高 玲, 顧 強(qiáng), 王 紅, 馬行空, 薛 峰,張 幸, 葛家春, 丁 濤, 沈偉健*

(1. 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210019; 2. 張家港海關(guān)綜合技術(shù)中心, 江蘇 張家港 215600;3. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所, 江蘇 南京 210017; 4. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 江蘇 南京 210095;5. 南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院, 江蘇 南京 210023)

中華絨螯蟹俗稱大閘蟹,是一種我國所特有的淡水蟹,其以味甜鮮美、富有營養(yǎng)而久負(fù)盛名。中華絨螯蟹中的游離氨基酸不僅是一類重要的營養(yǎng)物質(zhì),而且與蟹獨(dú)特的滋味和香味密切相關(guān)[1]。如谷氨酸、天門冬氨酸等氨基酸具有鮮味的特征,甘氨酸、色氨酸、丙氨酸等氨基酸甜味明顯,而亮氨酸、異亮氨酸等氨基酸則有明顯的苦味[2]。由于養(yǎng)殖環(huán)境、水質(zhì)、所投喂飼料等因素的差異,不同產(chǎn)地中華絨螯蟹中的游離氨基酸總量、組成有所差別,使這些產(chǎn)品之間的味道呈現(xiàn)出微妙的差異[3],從而極大地影響了產(chǎn)品的價格。因此,對中華絨螯蟹中游離氨基酸組成和含量進(jìn)行測定,對其產(chǎn)品品質(zhì)評價、風(fēng)味研究、真?zhèn)魏彤a(chǎn)地鑒別等都有重要意義。

食品中氨基酸的含量大多采用液相色譜法測定[4-10],樣品中氨基酸經(jīng)提取、凈化后,使用衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生,液相色譜分離后采用紫外或二極管陣列檢測器測定。也有文獻(xiàn)采用氣相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12,13]、離子交換色譜法[14,15]、毛細(xì)管電泳法[16]進(jìn)行測定,但也均需對氨基酸進(jìn)行衍生,而衍生化反應(yīng)操作較為繁瑣,且存在衍生物不穩(wěn)定的缺點(diǎn)[5]。氨基酸自動分析儀[1]、電位傳感法[17]操作簡便且無需進(jìn)行衍生化反應(yīng),適合快速篩查和現(xiàn)場檢測工作,但這些方法很難實(shí)現(xiàn)不同氨基酸之間的基線分離,抗干擾能力弱,不適合檢測基質(zhì)復(fù)雜的大閘蟹樣品。質(zhì)譜法同樣無需衍生化反應(yīng),又兼具靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn),已經(jīng)被成功用于茶葉、芒果、嬰兒食品中游離氨基酸的測定[18-21]。而四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜作為新一代的高分辨質(zhì)譜技術(shù),將四極桿的高離子選擇性和靜電場軌道阱高分辨掃描技術(shù)有機(jī)結(jié)合,不僅具有普通串聯(lián)質(zhì)譜較高靈敏度和選擇性的優(yōu)點(diǎn),更進(jìn)一步地提高了采集質(zhì)量精度、靈敏度等。同時,高分辨質(zhì)譜無需對目標(biāo)物逐個優(yōu)化子離子及相關(guān)參數(shù),僅通過全掃描和數(shù)據(jù)依賴性二級掃描模式,一次進(jìn)樣分析即可同時完成一級和二級質(zhì)譜掃描,既能得到一級的精確質(zhì)量數(shù),也能獲得二級的特征碎片離子等信息,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜檢測化合物數(shù)量有限、假陽性判斷能力不足的缺陷。袁光蔚等[22]采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-HRMS)建立了水果中18種游離氨基酸的測定方法,王忠合等[23]采用親水作用色譜-飛行時間質(zhì)譜測定了單叢烏龍茶中的游離氨基酸,都證明了高分辨質(zhì)譜可有效排除復(fù)雜基質(zhì)的干擾,從而提高測定準(zhǔn)確度。目前,尚未見利用四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜測定中華絨螯蟹中游離氨基酸的報(bào)道。

