盧彭信, 李 港, 鄭 偉, 梁海珍, 張 潔,柴瑞平, 羅定強(qiáng), 金 燕, 郭寶林, 馬百平*

(1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510060; 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京 100850;3. 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司, 上海 201206; 4. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所, 北京 100193; 5. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 陜西 西安 710065)

絞股藍(lán)尚未收錄至2020版《中國(guó)藥典》,僅收錄于地方標(biāo)準(zhǔn),如在《福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2006年)》中,對(duì)絞股藍(lán)的質(zhì)量控制僅局限于性狀、色味,對(duì)絞股藍(lán)總皂苷或具體皂苷無明確的含量控制。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)[17-20],目前關(guān)于絞股藍(lán)質(zhì)量控制的液相色譜法,多采用紫外(ultraviolet, UV)檢測(cè)器測(cè)定絞股藍(lán)中一種或多種皂苷的含量。然而皂苷類化合物通常無紫外吸收或僅為末端吸收,UV對(duì)于這類化合物的檢測(cè)不穩(wěn)定,靈敏度低,并且在梯度洗脫時(shí)容易出現(xiàn)基線漂移。電霧式檢測(cè)器(charged aerosol detector, CAD)是一種質(zhì)量相關(guān)的通用型檢測(cè)器[21],對(duì)比其他通用型檢測(cè)器如蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light scattering detector, ELSD)和示差折光檢測(cè)器(differential refractive index detector, RID), CAD具有靈敏度更高[22]、重現(xiàn)性更好和檢測(cè)范圍更寬[23]等特點(diǎn),其檢測(cè)信號(hào)不依賴于被測(cè)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu),更適用于無紫外吸收或只有較弱紫外吸收成分的定量分析[24]。

本研究利用UHPLC-Q-TOF/MS結(jié)合UHPLC-CAD鑒定了福建產(chǎn)絞股藍(lán)的主要成分,經(jīng)過堿水解后[25],絞股藍(lán)皂苷XLVI(gypenoside XLVI)和絞股藍(lán)皂苷LVI(gypenoside LVI)含量遠(yuǎn)高于其他皂苷成分,為福建產(chǎn)絞股藍(lán)中的主成分,適合作為福建產(chǎn)絞股藍(lán)質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分,且目前缺少相關(guān)報(bào)道。因此,本研究利用UHPLC-CAD建立了福建產(chǎn)絞股藍(lán)中絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的含量測(cè)定方法,為福建產(chǎn)絞股藍(lán)藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Vanquish Flex UHPLC液相色譜儀、CAD檢測(cè)器(美國(guó)Thermo Fisher公司); Waters ACQUITY I-Class超高效液相色譜系統(tǒng)、VION-IMS-Q-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司); BP 211D十萬分之一天平(德國(guó)Sartorius公司); KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈(質(zhì)譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);蒸餾水(廣州屈臣氏有限公司);無水乙醇(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。對(duì)照品絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI由本課題組從福建產(chǎn)絞股藍(lán)中分離得到,經(jīng)HR-ESI-MS以及1H-NMR、13C-NMR等波譜分析鑒定結(jié)構(gòu),經(jīng)UHPLC-CAD面積歸一化法測(cè)得純度均大于98.0%,結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖 1 絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of gypenoside XLVI and LVI

圖 2 絞股藍(lán)樣品的(a) UHPLC-CAD分析色譜圖和(b) UHPLC-Q-TOF/MS分析基峰圖Fig. 2 (a) Chromatogram of UHPLC-CAD and (b) base peak ion chromatogram of UHPLC-Q-TOF/MS of Gynostemma pentaphyllum sample Peak identifications 1-8 were shown in Table 2. CAD: charged aerosol detector; Q-TOF/MS: quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.

