼寧 大連 116023; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

2019年12月底爆發(fā)的新冠肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)迅速蔓延,截至2022年7月24日,全球累計確診病例已經超過5.73億,并且仍然呈上升趨勢。國際病毒分類委員會將引發(fā)COVID-19的病毒命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2),它是一種單股正鏈RNA病毒。病毒動力學模型表明,高頻次檢測對于有效識別和隔離攜帶者以及遏制大流行至關重要[1],因此,快速、高通量、高靈敏、高準確、低成本的SARS-CoV-2檢測技術亟待發(fā)展。

SARS-CoV-2診斷的金標準是逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR),它具有高特異性和高靈敏度,但它需要特殊的設備和專業(yè)技術人員,且試劑盒短缺和巨大的檢測需求導致樣品應答時間長[2,3]?？乖东@測試和具有可視讀數(shù)的等溫核酸診斷是在集中式實驗室之外進行SARS-CoV-2測試的替代方法?？乖东@測試快速且用戶友好,但其較低的靈敏度可能導致假陰性結果[4],它僅適用于高病毒滴度的受感染個體;等溫核酸擴增方法,如環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)和重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification, RPA)比抗原捕獲測試更靈敏[5,6],但這些設備對于單次使用來說過于昂貴。因此,開發(fā)高靈敏度和無需設備的診斷方法是應對新冠肺炎疫情的關鍵。

成簇的規(guī)則間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相關(CRISPR-associated, Cas)系統(tǒng)在適應性細菌免疫中被首次發(fā)現(xiàn)[7]?；贑RISPR的診斷(CRISPR-Dx)對設備要求低,具有可編程性、靈敏性和易用性,是用于SARS-CoV-2檢測的有前景的技術。CRISPR-Dx技術通常將等溫核酸擴增方法與Cas12或Cas13結合。當CRISPR RNA(crRNA)與核酸特異性靶向結合后,Cas12或Cas13被激活,切割報告分子,釋放熒光團,通過熒光信號檢測病毒[8,9]。目前,兩項CRISPR-Dx技術(Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit和SARS-CoV-2 RNA DETECTR ASSAY)已獲得食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的緊急授權,可用于SARS-CoV-2的檢測,但由于檢測結果需要結合臨床診斷共同判斷,僅限于經批準的實驗室使用。

SARS-CoV-2的進化導致具有多組突變的病毒變體的出現(xiàn)和持續(xù)傳播,這些突變會增加傳染性或減少抗體的中和作用,使病毒更難以控制。到目前為止,只有少數(shù)CRISPR-Dx被開發(fā)用于識別SARS-CoV-2變體中存在的核苷酸取代,但它們都不適用于現(xiàn)場檢測[10,11]。因此,基于CRISPR開發(fā)高靈敏度、用戶友好、無設備要求、快速、低廉的SARS-CoV-2檢測技術,并實現(xiàn)SARS-CoV-2變體區(qū)分檢測,對于應對COVID-19挑戰(zhàn)是非常關鍵的。本文介紹近期發(fā)表的基于CRISPR實現(xiàn)SARS-CoV-2檢測和變體區(qū)分的最新技術,對其進行評述。

1 基于核酸多重評估的組合陣列反應平臺的CRISPR-Dx檢測技術

大多數(shù)CRISPR診斷對于每個樣品檢測1～3個目標物,為了同時檢測多種樣品和多重病原體,Sabeti等[12,13]將基于CRISPR的核酸檢測與微孔陣列系統(tǒng)集成,開發(fā)了核酸多重評估的組合陣列反應平臺(combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids, CARMEN)。CARMEN利用核酸診斷的計算設計工具ADAPT (activity-informed design with all-inclusive patrolling of targets)設計crRNA,其能夠在靶物種內提供高覆蓋率,并且對其他物種具有高選擇性[14];輸入的是PCR或RPA擴增的樣品以及包含Cas13、序列特異性crRNA和報告分子的檢測混合物。每個擴增的樣品和檢測混合物與獨特的熒光色碼結合,隨后乳化產生1 nL的液滴;來自所有樣品和檢測混合物的液滴裝載到由聚二甲基硅氧烷模制的微孔陣列芯片中,芯片中的每個微孔隨機容納兩個液滴,在電場中每個微孔的液滴對合并,同時開始檢測反應,通過熒光顯微鏡監(jiān)測反應(如圖1)。

圖 1 CARMEN中芯片功能詳細原理圖[13]Fig. 1 Detailed schematic of loader and chip function in CARMEN[13]