本工作采用UHPLC-HRMS技術(shù)對中華絨螯蟹中17種游離氨基酸進(jìn)行了快速測定,并對20份取自江蘇地區(qū)的中華絨螯蟹樣品進(jìn)行了實(shí)際樣本檢測和驗(yàn)證。此項(xiàng)工作將為中華絨螯蟹的品質(zhì)評價和風(fēng)味研究提供有價值的技術(shù)信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司); XP205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); Lab Dancer渦旋振蕩儀(德國IKA公司); X4R高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司); S220-K-CN pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司)。

17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)購自北京振翔科技有限公司,詳細(xì)信息見表1;氫氧化鉀(分析純)、高氯酸(分析純)、定性濾紙購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、0.45 μm水相微孔濾膜購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

分別稱取17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,混合后用水溶解并定容至100 mL,此混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸質(zhì)量濃度均為100 mg/L。吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100、200、500、1 000、2 000 μL于10 mL容量瓶中,分別加水定容,配制成氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液,質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20 mg/L。

1.2 樣品前處理

稱取5.00 g試樣于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL 5%(v/v)高氯酸水溶液,用渦旋振蕩器充分混勻,再以8000 r/min離心5 min,取上清液于另一聚丙烯離心管中。按上述步驟用10 mL 5%(v/v)高氯酸溶液重復(fù)提取一次,合并提取液。用1 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)提取液pH至6.5,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用水定容至刻度線。定性濾紙過濾后,用0.45 μm水相微孔濾膜過濾,供UHPLC-HRMS測定。對于中華絨螯蟹中含量較高的氨基酸,需進(jìn)一步稀釋,使其最終濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)。

1.3 分析條件

1.3.1色譜條件

色譜柱:XDB-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 1.7 μm);柱溫:25 ℃;流動相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.8 min, 2%B; 0.8～3.0 min, 2%B～24%B; 3.0～4.0 min, 24%B; 4.0～6.0 min, 24%B～95%B; 6.0～9.0 min, 95%B; 9.0～9.5 min, 95%B～2%B; 9.5～12.0 min, 2%B。流速:0.6 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;毛細(xì)管溫度:350 ℃;鞘氣(N2)流速50 L/min;輔助氣(N2)流速6 L/min;吹掃氣(N2)流速:3 L/min;噴霧電壓:3 kV;透鏡電壓:50 V;一級質(zhì)譜掃描分辨率(R): 70 000;自動增益控制(AGC): 2×105;最大駐留時間:100 ms;分離窗口:m/z2.0。17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的CAS號、監(jiān)測離子、保留時間等見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

采用UHPLC-HRMS對中華絨螯蟹中游離氨基酸進(jìn)行測定的方法具有選擇性好、抗干擾能力特別強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。其無需徹底的液相色譜基線分離和基質(zhì)凈化,僅需提取、離心、過濾等簡便操作,就能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性和定量測定。然而,即便如此,提取步驟依然是決定檢測準(zhǔn)確性的重要環(huán)節(jié),有必要對影響提取效率的最重要因素——提取溶劑進(jìn)行優(yōu)選。戴明等[18]在測定茶葉中游離氨基酸時,對比了12種提取溶劑的提取效果后,發(fā)現(xiàn)20%(v/v)甲醇水溶液的提取效率最佳。同樣是測定茶葉中的游離氨基酸,杜穎穎等[19]發(fā)現(xiàn)在水中加入少量的甲酸后,能大幅提升提取效率,甚至高于乙醇或甲醇水溶液。臧彬如等[24]使用水提取,測定了鹿茸中16種氨基酸,平均加標(biāo)回收率達(dá)到了98.9%。這些工作為本方法的開發(fā)帶來了啟發(fā),然而,中華絨螯蟹具有高蛋白、高油脂的特點(diǎn),在提取環(huán)節(jié)中需要盡量排除這些物質(zhì)對后續(xù)測定的干擾。一些酸性沉淀劑,如高氯酸、三氯乙酸等具有沉淀蛋白質(zhì)的作用,也常被用于中華絨螯蟹氨基酸、核苷酸等成分的提取[3,25,26]。

