熊陳思慧, 定天明, 劉 杰, 易 鷗, 丁曉萍*, 謝 云

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 湖北 武漢 430065; 2. 湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖北 武漢 430075; 3. 武漢美之修行信息科技有限公司, 湖北 武漢 437000)

近年來,含有美白祛斑、抗衰單體成分和植物原料的化妝品受到了廣大消費(fèi)者的青睞,尤其是植物活性成分,因符合消費(fèi)者天然的護(hù)膚理念,越來越多的商家將產(chǎn)品研發(fā)重心傾向于植物護(hù)膚和單體活性成分聯(lián)合使用[1]。植物成分在皮膚美白、保濕、抗衰老、防曬、抗炎以及化妝品的防腐抑菌等方面發(fā)揮著重要作用,例如苦參、紅景天、人參、積雪草、茶葉等提取物,具有美白祛斑、抗炎、抑菌、抗皺等作用[2]。此外,還有一些單體功效成分,在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的保濕、美白祛斑、抗氧化作用,例如煙酰胺、抗壞血酸葡糖苷、咖啡因、泛醇[3]?；瘖y品因配方不同而植物提取物添加量各異,如何檢測化妝品中植物提取物的添加量,進(jìn)而與產(chǎn)品的相應(yīng)功效關(guān)聯(lián),目前尚無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法。此外,因微量添加無法檢測而存在的產(chǎn)品標(biāo)簽虛假標(biāo)示因缺乏技術(shù)支撐而難以判定。

目前,化妝品中單體功效成分和植物活性成分的檢測方法已有報(bào)道[4-6]。HPLC方法已被用于單體功效成分煙酰胺、抗壞血酸葡糖苷、咖啡因等的檢測[7,8]。LC-MS/MS方法被用于檢測茶葉、甘草提取物等樣品中的功效成分[9,10]。然而,LC-MS/MS適用于已知目標(biāo)物的分析,在沒有標(biāo)準(zhǔn)品和短時(shí)間內(nèi)難以建立檢測方法的情況下,很難快速完成檢測。而兼具離子阱和高分辨質(zhì)譜平行檢測能力的線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(LTQ/Orbitrap MS),可以通過目標(biāo)成分的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片離子定性,無需對(duì)照品即可完成快速篩查和確證。

鑒于此,本研究運(yùn)用超高效液相色譜(UHPLC)-LTQ/Orbitrap MS方法,采用全掃模式,建立了水、乳、霜基質(zhì)類化妝品中22種功效成分的檢測方法,為化妝品中功效成分的檢測提供技術(shù)支持,更好地服務(wù)于化妝品監(jiān)管工作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Thermo U3000液相色譜儀,Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL組合式高分辨質(zhì)譜儀,Thermo ST16臺(tái)式離心機(jī)均購自美國Thermo Fisher公司;Vortex-Genic2旋渦混合器(美國Scientific Industries公司); Hyper Sonic DT-A超聲波清洗儀(鼎泰恒勝公司); 45位N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Milli-Q A10超純水機(jī)(美國Millipore公司); Mettler Toledo電子天平(梅特勒-托利多(上海)公司)。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈(色譜純,Merck公司);甲酸(色譜純,阿拉丁公司)。

