翟容容, 高 雯, 李夢寧, 楊 華

(中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院, 江蘇 南京 210009)

中藥作為一種復(fù)雜的化學(xué)體系,具有結(jié)構(gòu)類型多樣、異構(gòu)現(xiàn)象普遍、成分含量差異大、極性跨度大等分析難點(diǎn)。如何全面和精準(zhǔn)解析中藥化學(xué)成分,進(jìn)而闡明其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),一直是中藥研究中的難點(diǎn)與熱點(diǎn)問題之一。離子淌度質(zhì)譜(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)作為一種新型分析技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于脂質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究領(lǐng)域[1-4],近年來其在中藥化學(xué)成分研究中的應(yīng)用也逐步受到關(guān)注。因此,本文重點(diǎn)從離子淌度分離、碎裂模式、數(shù)據(jù)處理等方面,綜述了IM-MS在中藥化學(xué)成分分析中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 離子淌度質(zhì)譜概述

IM-MS是一種將離子淌度分離與質(zhì)譜結(jié)合的新型分析技術(shù),最早可追溯到1961年[5]。近年來IM-MS技術(shù)發(fā)展迅速,不同類型的商業(yè)化儀器平臺(tái)相繼出現(xiàn)[6],主要有漂移時(shí)間離子淌度質(zhì)譜[7](DTIM-MS)、行波離子淌度質(zhì)譜[8](TWIM-MS)、高場不對稱/差分離子淌度質(zhì)譜[9](FAIMS-MS/DMS-MS)、捕集離子淌度質(zhì)譜[10](TIMS-MS)等。目前以DTIM-MS和TWIM-MS在中藥復(fù)雜化學(xué)成分分析中應(yīng)用較多。

在IM-MS中,待分析物首先經(jīng)過離子源電離后轉(zhuǎn)化為氣相離子,隨后氣相離子在電場和緩沖氣體的相互作用下依據(jù)遷移速率不同完成快速預(yù)分離,再依據(jù)離子的質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行分離和檢測。氣相離子的分離既與其本身的形狀、大小、所帶電荷數(shù)等密切相關(guān),也與儀器參數(shù)(例如分辨率、溫度、電壓等)以及緩沖氣體的組成等有關(guān)[11]。與常規(guī)質(zhì)譜相比,IM-MS提供了多一維度的分離,有助于提高分析通量和靈敏度,同時(shí)還可進(jìn)一步結(jié)合一維[12,13]或二維[14]液相色譜(LC、2D-LC)構(gòu)建三維或四維的分離系統(tǒng),提升分析性能和效率。在信息參數(shù)獲取方面,除了提供離子一級(jí)質(zhì)譜信息(MS1)、二級(jí)質(zhì)譜信息(MS2)和離子豐度等以外,IM-MS還具有離子漂移時(shí)間(DT)、到達(dá)時(shí)間(AT)或補(bǔ)償電壓(CV)等信息。在低電場情況下,還可依據(jù)Mason-Schamp方程[15]轉(zhuǎn)化計(jì)算獲得離子的碰撞截面積(CCS),進(jìn)而提升對離子結(jié)構(gòu)的分析效率。

2 離子淌度質(zhì)譜技術(shù)在中藥化學(xué)成分分析中的應(yīng)用

2.1 分離能力及分離策略

IM-MS的淌度分離能力是對常規(guī)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的有效補(bǔ)充,特別是在改善異構(gòu)體或等量異位素的分離方面具有顯著優(yōu)勢,一方面在離子淌度分離過程中可增加化合物的分離度,另一方面還可以結(jié)合衍生化或者改變漂移氣體組成等策略進(jìn)一步提升化合物分離的選擇性。