藥材來源信息見表1, 16份樣品均來自福建絞股藍(lán)主產(chǎn)區(qū),經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)。所有藥材經(jīng)烘箱50 ℃干燥至恒重后,粉碎,過40目篩得樣品粉末,干燥陰涼處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 絞股藍(lán)樣品信息Table 1 Information of Gynostemma pentaphyllum samples

表 2 絞股藍(lán)樣品中主要的化學(xué)成分Table 2 Main compounds in Gynostemma pentaphyllum samples

1.2 定性分析

1.2.1定性分析樣品的配制

稱取絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI對(duì)照品粉末適量,分別溶解于乙醇-水(70∶30, v/v)中,各吸取一定體積均勻混合,0.22 μm微孔濾膜過濾即得對(duì)照品溶液。

精密稱取絞股藍(lán)樣品粉末0.2 g,加入乙醇-水(70∶30, v/v)30 mL于具塞錐形瓶中,超聲提取30 min,取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾即得供試品溶液。

1.2.2定性分析的液相色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫條件:0～2 min, 10%B～25%B; 2～7 min, 25%B～32%B; 7～10 min, 32%B～33%B; 10～12 min, 33%B～35%B; 12～22 min, 35%B～46%B; 22～27 min, 46%B～56%B; 27～28.5 min, 56%B～95%B; 28.5～30 min, 95%B; 30～30.5 min, 95%B～10%B; 30.5～33 min, 10%B。流速為0.5 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣體積2 μL。

1.2.3飛行時(shí)間質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源,負(fù)離子模式,離子源溫度為110 ℃,脫溶劑氣體為氮?dú)?流速為850 L/h,溫度為450 ℃，毛細(xì)管電壓為2.5 kV,錐孔電壓為50 V,低能量掃描時(shí)能量為6 eV,高能量掃描時(shí)能量為35～65 eV，掃描范圍為m/z100～1 500。精確質(zhì)量數(shù)用亮氨酸-腦啡肽(leucine-enkephalin)溶液進(jìn)行校正。

1.3 含量測(cè)定

1.3.1對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取對(duì)照品粉末絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI適量,用乙醇-水(50∶50, v/v)溶解,于10 mL容量瓶中定容,制得質(zhì)量濃度分別為1.272 mg/mL和1.636 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2供試品溶液的配制

精密稱取樣品粉末0.2 g,置于100 mL具塞磨口錐形瓶中,加入30 mL乙醇-水-氨水(50∶46∶4, v/v/v),密塞,超聲提取30 min(功率600 W,頻率40 kHz),靜置24 h,稱重比較前后重量差異,加入提取溶劑補(bǔ)足減失的量,取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,待測(cè)。

1.3.3含量測(cè)定的液相色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫條件:0～10.4 min, 30%B; 10.4～10.5 min, 30%B～95%B; 10.5～14.5 min, 95%B; 14.5～14.6 min, 95%B～30%B; 14.6～20 min, 30%B。流速為0.5 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣體積2 μL; 電霧式檢測(cè)器采集頻率10 Hz,蒸發(fā)溫度35 ℃,濾波1 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 主成分鑒定

為充分了解福建產(chǎn)絞股藍(lán)的化學(xué)成分信息,利用UHPLC-CAD分析福建產(chǎn)絞股藍(lán),得到其CAD指紋圖譜,如圖2a所示,發(fā)現(xiàn)色譜峰1～4為福建產(chǎn)絞股藍(lán)的主要成分。在相同指紋圖譜液相色譜條件下,利用UHPLC-Q-TOF/MS對(duì)福建產(chǎn)絞股藍(lán)進(jìn)行化學(xué)成分鑒定,基峰圖如圖2b所示。通過化合物的保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量、化學(xué)式、質(zhì)量數(shù)誤差、高能量裂解碎片等信息,結(jié)合對(duì)照品及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道即可鑒定出各個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的可能的化合物,鑒定結(jié)果見表2。