對(duì)照品:表沒食子兒茶素(批號(hào)PF200906-11,純度98.8%, CAS No. 970-74-1),甘草酸(批號(hào)Q5640050,純度99.8%, CAS No. 1405-86-3),毛蕊花糖苷(批號(hào)F2190020,純度98.4%, CAS No. 61276-17-3)購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;表兒茶素沒食子酸酯(批號(hào)PF201115-07,純度98.74%, CAS No. 1257-08-5),咖啡因(批號(hào)SM201023-13,純度100%, CAS No. 58-08-2),泛醇(批號(hào)SM190124-02,純度98.30%, CAS No. 81-13-0),抗壞血酸葡糖苷(批號(hào)YT201008-15,純度99.08%, CAS No. 129499-78-1),虎杖苷(批號(hào)PS210713-05,純度99.87%, CAS No. 27208-80-6),黃芪甲苷(批號(hào)PF200906-11,純度99.06%, CAS No. 84687-43-4)購于美國Stanford Chemicals公司;苦參堿(批號(hào)110805-202010,純度98.7%, CAS No. 519-02-8),氧化苦參堿(批號(hào)110780-201909,純度92.9%, CAS No. 16837-52-8),煙酰胺(批號(hào)100115-202005,純度99.9%, CAS No. 98-92-0),短葶山麥冬皂苷C(批號(hào)111908-201102, CAS No. 130551-41-6),山麥冬皂苷B(批號(hào)111907-201804, CAS No. 87425-34-1),甘草次酸(批號(hào)110723-201715,純度99.6%, CAS No. 471-53-4),甘草苷(批號(hào)111610-201908,純度95.0%, CAS No. 551-15-5),大黃素(批號(hào)110756-201913,純度96.0%, CAS No. 518-82-1),積雪草苷(批號(hào)110892-202006,純度93.8%, CAS No. 16830-15-2),羥基積雪草苷(批號(hào)110893-202105, 純度為93.7%, CAS No. 34540-22-2),人參皂苷Rb1(批號(hào)110704-202129,純度94.3%, CAS No. 41753-43-9),人參皂苷Re(批號(hào)110754-202129,純度96.0%, CAS No. 52286-59-6)購于中國食品藥品檢定研究院;麥冬皂苷D(批號(hào)G21O11L128330,純度98.0%, CAS No. 41753-53-3)購于源葉生物科技有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取各對(duì)照品約5 mg用于配制標(biāo)準(zhǔn)溶液?？箟难崞咸擒罩糜?0 mL容量瓶中,用純水溶解,再用甲醇定容;甘草酸置于另一10 mL容量瓶,用甲醇溶解后定容;兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液需臨用新配。另將大黃素和泛醇置于同一10 mL容量瓶中,用甲醇溶解后定容;其他對(duì)照品置于同一10 mL容量瓶中,用甲醇溶解后定容;所有儲(chǔ)備液保存于-20 ℃ 的冰箱中。

精密量取適量4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到質(zhì)量濃度約為100 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,臨用時(shí),再用甲醇逐級(jí)稀釋成所需質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取樣品約0.2 g置于5 mL容量瓶中,加入甲醇定容至5 mL,渦旋1 min,超聲提取15 min,離心,取出上清液,部分樣品需要在40 ℃氮吹后復(fù)溶到1 mL,再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾到進(jìn)樣小瓶中,待測。

部分樣品中待測物質(zhì)含量因超出線性范圍,采用甲醇稀釋后進(jìn)行測定。

1.5 儀器分析

1.5.1液相色譜條件

色譜柱:Xtimate UHPLC C18 (100 mm×2. 1 mm, 1. 8 μm,美國Welch公司);流動(dòng)相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脫程序:0～5 min, 5%B～8%B; 5～25 min, 8%B～60%B; 25～35 min, 60%B～80%B; 35～36 min, 80%B～5%B; 36～45 min, 5%B;流速:0. 3 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:30 ℃。

1.5.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)正離子模式;鞘氣(N2)和輔助氣(Ar)流速分別為40和10 arb (arbitrary unit);毛細(xì)管溫度300 ℃;離子源電壓2. 5 kV,電流100 μA;一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 300,分辨率為60 000;多級(jí)質(zhì)譜采用高能碰撞誘導(dǎo)解離(HCD)模式,依賴一級(jí)質(zhì)譜掃描中的第1到第4強(qiáng)峰,分辨率15 000; HCD裂解能量為歸一化能量35%。22種功效成分的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表 1 22種功效成分的UHPLC-LTQ/Orbitrap MS分析參數(shù)Table 1 Analytical parameters of the 22 functional components using ultra-high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry (UHPLC-LTQ/Orbitrap MS)

2 結(jié)果與討論

2.1 植物提取物和單體成分的選擇

采用美麗修行大數(shù)據(jù)平臺(tái),對(duì)化妝品中使用頻次較高的植物提取物和單體功效成分進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)(見圖1),發(fā)現(xiàn)甘草類(光果甘草根莖葉、甘草根、脹果甘草根)、麥冬根、人參根、黃芪根、虎杖根、苦參根、地黃根、積雪草、茶葉提取物與煙酰胺、泛醇、咖啡因、抗壞血酸葡糖苷等單體成分在化妝品中使用較多,因此,本研究選擇含有上述植物提取物和單體功效成分的產(chǎn)品為研究對(duì)象。