2.1.1離子淌度分離

IM-MS增加了新的分離維度,在改善化合物分離方面具有簡單、快速的分析優(yōu)勢。例如西紅花苷Ⅲ為梔子藏紅花素類成分,通常會(huì)以順、反2種異構(gòu)體形式出現(xiàn),Wang等[16]利用LC-MS分析方法,發(fā)現(xiàn)西紅花苷Ⅲ在總離子流圖中顯示為單峰,而利用LC-TWIM-MS技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了順、反西紅花苷Ⅲ異構(gòu)體的快速拆分,還額外發(fā)現(xiàn)了新的潛在異構(gòu)體。Zhang等[17]利用2D-LC-TWIM-MS技術(shù)分析紅參和白參提取物時(shí),實(shí)現(xiàn)了10對等量異位素的分離。Bylda等[18]利用LC-DMS-MS/MS,在1.5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了洋地黃毒苷及其3種代謝物的快速分離,與LC-MS/MS相比,該方法空白血樣背景噪聲降低了10倍。此外,IM-MS還在中藥及天然產(chǎn)物小分子位置異構(gòu)體分離[19]、源內(nèi)異構(gòu)分析[20]、部分手性異構(gòu)體[21]的快速拆分中得以應(yīng)用。

近年來,一些超高分辨IM-MS，例如環(huán)形離子淌度質(zhì)譜(cIM-MS)[22]、無損離子傳輸結(jié)構(gòu)聯(lián)用質(zhì)譜(SLIM IM-MS)[23]等也有所發(fā)展,能夠?qū)崿F(xiàn)空間結(jié)構(gòu)差異非常微小的化合物分離。Colson等[24]利用LC-TWIM-MS(分辨率約40)分析中藥娑羅子成分時(shí),發(fā)現(xiàn)七葉皂苷1a/1b和異七葉皂苷1a/1b 4個(gè)異構(gòu)體不能被完全分離,4個(gè)異構(gòu)體的AT值分別為9.83、9.75、9.97和9.83 ms,而采用直接注射的超高分辨cIM-MS(分辨率約250)分析時(shí),上述4個(gè)異構(gòu)體的AT值差異增大,顯著改善了分離效果。

2.1.2調(diào)整目標(biāo)離子結(jié)構(gòu)

部分待分析物由于空間結(jié)構(gòu)近似或差異微小,在IM-MS中難以直接達(dá)到完全分離,因此也可通過引入金屬離子[25]、含金屬離子手性選擇劑(如環(huán)糊精類)[26,27]或其他衍生化試劑[28]改變待分析物離子在氣相中的形態(tài)、大小等方式提高分離選擇性。例如(-)-α-紅沒藥醇和(+)-α-紅沒藥醇是一對手性對映倍半萜異構(gòu)體,利用TWIM-MS無法實(shí)現(xiàn)直接拆分,有研究報(bào)道了引入Ag+,增加了樣品中α-紅沒藥醇對映異構(gòu)體的分離度[29]。Troc等[30]等將(-)-表兒茶素和(+)-兒茶素分別與不同的D/L型氨基酸、金屬離子、手性冠醚、酒石酸及其組合進(jìn)行離線衍生化后,再利用TWIM-MS分析發(fā)現(xiàn)D-亮氨酸和CuCl2的引入可顯著改善兒茶素對映異構(gòu)體的分離度。

2.1.3調(diào)整緩沖氣體組成

不同極化率和質(zhì)量的緩沖氣體會(huì)顯著影響離子-中性分子團(tuán)簇的形成,進(jìn)而改變離子遷移率[31]。目前最常用的緩沖氣體為氮?dú)?N2),也可使用氦氣、二氧化碳、氬氣或混合氣體作為緩沖氣體,此外還可在緩沖氣體中引入氣體改性劑(gas modifier)[32]、氣體摻雜劑(dopants)[33]等改善目標(biāo)離子的分離效率。例如,在FAIMS-MS和DMS-MS技術(shù)中常用甲醇、乙腈、異丙醇等氣體改性劑來提高分離選擇性[34-36]。Willems等[37]利用FAIMS-MS技術(shù),以N2為緩沖氣體,比較了甲醇和乙腈2種改性劑對3種單咖啡酰基奎寧酸異構(gòu)體的分離效果,結(jié)果表明甲醇的引入可使3種異構(gòu)體在1 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離,而乙腈則可能形成多聚體而影響分離效率。Wu等[38]采用DMS-MS/MS分析方法,以正丙醇作為緩沖氣體(N2)改性劑,在8.5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了3組人參皂苷類成分Rf/Rg1/F11、Rb2/Rb3/Rc和Rd/Re的最佳分離與檢測。