以色譜峰3和4為例,具體鑒定過程如下。色譜峰3在負(fù)離子低能量模式下產(chǎn)生加合離子峰m/z1 007.5 393 [M+HCOO]-和準(zhǔn)分子離子峰m/z961.534 9 [M-H]-,推斷其分子式為C48H82O19,同時(shí),其可在負(fù)離子高能量模式下產(chǎn)生碎片離子m/z799.483 3、637.431 3和475.379 0,表明結(jié)構(gòu)中含有3分子六碳糖。經(jīng)與對(duì)照品保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量等信息對(duì)比確定其為絞股藍(lán)皂苷XLVI。在負(fù)離子模式下色譜峰4產(chǎn)生了兩組碎片離子(見圖3),分別為m/z1 047.534 8 [M4-1-H]-,以及m/z1 077.583 7 [M4-2-H]-和1 123.587 0 [M4-2+HCOO]-的準(zhǔn)分子離子峰,推測(cè)色譜峰4含有兩個(gè)化合物,即化合物4-1和化合物4-2,根據(jù)其準(zhǔn)分子離子峰,分別推斷化合物4-1的分子式為C51H84O22(m/z1 047.534 8 [M4-1-H]-),化合物4-2的分子式為C53H90O22(m/z1 077.583 7 [M4-2-H]-)。通過提取準(zhǔn)分子離子峰,化合物4-1在負(fù)離子高能量模式下產(chǎn)生碎片m/z1 003.545 6、961.535 3、799.484 5、637.431 8、475.379 5,表明其在高能量時(shí)連續(xù)脫去中性特征碎片m/z44(CO2)、m/z42(C2H2O)和3分子六碳糖。除脫去m/z44(CO2)、m/z42(C2H2O)外,其他碎片與對(duì)照品絞股藍(lán)皂苷XLVI一致,結(jié)合文獻(xiàn)[11]報(bào)道推斷化合物4-1為丙二?；?絞股藍(lán)皂苷XLVI?；衔?-2在負(fù)離子高能量模式下產(chǎn)生碎片m/z945.541 4、783.484 9、459.383 7,表明其在高能量時(shí)連續(xù)脫去1分子五碳糖和3分子六碳糖,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[26]推斷化合物4-2為絞股藍(lán)皂苷IV。因此色譜峰4中包含了在此色譜條件下未能實(shí)現(xiàn)分離的化合物丙二?；?絞股藍(lán)皂苷XLVI和絞股藍(lán)皂苷IV。

表 3 絞股藍(lán)皂苷XLVI與LVI的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r), LODs and LOQs of gypenoside XLVI and LVI

圖 3 色譜峰4在負(fù)離子(a)低能量和(b)高能量模式下的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of peak 4 in negative ion (a) low energy and (b) high energy modes

2.2 堿水解條件優(yōu)化

丙二酰基-絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI在福建產(chǎn)絞股藍(lán)中含量較大,但其不穩(wěn)定容易脫去丙二?；?難以得到對(duì)照品,故參考人參含量測(cè)定文獻(xiàn)中對(duì)丙二酰基酸性皂苷的處理方法[31],適當(dāng)進(jìn)行條件優(yōu)化后,對(duì)絞股藍(lán)樣品進(jìn)行堿水解預(yù)處理,再進(jìn)行含量測(cè)定。

分別考察了堿水解中氨水的體積分?jǐn)?shù)(1%、2%和4%)和反應(yīng)時(shí)間(12、24和36 h)對(duì)絞股藍(lán)皂苷XLVI、絞股藍(lán)皂苷LVI、丙二?；?絞股藍(lán)皂苷XLVI和丙二?；?絞股藍(lán)皂苷LVI含量的影響。當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)為1%和2%時(shí),丙二酰基-絞股藍(lán)皂苷XLVI和丙二?；?絞股藍(lán)皂苷LVI在36 h內(nèi)均未能完全轉(zhuǎn)化,耗時(shí)過長(zhǎng);當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí),24 h內(nèi)丙二酰基-絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI即可完全轉(zhuǎn)化,且36 h與24 h無明顯變化。綜合考慮樣品溶液的pH值以及反應(yīng)時(shí)長(zhǎng),確定堿水解條件:氨水體積分?jǐn)?shù)為4%,反應(yīng)24 h。判斷堿水解是否完全的過程如圖4所示,分別為該條件下堿水解前、后的UHPLC-CAD色譜圖,色譜峰2已完全轉(zhuǎn)化,而峰面積相當(dāng)?shù)纳V峰4沒有完全轉(zhuǎn)化,由2.1節(jié)已知色譜峰4中包含了2個(gè)化合物,其中化合物4-2(絞股藍(lán)皂苷IV)結(jié)構(gòu)中不含有丙二酰基,堿水解對(duì)其無影響,結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定堿水解后該色譜峰m/z1 077.5 837 [M-H]-為化合物4-2,說明含丙二?；幕衔?-1已全部轉(zhuǎn)化為去丙二?；慕g股藍(lán)皂苷XLVI,即該條件下堿水解已完全。

圖 4 絞股藍(lán)樣品S10在含4%氨水提取溶劑中反應(yīng)24 h(a)前、(b)后的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of Gynostemma pentaphyllum sample S10 (a) before and (b) after the reaction in the extraction solvent containing 4% ammonia for 24 h 1. gypenoside LVI; 2. malonylgypenoside LVI; 3. gypenoside XLVI; 4. malonylgypenoside XLVI/gypenoside IV; 4-2. gypenoside IV.