構建的CARMEN方法能夠同時檢測169種病毒,它實現(xiàn)了基于CRISPR的大規(guī)模診斷,其固有的多路復用和通量能力使其具有規(guī)模實用性,并且將每次測試的試劑成本降低為原來的1/300以下。CARMEN的靈活性可以允許添加新的擴增引物或crRNA以促進對SARS-CoV-2等新發(fā)現(xiàn)病原體序列的檢測。

對于疫情,理想的診斷方法是同時具有處理上百份樣本、檢測多種病毒、區(qū)分病毒變體并量化病毒載量的能力[15,16]。第一代CARMEN(CARMEN v.1)雖然能夠實現(xiàn)大規(guī)模診斷,但是它需要使用定制的成像芯片,且檢測時間長達8～10 h[13]。為了滿足快速檢測多種病毒和變體的高通量臨床檢測需求,以CARMEN v.1為基礎,結合商業(yè)的Fluidigm微流控技術,Sabeti等[17]繼續(xù)構建出核酸多重評估的微流控組合陣列反應平臺(microfluidic combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids, mCARMEN),它是迄今唯一的1種將監(jiān)測功能結合到單一技術平臺的診斷工具,能夠在一天內測試數(shù)百份樣本中的多種呼吸道病毒和變體,同時還能夠量化病毒基因組拷貝數(shù)。

mCARMEN通過使用集成流路芯片(integrated fluidic circuit, IFC),消除了CARMEN v.1的顏色編碼和滴狀化需求;在IFC中混合大量的樣品,避免了CARMEN v.1通過擴散進行液滴混合;通過利用Fluidigm微流控技術,克服了CARMEN v.1對定制顯微鏡和芯片的需求(如圖2)。開發(fā)的mCARMEN呼吸道病毒檢測板能夠測試多達21種病毒。為了實現(xiàn)臨床應用,對mCARMEN工作流程進行優(yōu)化(如圖3),通過實施自動化RNA提取,使用具有1個引物庫的單步RNA-DNA擴增,并減少檢測讀數(shù)的持續(xù)時間,將人工勞動和處理時間減少到低于5 h。

圖 2 CARMEN v.1和mCARMEN工作流程示意圖[17]Fig. 2 Schematic of CARMEN v.1 and mCARMEN workflows[17]

圖 3 簡化的mCARMEN工作流程示意圖[17]Fig. 3 Schematic of the streamlined mCARMEN workflow[17]

mCARMEN進一步開發(fā)呼吸道病毒面板(respiratory virus panel, RVP)來檢測9種最具臨床相關性的病毒(SARS-CoV-2、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63、FLUAV、FLUBV、HPIV-3、HRSV和HMPV)。為了比較RT-qPCR和mCARMEN RVP的靈敏度,測試多次凍融循環(huán)不同濃度SARS-CoV-2樣品(100、1 000、10 000拷貝數(shù)/mL)對檢測重復性的影響,發(fā)現(xiàn)任何濃度下mCARMEN RVP的靈敏度不受凍融循環(huán)的影響;而RT-qPCR在最低濃度樣本時受到凍融循環(huán)的負面影響,100拷貝數(shù)/mL的8個重復樣本并不能被全部檢出。說明mCARMEN RVP對于低病毒載量的樣品檢測效果更好,靈敏度更高,不受凍融循環(huán)的影響。

將mCARMEN RVP用于來自馬薩諸塞州總醫(yī)院的166份臨床樣本以及150份人工病毒樣本的檢測,所有的RVP病毒靶標均具有100%的陰性符合率;除人類偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)外,所有的靶標均具有大于95%的陽性符合率,超過了FDA設定的最低臨床性能標準。在137份臨床陽性結果中,mCARMEN正確檢測了95%(130份)的病毒核酸;對于150份人工病毒樣本,mCARMEN正確識別了99%(148份)。

CARMEN v.1不能對樣本中病毒基因組拷貝數(shù)進行定量評估,而確定患者體內的病毒總量對于評估感染階段、傳播風險和最有效的治療方案非常重要[15,16]。為了使mCARMEN能夠用于定量,利用具有不同反應動力學和酶活性的多個Cas相關蛋白(Cas12和靈敏度更高的Cas13分別捕獲標準曲線上高拷貝數(shù)樣本和低拷貝數(shù)樣本的動力學曲線),以及Fluidigm Biomark檢測的3個熒光通道,繪制熒光強度達到50%的時間和濃度關系的標準曲線。因此,聯(lián)合使用Cas12和Cas13,可以對患者樣本中跨越1～106拷貝數(shù)/μL的SARS-CoV-2和甲型流感病毒進行定量。