2.2 多重碎裂模式

IM-MS的碎片離子獲取方式主要為淌度分離后碎裂(Post-IM),即母離子經(jīng)過淌度分離后再碎裂,可獲得母離子的CCS值、MS1、MS2和離子豐度等信息。Post-IM方式輔助數(shù)據(jù)依賴性采集模式(DDA)可通過離子淌度分離,減少共流出成分或背景離子的干擾,獲取高質(zhì)量、高覆蓋率的MS2數(shù)據(jù)。例如Wang等[39]采用LC-TWIM-MS,以Post-IM方式輔助DDA模式,從防己黃芪湯中鑒定了203種化學(xué)成分。而Post-IM方式結(jié)合數(shù)據(jù)非依賴性采集模式(DIA)除了可將復(fù)雜樣品中所有成分母離子進(jìn)行離子淌度分離以外,還可根據(jù)離子到達(dá)時(shí)間或漂移時(shí)間的信息匹配,實(shí)現(xiàn)母離子及其碎片離子的快速關(guān)聯(lián),提高成分鑒定的準(zhǔn)確度與分析效率,其中以TWIM-MS的高清全信息串聯(lián)質(zhì)譜采集模式(HDMSE)、DTIM-MS的交替圖像模式(AF)等較為常見。Feng等[40]在對茯苓提取物進(jìn)行成分表征時(shí),利用LC-TWIM-MS結(jié)合HDMSE采集模式,在低碰撞能時(shí)獲取離子一級(jí)質(zhì)譜信息,在高碰撞能時(shí)獲取碎片離子信息,通過相同保留時(shí)間和漂移時(shí)間實(shí)現(xiàn)母離子及其碎片離子的快速準(zhǔn)確匹配,進(jìn)而根據(jù)特征離子和中性丟失等信息對未知化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測。Li等[41]利用LC-DTIM-MS結(jié)合DIA模式,采用保留時(shí)間和漂移時(shí)間二維定位策略,從中藥附子中快速鑒定了236種二萜生物堿,發(fā)現(xiàn)8種潛在的新的酯基取代類型。此外,也有研究者將MS1全掃描采集、Post-IM方式輔助DDA采集和HDMSE采集等多種模式交替使用以期獲得更高的分析效率,應(yīng)用該組合式質(zhì)譜掃描方法結(jié)合離線二維液相色譜分離技術(shù),從復(fù)方丹參滴丸中成功鑒定了403種化學(xué)成分[42]。

除了Post-IM方式以外,TWIM-MS還具有淌度分離前碎裂(Pre-IM)和時(shí)間排列平行碎裂(TAP)。在Pre-IM方式中,母離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后,再經(jīng)過離子淌度分離,從而對碎片離子的離子淌度遷移率進(jìn)行分析,可獲取MS1、MS2、離子豐度、碎片離子CCS值等信息[43,44]。Cheng等[45]在利用LC-TWIM-MS法分析順/反雙咖啡?？鼘幩?m/z為515.119 0)異構(gòu)體時(shí),發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體母離子特征無法區(qū)分,而碎片離子(m/z為353.088 0)則具有不同的AT值,可實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體的有效拆分。

TAP方式[46,47]可將Post-IM模式與Pre-IM模式相結(jié)合,離子在離子淌度分離前進(jìn)行碎裂獲取MS2信息,經(jīng)離子淌度分離后再碎裂得到MS3數(shù)據(jù),尤其適用于結(jié)構(gòu)相似成分的差異分析。Zhang等[48]在利用LC-TWIM-MS技術(shù)分析多環(huán)多異戊烯基取代間苯三酚類化合物(PPAPs)時(shí),將源內(nèi)裂解與TAP模式相結(jié)合,歸納和總結(jié)了4種不同亞型PPAPs的裂解途徑和行為,從嶺南山竹子中成功鑒定了140種PPAPs。