此外,取不同年份、不同來源和不同規(guī)格的福建產(chǎn)絞股藍(lán)樣品S1、S3、S6和S16在上述條件下進(jìn)行堿水解,反應(yīng)后分別取樣品適量,在1.2.2節(jié)液相色譜條件下進(jìn)行UHPLC-CAD分析。如圖5所示,不同批次福建產(chǎn)絞股藍(lán)樣品的一致性較好,該堿水解條件下不同含量的丙二酰基-絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI均能完全轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI,且轉(zhuǎn)化后絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的總含量遠(yuǎn)高于其他皂苷成分,進(jìn)一步驗(yàn)證了優(yōu)化后的堿水解條件的通用性以及質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分選擇的合理性。

圖 5 堿水解后不同批次絞股藍(lán)樣品的UHPLC-CAD色譜圖Fig. 5 UHPLC-CAD chromatograms of different batches of Gynostemma pentaphyllum sample after the alkali hydrolysis

2.3 提取方法優(yōu)化

在樣品提取的過程中,分別考察了不同提取溶劑、提取料液比以及提取時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI提取率的影響。同時(shí),結(jié)合2.2節(jié)堿水解條件優(yōu)化結(jié)果,在提取方法優(yōu)化過程中均在提取溶劑中加入體積分?jǐn)?shù)為4%的氨水。當(dāng)料液比為1∶150(g∶mL)、超聲提取時(shí)間為30 min時(shí),在不同提取溶劑(30%、50%、70%甲醇水溶液和30%、50%、70%乙醇水溶液)下,總提取液中絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的峰面積之和分別為13 378、22 305、24 015、17 670、23 959和21 043,其中,70%甲醇水溶液與50%乙醇水溶液對(duì)兩種成分的提取率相當(dāng),但由于乙醇更加綠色環(huán)保,故選用50%乙醇水溶液(含4%氨水)作為提取溶劑。

當(dāng)提取溶劑為50%乙醇水溶液(含4%氨水),提取時(shí)間為30 min時(shí),在不同料液比(1∶50、1∶100、1∶150和1∶200, g∶mL)下,總提取液中絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的峰面積之和分別是18 152、20 721、23 959和23 974, 1∶150(g∶mL)與1∶200(g∶mL)料液比下,兩種成分的提取率相當(dāng),綜合考慮樣品濃度等因素,確定料液比為1∶150(g∶mL)。

此外,當(dāng)提取溶劑為50%乙醇水溶液(含4%氨水),提取料液比為1∶150(g∶mL),超聲提取時(shí)間分別為20、30、40和50 min,總提取液中絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的峰面積之和分別是22 888、23 959、23 917和23 983,當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí),兩種化合物已被充分提取,再隨著提取時(shí)間的增加,峰面積無明顯差異,為縮短分析操作時(shí)間,提高分析效率,故選擇提取時(shí)間為30 min。

最終提取條件確定為:乙醇-水-氨水(50∶46∶4, v/v/v)作為提取溶劑,料液比1∶150(g∶mL),超聲提取30 min。

2.4 液相色譜條件的優(yōu)化

考察了不同的色譜柱以及不同的流動(dòng)相組成對(duì)供試品或?qū)φ掌贩逍魏头蛛x效果的影響。由于提取溶液中加入了氨水,供試品溶液具有一定的堿性(pH=8.8),故選擇的色譜柱須耐受一定的堿性,選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm; pH耐受范圍:1～12)。

關(guān)于流動(dòng)相的組成,考察了不同的流動(dòng)相系統(tǒng)(水-甲醇和水-乙腈)對(duì)化學(xué)成分分離效果的影響,結(jié)果顯示在水-乙腈系統(tǒng)下,各待測(cè)成分分離效果較好,響應(yīng)較高,同時(shí),在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加入適量的甲酸有助于峰形的改善,因此最終確定流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈。如圖6所示,該液相色譜條件下供試品中絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI保留適中,分離度良好。

圖 6 (a)絞股藍(lán)樣品和(b)混合對(duì)照品的UHPLC-CAD色譜圖Fig. 6 UHPLC-CAD chromatograms of (a) Gynostemma pentaphyllum sample and (b) mixed reference substances