圖 1 截至2021年12月美麗修行數(shù)據(jù)庫中單體功效成分和植物提取物在化妝品中的歷史使用次數(shù)Fig. 1 Statistical frequencies of functional monomer components and plant extracts applied in cosmetics obtained from Beauty Evolution database before December, 2021

鑒于植物提取物中成分復(fù)雜,根據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道和2020年版《中國藥典》中各藥材的檢測指標(biāo),積雪草提取物(Centellaasiaticaextract)的功效成分為積雪草苷和羥基積雪草苷;甘草類(光果甘草根莖葉、甘草根、脹果甘草根)提取物(licorice extract)的功效成分為甘草次酸、甘草酸、甘草苷[12];麥冬提取物(Ophiopogonjaponicusroot extract)的功效成分為麥冬皂苷D、山麥冬皂苷B,短葶山麥冬皂苷C[13];茶葉(茶)提取物(tea extract)的功效成分為咖啡因、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯[14];人參根提取物(ginseng extract)的功效成分為人參皂苷Re和人參皂苷Rb1[15];膜莢黃芪根提取物(Astragalusmembranaceusroot extract)的功效成分為黃芪甲苷[16];虎杖根提取物(Polygonumcuspidatumroot extract)的功效成分為大黃素和虎杖苷[17];苦參根提取物(Sophoraangustifollaroot extract)的功效成分為苦參堿和氧化苦參堿[18];地黃根提取物(Rehmanniaglutinosaroot extract)的功效成分為毛蕊花糖苷[19],選擇上述植物中代表性成分對(duì)產(chǎn)品中添加的植物提取物進(jìn)行篩查和檢測?？紤]到化妝品中植物提取物添加量低,選擇植物提取物在外包裝標(biāo)簽標(biāo)示靠前的54批產(chǎn)品作為檢測樣品,其中水劑25批、乳劑19批,霜膏基質(zhì)10批。

2.2 UHPLC-LTQ/Orbitrap MS分析條件的選擇

首先考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液兩種流動(dòng)相在相同梯度洗脫條件下,對(duì)物質(zhì)分離的影響。結(jié)果表明,乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相,能夠較好地分離各物質(zhì)成分,且峰形和分辨率較好。

在1.5.1節(jié)色譜條件下,優(yōu)化干燥氣溫度、流速以及離子源溫度等質(zhì)譜參數(shù)。采用全掃模式可以獲得各物質(zhì)較好的峰形。在正、負(fù)離子模式下,采用歸一化能量為30%、35%、40%和45%高能碰撞解離,獲取二級(jí)碎片離子,結(jié)果表明在正離子模式下,歸一化碰撞能量為35%時(shí),多數(shù)化合物碎片離子豐富,便于確定目標(biāo)成分。各物質(zhì)的總離子流圖及提取離子色譜圖見圖2。

圖 2 22種功效成分的總離子流圖及提取離子色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatograms of the 22 functional components Peak identifications: 1. nicotianamine; 2. ascorbyl glucoside; 3. matrine; 4. oxymatrine; 5. D-panthenol; 6. epigallocatechin; 7. caffeine; 8. acteoside; 9. epicatechin gallate, 10. polydatin; 11. liquiritin; 12. ginsenoside Re; 13. madecassoside; 14. asiaticoside; 15. ginsenoside Rb1; 16. astragaloside A; 17. glycyrrhizinic acid; 18. liriope muscari baily saponin C; 19. emodine; 20. ophiopogonin D; 21. liriopesides B; 22. glycyrrhetic acid.