本工作首先對比了20%(v/v)甲醇水溶液、0.2%(v/v)甲酸水溶液、5%(v/v)高氯酸水溶液等3種提取試劑的提取效率。當(dāng)使用20%(v/v)甲醇水溶液、0.2%(v/v)甲酸水溶液作為提取溶劑時,使用氫氧化鉀溶液或甲酸調(diào)節(jié)合并的提取液pH至6.5,其他步驟不變。我們在中華絨螯蟹樣本中添加了一定量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,確保每一種氨基酸都有檢出。分別采用3種提取溶劑對該加標(biāo)樣本進(jìn)行提取后測定,通過對比每種氨基酸測得含量的大小,來評估3種提取溶劑的提取效率。如圖1所示,采用20%(v/v)甲醇水溶液提取時,僅異亮氨酸、酪氨酸的提取效率較高,這可能與這兩種氨基酸具有相對較長的疏水基團(tuán)有關(guān)。但該溶劑對其他游離氨基酸的提取效果并不理想,特別是脯氨酸、纈氨酸、甘氨酸的提取效率明顯不如另兩種溶劑。0.2%(v/v)甲酸水溶液在提取脯氨酸時效率最高,但對其他氨基酸的提取效率均不如5%(v/v)高氯酸水溶液,特別是對天門冬氨酸、谷氨酸的提取效率較低,可能是由于這兩種氨基酸的等電點(diǎn)在2～4左右,與甲酸水溶液的pH值非常接近,導(dǎo)致這兩種氨基酸在該提取溶劑中的溶解度不高。因此,與20%(v/v)甲醇水溶液和0.2%(v/v)甲酸水溶液相比,5%(v/v)高氯酸水溶液的整體提取效率較高。

圖 1 采用3種不同提取溶劑時的氨基酸測得值Fig. 1 Amino acid contents detected with three different extraction solvents

圖 2 采用4種含量的高氯酸水溶液提取的氨基酸含量Fig. 2 Amino acid contents extracted with four perchloric acid aqueous solutions of different volume fractions

此外,本工作對比了1%、2%、5%、10%(v/v)4種不同含量高氯酸水溶液的提取效率。如圖2所示,當(dāng)高氯酸含量從1%提升到5%時,大部分氨基酸的提取效率隨高氯酸含量的升高而提升,特別是天門冬氨酸、絲氨酸、纈氨酸、甘氨酸等的提升非常顯著。而當(dāng)高氯酸含量從5%提升到10%時,脯氨酸提取效率略有下降,甲硫氨酸、纈氨酸則略有上升,但大多數(shù)氨基酸的提取效率基本維持不變。因此,5%和10%高氯酸水溶液均能獲得較理想的提取效率。從環(huán)保和操作安全的角度考慮,本工作選擇5%(v/v)高氯酸水溶液作為提取溶劑。

2.2 儀器條件優(yōu)化

在氨基酸的液相色譜分離中,有采用親水作用色譜(hydrophilic-interaction chromatography, HILIC)的[27],也有使用C8或C18反相液相色譜的,都成功實(shí)現(xiàn)了氨基酸的分離[18],本工作選用食品分析實(shí)驗(yàn)室最為常用的C18色譜柱。比較了水-乙腈、0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈作為流動相時17種氨基酸的分離和色譜峰情況。在ESI+模式下,流動相的離子強(qiáng)度大小會直接影響氨基酸的離子化效率,進(jìn)而決定質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果表明,使用水-乙腈作為流動相時,氨基酸的響應(yīng)較低。與5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈相比,使用0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作為流動相時,氨基酸的峰形更好、響應(yīng)更強(qiáng)。因此,最終確定使用0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作為流動相。

在質(zhì)譜參數(shù)方面,本工作采用流動注射分析的方式將17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入質(zhì)譜儀,通過全掃描得到精確母離子[M+H]+的質(zhì)荷比,并同時優(yōu)化了相關(guān)參數(shù),優(yōu)化條件下17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖3。

圖 3 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg/L)的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the 17 amino acid standard solutions (10 mg/L)

2.3 線性范圍、儀器檢出限和定量限

分別取適量17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,用超純水稀釋,按1.3.1節(jié)及1.3.2節(jié)色譜和質(zhì)譜條件測定,以各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度(x, mg/L)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。

按信噪比(S/N)=3計(jì)算儀器檢出限(IDL),S/N=10計(jì)算儀器定量限(IQL)。17種氨基酸的線性范圍為10.0～200.0 mg/L,在該范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(R2)均≥0.999 0,線性良好。17種氨基酸的線性范圍、回歸方程、R2、IDL、IQL見表2。

表 2 17種氨基酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、儀器檢出限和儀器定量限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients (R2), IDLs, and IQLs for the 17 amino acids