目前,變異譜系分類僅由下一代測序技術(next-generation sequencing, NGS)進行評估,臨床診斷不能很好地識別SARS-CoV-2變體中攜帶的突變(單核苷酸多態(tài)性,插入或缺失),因此用于全面檢測26種SARS-CoV-2刺突基因突變的診斷和監(jiān)測平臺具有重要的現(xiàn)實意義。mCARMEN繼續(xù)開發(fā)出了變體識別面板(variant identification panel, VIP),能夠識別和區(qū)分6種SARS-CoV-2變體(Alpha、Beta、Gamma、Delta、Epsilon和Omicron),它在刺突基因的保守區(qū)域內有兩個不重疊的引物對,用于擴增全長序列,利用突變設計的26個crRNA對允許追蹤現(xiàn)有的變體并識別新出現(xiàn)的變體。

將mCARMEN VIP技術用于馬薩諸塞州收集的1 557份樣本,通過將NGS確定的譜系結果與mCARMEN VIP譜系結果對比,發(fā)現(xiàn)存在99.5%的一致性(1 549份),但NGS技術的檢測周期比mCARMEN VIP長約4～7天;此外,NGS的每個樣本成本比mCARMEN VIP高5～10倍。

2 基于特定高靈敏度酶解報告系統(tǒng)的CRISPR-Dx檢測技術

LAMP能夠以最低的設備要求進行高通量測試,但通常需要純化的樣品才能獲得高靈敏度;改進的RPA能夠用于未提取樣品的測試,并具有更高的靈敏度,但僅與基于橫向流的視覺讀數(shù)兼容,這對于大批量樣品測試是不可取的[18]。Abbott公司的檢測儀ID NOW COVID-19測試使用未提取樣品進行等溫擴增,可在5～13 min內報告結果,但該技術需要昂貴的設備,且通量較低[19,20]。因此,等溫擴增方法仍然需要技術進步,以便在實驗室外以低成本和高通量進行測試。

基于CRISPR的診斷方法SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK)[21]從提取核酸開始,包括兩個獨立的步驟:(1)等溫RPA；(2)T7轉錄和Cas13介導的單鏈RNA報告分子的側鏈切割。目前基于SHERLOCK的診斷與熱處理未提取樣品以滅活核酸酶(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases, HUDSON)的技術[22]兼容,使用熱和化學還原滅活核酸酶并溶解病毒粒子,消除了對核酸提取的需要。這些方法將病毒檢測設備和實驗室基礎設施的需求減少到只需一個加熱元件。然而,它們的擴增產物需要在試管之間轉移,這會增加污染和用戶錯誤的風險。

為了解決當前核酸診斷的局限性,Sabeti等[9]建立了簡化突出顯示感染以應對流行病的方法(streamlined highlighting of infections to navigate epidemics, SHINE),可以從未提取的樣本中檢測SARS-CoV-2 RNA。SHINE是一種基于SHERLOCK[21]的SARS-CoV-2分析方法,具有以下優(yōu)點:(1)將基于RPA的擴增和基于Cas13的檢測合并為一個步驟,減少了用戶操作和分析時間;(2)為了消除對純化核酸的需求并減少總運行時間,通過添加核糖核酸酶抑制劑,將HUDSON孵育時間從30 min減少到10 min,以快速滅活樣品中的病毒;(3)為了避免橫向流讀數(shù)時打開含有擴增產物的試管帶來樣品污染風險,結合了一個管內熒光讀數(shù)器;(4)為了減少用戶在解讀管內讀數(shù)結果時的偏差,通過配套的智能手機應用程序以自動化的方式解釋熒光讀數(shù)(如圖4)。

圖 4 SHINE示意圖[9]Fig. 4 Schematic of SHINE[9]

使用樣品應答時間50 min的SHINE測試了50個未提取的鼻、咽拭子樣本,與RT-qPCR相比,靈敏度為90%(27/30, SARS-CoV-2陽性樣本),并且具有100%的特異性。由于SHINE結合了用戶友好、制備方法簡單、靈敏度高、速度快的特點,其特別適合于社區(qū)監(jiān)控。