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

以水、乳、霜為樣品基質(zhì),分別選用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇(20%、50%、80%、100%)水溶液進(jìn)行提取,以加標(biāo)回收率為指標(biāo)考察提取效果。結(jié)果表明,采用甲醇-水體系時(shí),當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)降低到50%時(shí),提取液乳化現(xiàn)象嚴(yán)重,加入飽和氯化鈉溶液且增加離心速率較難消除乳化效應(yīng),在乳、霜基質(zhì)中100%甲醇的凈化效果優(yōu)于80%甲醇。根據(jù)功效成分的溶解性及回收率的結(jié)果,100%甲醇提取22種功效成分均能得到理想的提取效果。因此,本試驗(yàn)確定提取液為甲醇。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1線性關(guān)系和檢出限

考察了混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各目標(biāo)化合物的線性關(guān)系,以目標(biāo)化合物的含量(x, mg/kg)和準(zhǔn)分子離子峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、線性范圍見表2。結(jié)果表明,各化合物的線性關(guān)系良好。由于高分辨質(zhì)譜的基線噪聲較低,以S/N方法計(jì)算出的檢出限可能與方法的實(shí)際檢測值存在差別,本研究采用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋至儀器能檢出的最低含量作為各化合物的檢出限(見表2),定量限根據(jù)檢出限經(jīng)實(shí)測確定。

表 2 22種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (R2), linear ranges, limits of detection (LODs), and limits of quantification (LOQs) for the 22 functional components

2.4.2方法回收率和精密度

精密稱取乳劑、霜膏基質(zhì)和水劑的空白樣品0.2 g,分別添加低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平的22種成分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)建立的檢測方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測定3次,計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),水、乳、霜3種基質(zhì)的加標(biāo)回收率分別為63.2%～116.3%、63.6%～125.1%、68.9%～119.4%, RSD分別為0.18%～9.9%、0.78%～10.3%、0.78%～10.9%,結(jié)果表明,在3個(gè)不同水平下加標(biāo)回收率均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。通過對(duì)乳劑加標(biāo)回收率的結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)甘草苷、黃芪甲苷、短葶山麥冬皂苷C、麥冬皂苷D的回收率超過120%,對(duì)于這4種物質(zhì)的測定采用了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)基質(zhì)干擾問題進(jìn)行校正,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其加標(biāo)回收率為84.6%～113.4%, RSD為1.1%～4.9%,表明在乳劑中幾種成分存在一定的基質(zhì)干擾。

選擇線性范圍內(nèi)中濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到水、乳、霜空白樣品中,在相同條件下平行處理6份,以6次測定的峰面積計(jì)算方法精密度,水劑中22種成分的RSD為0.96%～6.4%,乳劑中22種成分的RSD為1.4%～6.7%,霜膏基質(zhì)中22種成分的RSD為2.0%～10.5%。

2.5 樣品測定結(jié)果

按照所建立方法測定了2.1節(jié)所述的54批樣品,均未檢出地黃根提取物、虎杖根提取物、麥冬根提取物的代表物質(zhì),另6種植物提取物和4種單體功效成分檢測結(jié)果見表3。

54批樣品檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),17批標(biāo)示煙酰胺、4批標(biāo)示咖啡因、6批標(biāo)示苦參根提取物的樣品均檢出相應(yīng)功效成分;11批標(biāo)示泛醇的樣品有1批未檢出;7批標(biāo)示抗壞血酸葡糖苷的樣品有3批未檢出;21批標(biāo)示甘草類提取物(光果甘草根莖葉、甘草根、脹果甘草根)的樣品有9批未檢出相應(yīng)功效成分;21批標(biāo)示積雪草提取物的樣品有11批未檢出相應(yīng)功效成分;13批標(biāo)示茶(茶葉)提取物的樣品有8批未檢出相應(yīng)功效成分;12批人參根提取物的樣品有11批未檢出相應(yīng)功效成分;6批膜莢黃芪根提取物的樣品有5批未檢出相應(yīng)功效成分。

綜上所述,單體功效成分基本能夠檢出,而植物提取物的功效成分存在多批次未檢出。由于目前植物提取物原料缺乏基于功效成分的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致無法對(duì)產(chǎn)品標(biāo)示植物提取物進(jìn)行質(zhì)量控制,因此,建立基于功效物質(zhì)的植物提取物原料及產(chǎn)品的檢測方法及標(biāo)準(zhǔn),為進(jìn)一步規(guī)范市場行為、更好地服務(wù)化妝品監(jiān)管,具有一定的意義。

3 結(jié)論

本研究建立了化妝品中22種功效成分的超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱質(zhì)譜檢測方法,研究結(jié)果表明該方法靈敏、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,能夠高效篩查和檢測化妝品中22種功效成分,為化妝品中植物提取物和單體功效成分的檢測以及化妝品監(jiān)管工作提供了一種技術(shù)手段。