2.4 精密度和回收率

取一中華絨螯蟹樣本的可食部分粉碎混勻,在其中分別添加3個濃度水平的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品。一般來說,加標(biāo)回收試驗(yàn)需要從定量限濃度開始,然而,中華絨螯蟹中游離氨基酸的本底值較高,需要在更高的濃度下加標(biāo),以更好地反映實(shí)際檢測時的方法準(zhǔn)確度。在本工作中,脯氨酸、纈氨酸、甘氨酸的加標(biāo)水平為500、1 000、2 000 mg/kg,其他氨基酸為50、100、200 mg/kg。

2.4.1精密度

中華絨螯蟹中17種游離氨基酸含量的UHPLC-HRMS測定方法的精密度評估由儀器重復(fù)性、方法重復(fù)性和再現(xiàn)性試驗(yàn)組成,采用上述制備的最低濃度加標(biāo)水平的樣本進(jìn)行。儀器重復(fù)性試驗(yàn):使用同樣的儀器條件對同一份樣品提取液連續(xù)測定6次完成,計(jì)算測定結(jié)果的平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD);方法重復(fù)性試驗(yàn):由同一操作者在同一天內(nèi)連續(xù)測定6個同一加標(biāo)水平的樣本;再現(xiàn)性試驗(yàn):由不同的操作者在連續(xù)5天中分別測定5個同一加標(biāo)水平的樣本。如表3所示,17種氨基酸儀器重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤4.2%,方法重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤11.4%,再現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD≤13.9%。其中,Asp、Ser、Ile、Leu、Ala、His等6種游離氨基酸的精密度數(shù)據(jù)符合食品理化檢測要求。而其余11種游離氨基酸的方法重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為4.6%～11.4%,超出了GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F3中規(guī)定的范圍,因此,如需將這11個指標(biāo)用于相關(guān)研究工作,需要評估精密度數(shù)據(jù)對研究結(jié)果的影響。

表 3 UHPLC-HRMS 方法的精密度Table 3 Precisions of the UHPLC-HRMS method

2.4.2回收率

加標(biāo)回收率試驗(yàn)是采用3個加標(biāo)水平的中華絨螯蟹樣品進(jìn)行的,每個樣品重復(fù)測定6次,每個指標(biāo)的加標(biāo)水平及相應(yīng)回收率數(shù)據(jù)如表4所示,17種氨基酸的加標(biāo)回收率在78.4%～105.3%之間。

表 4 樣品中游離氨基酸的加標(biāo)回收率(n=6)Table 4 Spiked recoveries of the free amino acids in a sample (n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測

取養(yǎng)殖的中華絨螯蟹樣品20份(江蘇省宿遷市,其中公蟹和母蟹各10份),每份樣品分別剝離出蟹肉(體肉、爪肉、螯肉)、母蟹蟹黃(母蟹肝胰腺和性腺)或公蟹蟹膏(公蟹肝胰腺和性腺),分別混勻裝袋。使用本工作建立的檢測方法對上述各樣品中游離氨基酸含量進(jìn)行測定,結(jié)果見表5。從表5中可以看出,在游離氨基酸總量上,公蟹肉比公蟹膏的含量高,母蟹肉也比母蟹黃的含量高,這與郭宏慧等[26]的研究結(jié)果一致。此外,每一種游離氨基酸在蟹肉與蟹膏/蟹黃中的分布又都不一樣,如甘氨酸在蟹肉中的含量要比蟹膏和蟹黃中的含量高得多,由于甘氨酸是一種甜味氨基酸,這是蟹肉口味要更加甘甜的原因之一。而很多游離氨基酸在蟹膏和蟹黃中的含量卻比蟹肉更高,如酪氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等,這些組成特點(diǎn)也賦予了蟹膏和蟹黃更為立體的口味。

表 5 中華絨螯蟹不同部位游離氨基酸含量(n=10)Table 5 Contents of the free amino acids in different edible parts of Eriocheir sinensis (n=10) mg/kg

3 結(jié)論

本文建立了UHPLC-HRMS檢測中華絨螯蟹中17種氨基酸的分析方法,該方法前處理簡便,選擇性和抗干擾能力特別強(qiáng),為中華絨螯蟹中游離氨基酸測定提供了一種更為準(zhǔn)確的檢測技術(shù)。