第一代SHINE(SHINE v.1)[9]是一種不需要提取核酸或定制設備的診斷分析,然而SHINE v.1涉及多個加熱步驟,并且需要低溫儲存和訓練有素的人員手動制備試劑混合物。在此基礎上,Sabeti等[23]繼續(xù)開發(fā)的第二代SHINE(SHINE v.2)結合了室溫樣品處理和凍干測試試劑,從而消除對冷藏鏈的需求,大大方便了試劑運輸和儲存,降低了檢測的整體復雜性。除此之外,SHINE v.1檢測采用SARS-CoV-2開放閱讀框1a(open reading frame 1a, ORF1a),與ORF1a相比,刺突基因檢測速度快1～2倍,靈敏度高10倍?？紤]到其增加的靈敏度和有利的動力學,SHINE v.2選擇刺突基因檢測用于進一步開發(fā)。

病毒裂解緩沖液(FastAmp?Viral and Cell Solution)[18]能夠在環(huán)境溫度下發(fā)揮作用,SHINE v.2通過將含5% RNA酶抑制劑的FastAmp裂解試劑加入10%(鼻、咽拭子樣本占通用運輸介質的體積分數(shù))的樣品中處理5 min,在環(huán)境溫度下快速、無設備地有效滅活核酸酶和SARS-CoV-2;通過在原始SHINE緩沖液中添加穩(wěn)定劑蔗糖和填充劑甘露醇,去除不穩(wěn)定成分聚乙二醇和氯化鉀,增加凍干后SHINE緩沖液的活性,使其仍然能夠保持凍干前SHINE緩沖液的檢出限。SHINE v.2大大減少了用戶的實際操作時間和液體處理步驟,從SHINE v.1的45 min和20個移液步驟減少到不足10 min和5個用戶操作(如圖5)。

圖 5 SHINE v.2工作流程示意圖[23]Fig. 5 Schematic of the SHINE v.2 workflow[23]

以RT-qPCR為基準,利用SHINE v.2對SARS-CoV-2陽性和陰性患者共72份鼻、咽拭子樣本(病毒載量代表了一般人群,中值病毒載量約107拷貝數(shù)/mL)進行測試,SHINE v.2能夠以90.5%的靈敏度(38/42, 陽性樣本)和100%的特異性檢測未提取的鼻、咽拭子中的SARS-CoV-2 RNA。隨后將SHINE v.2與兩種廣泛使用的FDA緊急授權的抗原捕獲測試(Abbott的BinaxNow新冠肺炎抗原自測[24], Access Bio的CareStart新冠肺炎抗原檢測[25])進行比較。在另外一組96份鼻、咽拭子樣本中(病毒載量分布比一般人群低50～100倍,中值病毒載量約1.9×105拷貝數(shù)/mL以上), SHINE v.2比兩種抗原捕獲測試的靈敏度都高50倍。SHINE v.2擅長檢測中等病毒載量的樣本,可以識別抗原捕獲測試可能遺漏的潛在感染個體,并且具有100%特異性,在33個RT-qPCR陰性樣品中均無假陽性結果。

為了鑒別SARS-CoV-2的不同變體,SHINE v.2針對不同變體的標志設計了具有不同活性的原始RNA靶標和含有給定突變的衍生RNA靶標的crRNA組,并且通過ADAPT[14]幫助設計RPA引物,以檢測區(qū)分5種變體(Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron)。使用Omicron特異性的SHINE v.2,對12個未提取的鼻、咽拭子的臨床樣本進行測試,正確鑒定出所有Omicron陽性樣本中142～145突變的存在,對照的Omicron陰性樣本中沒有檢測到142～145突變。

基于Cas13a的SHERLOCK平臺[21], Pecori等[26]開發(fā)出通過優(yōu)化SHERLOCK準確檢測進化的SARS-CoV-2診斷測試方法(accurate detection of evolving SARS-CoV-2 through SHERLOCK optimization, ADESSO),直接從患者樣本中對SARS-CoV-2及其變體進行高靈敏度檢測。該方法在大約1 h內完成(如圖6),且不需要RNA提取和任何特定設備,具有2.5拷貝數(shù)/μL SARS-CoV-2合成基因組的檢測極限(接近RT-qPCR的極限)。使用的基于橫向流的視覺讀數(shù)是一種無需儀器的檢測方法,在陰性樣品中,RNA報告分子是完整的,并被鏈霉親和素捕獲,產生一條對照帶;在陽性樣品中,報告分子被切割,釋放出含有熒光團的片段,并被金標記的抗體捕獲,產生測試帶。測試帶和對照帶之間的帶強度比反映了Cas13的激活水平,條帶強度比高于0.2的樣品即為陽性樣品。