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

精密吸取1.3.2節(jié)配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,并將其均勻混合,用50%乙醇逐級(jí)稀釋,制得絞股藍(lán)皂苷XLVI質(zhì)量濃度分別為318.00、159.00、79.50、39.75、19.88、9.94 μg/mL,絞股藍(lán)皂苷LVI質(zhì)量濃度分別為409.00、204.50、102.25、51.13、25.56、12.78 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液;精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各2 μL,分別按1.3.3節(jié)的液相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。CAD是基于霧化-氣溶膠的HPLC檢測(cè)器,其響應(yīng)值與被測(cè)物質(zhì)的量呈指數(shù)關(guān)系,一般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化或用二次函數(shù)計(jì)算[32]。本文以待測(cè)組分質(zhì)量濃度(μg/mL)的對(duì)數(shù)值(X)為橫坐標(biāo),峰面積的對(duì)數(shù)值(Y)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表3所示,絞股藍(lán)皂苷XLVI在9.94～318.94 μg/mL、絞股藍(lán)皂苷LVI在12.78～409.00 μg/mL范圍內(nèi),X與Y線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.999 3和0.999 5。

分別對(duì)2種對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋,進(jìn)樣檢測(cè),分別以信噪比(S/N)等于3和10為標(biāo)準(zhǔn),確定2種化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),其中,絞股藍(lán)皂苷XLVI的檢出限為1.58 μg/mL,定量限為6.36 μg/mL;絞股藍(lán)皂苷LVI的檢出限為2.05 μg/mL,定量限為8.18 μg/mL。

2.5.2精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液,按1.3.3節(jié)的液相色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI峰面積的RSD值分別為0.88%和0.44%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.3.2節(jié)方法制得的同一供試品溶液適量(編號(hào):S10),分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h,按1.3.3節(jié)的液相色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),記錄峰面積,計(jì)算絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的含量。二者的RSD值分別為0.98%和0.90%(n=6),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份同一批次的絞股藍(lán)樣品粉末(編號(hào):S10)0.20 g,按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液,按1.3.3節(jié)的液相色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,記錄峰面積,計(jì)算絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的含量。二者RSD值分別為1.39%和1.55%(n=6),表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.5加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取6份同一批次的絞股藍(lán)粉末(編號(hào):S10)0.10 g,精密加入相當(dāng)量的對(duì)照品溶液,按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液,按1.3.3節(jié)液相色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè),記錄峰面積,計(jì)算絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的含量。絞股藍(lán)皂苷XLVI與LVI的加標(biāo)回收率分別在100.2%～107.2%與97.9%～104.2%范圍內(nèi),RSD值分別為2.4%與2.6%,表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.6 絞股藍(lán)樣品含量測(cè)定

對(duì)包括種植、野生和商品茶在內(nèi)的16批福建產(chǎn)絞股藍(lán)樣品進(jìn)行含量測(cè)定,分別精密稱取樣品粉末0.2 g,按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液,按1.3.3節(jié)液相色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),分別測(cè)定各批次絞股藍(lán)樣品中絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的含量,結(jié)果見表4。絞股藍(lán)中絞股藍(lán)皂苷XLVI的含量在0.57～2.57%之間,絞股藍(lán)皂苷LVI的含量在0.66～2.99%之間。其中,野生絞股藍(lán)樣品(編號(hào):S1、S2、S6和S10)中指標(biāo)成分含量略低于種植樣品;商品茶樣品(編號(hào):S14、S15和S16)的指標(biāo)成分含量高于其他樣品。

表 4 不同批次絞股藍(lán)樣品中絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI的含量(n=3)Table 4 Contents of gypenoside XLVI and LVI in different batches of Gynostemma pentaphyllum samples (n=3)

3 結(jié)論

本研究利用UHPLC-Q-TOF/MS結(jié)合UHPLC-CAD鑒定了福建產(chǎn)絞股藍(lán)的主要成分,選擇2個(gè)含量較高的共有成分絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI作為指標(biāo)成分,利用UHPLC-CAD建立了福建產(chǎn)絞股藍(lán)中絞股藍(lán)皂苷XLVI和LVI含量的測(cè)定方法。該方法靈敏度高,重復(fù)性好,可用于福建產(chǎn)絞股藍(lán)的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制,為福建產(chǎn)絞股藍(lán)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善提供了方法參考。

致謝 感謝安康正大制藥有限公司的李金燦、張軍、師東曉協(xié)助采集和搜集絞股藍(lán)樣品。