圖 6 ADESSO在臨床樣本中檢測SARS-CoV-2的實驗工作流程圖[26]Fig. 6 Graphic of the experimental workflow of ADESSO to detect SARS-CoV-2 in clinical samples[26]

使用ADESSO測試共195份SARS-CoV-2陽性和陰性臨床樣本,將其與RT-qPCR和抗原測試進行比較。RT-qPCR和ADESSO通過提取的RNA進行分析比較;基于抗原的診斷測試(RIDA?QUICK SARS-CoV-2 Antigen)和ADESSO直接在未提取的樣本上進行比較。在提取的RNA上,ADESSO和RT-qPCR具有相當?shù)撵`敏度和特異性(ADESSO和RT-qPCR靈敏度分別為96%和94%);在未提取的拭子樣品上,ADESSO的靈敏度顯著優(yōu)于抗原測試(ADESSO和抗原測試的靈敏度分別為77%和46%)。結合之前數(shù)學模型結果:成功識別和隔離50%的受感染個體足以使感染曲線趨緩[27]。因此,ADESSO對于控制疫情有很大的幫助。

對標準ADESSO進行調整,以檢測SARS-CoV-2不同變體(Alpha、Beta、Delta和Omicron)。針對每種變體的特異性突變,設計了crRNA來識別這些序列。在標準ADESSO的基礎上,由于crRNA和靶標RNA之間少量的錯配,Cas13反應時間由10 min調整至20 min;此外,還觀察到交叉變異反應的信號略有增加,因此將條帶強度比閾值從0.2增加到0.4,以避免變體鑒定中的假陽性。將每種變體特異性的ADESSO用于臨床樣本,能夠成功鑒定其中的所有變體。

ADESSO的單次反應成本低于5 C=,這與抗原檢測相當,但是靈敏度更高;與基于RT-qPCR的新冠肺炎診斷檢測相比更低廉,并且能夠實現(xiàn)更廣泛和更高頻次的檢測。但是ADESSO是一種兩步法的CRISPR-Dx技術,它處理步驟多,并且容易引入樣品污染的風險。因此,未來研究有必要在保持高靈敏度的同時,探索“一鍋法”ADESSO。

3 總結與展望

由于RT-qPCR和抗原測試的普遍適用性和靈敏度較差,仍然需要一種在靈敏度和特異性方面與RT-qPCR相當,但更快且不依賴于復雜儀器的替代檢測技術。基于CRISPR的大規(guī)模診斷具有高通量、快速檢測、用戶友好、無需設備、低廉、高靈敏度和特異性的性質,這促使它成為公共衛(wèi)生系統(tǒng)應對SARS-CoV-2的關鍵,能夠實現(xiàn)常規(guī)、全面的監(jiān)測。

基于CARMEN的CRISPR診斷技術,對病毒樣本進行RNA的提取與擴增,能夠同時實現(xiàn)多種樣品、多重病毒的高通量檢測,mCARMEN在CARMEN v.1的基礎上,使用IFC消除顏色編碼的需求,使用Fluidigm微流控技術克服定制芯片的需求,并聯(lián)合使用Cas12和Cas13實現(xiàn)病毒拷貝數(shù)的量化,實現(xiàn)了SARS-CoV-2變體的區(qū)分?；赟HERLOCK的CRISPR診斷技術,直接分析滅活的病毒樣本,無需RNA提取。SHINE v.1合并了基于RPA的擴增和基于Cas13的檢測,通過配套的手機應用程序自動化解釋熒光讀數(shù);SHINE v.2在此基礎上結合了室溫樣品滅活處理和凍干測試試劑,以簡化試劑運輸和儲存過程。并且檢測靈敏度更高的刺突基因代替了SHINE v.1的ORF1a。

基于CRISPR的診斷技術具有很好的適應性,更換crRNA可以使CRISPR針對不同的病毒和變體,能夠快速應對當前和未來即將爆發(fā)的其他疫情的診斷需求。未來基于CRISPR的診斷工具需要在不犧牲靈敏度或特異性的情況下,簡化實驗流程、提高用戶可操作性、降低分析復雜性,并且具有低成本、快速檢測的特點,能夠實現(xiàn)傳染病的高頻次、高覆蓋檢測,加強公共衛(wèi)生系統(tǒng)對傳染病的控制與監(jiān)測。