2.3 數(shù)據(jù)處理策略

高維質(zhì)譜數(shù)據(jù)集的整合分析是提升中藥小分子化合物鑒定效率的有效手段。IM-MS除了提供離子保留時(shí)間、MS1、MS2、離子豐度等信息以外,還豐富了CCS值、漂移時(shí)間等數(shù)據(jù)類型,尤其是CCS值的引入進(jìn)一步提升了質(zhì)譜對于小分子化合物的鑒定能力與效率。

2.3.1實(shí)驗(yàn)碰撞截面積

研究顯示化合物的CCS值具有較高的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性[49,50],有研究人員根據(jù)對照品測定的實(shí)驗(yàn)CCS值構(gòu)建了一系列本地或共享的CCS數(shù)據(jù)庫,通過檢索查詢、信息比對,可用于未知化合物的輔助鑒定[51]。例如McCullagh等[52]利用LC-TWIM-MS自建了甜菊糖苷不同加合物母離子MS1、TWCCSN2數(shù)據(jù)庫(TWCCSN2:采用TWIM-MS技術(shù)和緩沖氣體N2時(shí)所獲取的CCS值),通過實(shí)測數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫信息的綜合比對,有助于提升異構(gòu)體的鑒定效率,并減少對碎片離子信息的依賴。因此近年來CCS數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建逐步引起了研究人員的關(guān)注,例如Picache等[53]構(gòu)建了包含3 833個(gè)DTCCSN2值的數(shù)據(jù)庫(DTCCSN2:采用DTIM-MS技術(shù)和緩沖氣體N2時(shí)所獲取的CCS值)。采用化學(xué)對照品測定方式構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)CCS數(shù)據(jù)庫具有較高的準(zhǔn)確度,但實(shí)驗(yàn)成本相對也較高。

2.3.2理論碰撞截面積

除了根據(jù)化學(xué)對照品測定CCS值以外,還可以根據(jù)化合物最低能量構(gòu)型,利用近似投影模型[54]、精確硬球散射模型[55]、軌跡模型[56]等計(jì)算模型,計(jì)算化合物的理論CCS值。該方法不依賴化學(xué)對照品,但計(jì)算的要求相對較高。例如姜黃素在溶液中存在酮和烯醇2種互變異構(gòu)體,Nag等[57]運(yùn)用TWIM-MS檢測得到姜黃素酮-烯醇互變異構(gòu)體的實(shí)驗(yàn)TWCCSN2值,通過密度泛函理論和軌跡模型計(jì)算得到姜黃素烯醇的理論CCS值,將兩者進(jìn)行趨勢匹配進(jìn)而成功指認(rèn)溶液中酮-烯醇互變異構(gòu)體,進(jìn)一步通過理論化學(xué)發(fā)現(xiàn)L形彎曲的酮結(jié)構(gòu)比平面烯醇的空間結(jié)構(gòu)更緊湊,因而姜黃素酮結(jié)構(gòu)的CCS值較小。Wang等[58]運(yùn)用理論CCS值與實(shí)驗(yàn)DTCCSN2值趨勢匹配的方法,成功鑒定了4種槲皮素葡萄糖醛酸位置異構(gòu)體代謝產(chǎn)物。此外,Colby等[59]開發(fā)了ISiCLE理論CCS值計(jì)算方法,創(chuàng)建了開放共享CCS數(shù)據(jù)庫(https://metabolomics.pnnl.gov/),包含了理論CCS值和實(shí)驗(yàn)CCS值在內(nèi)的100多萬個(gè)CCS數(shù)據(jù)。

2.3.3預(yù)測碰撞截面積

CCS值通常被認(rèn)為是化合物的固有性質(zhì)之一,但已知的CCS值數(shù)量有限,在一定程度上限制了其應(yīng)用。近年來,不斷有研究者以已知CCS數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集,利用支持向量機(jī)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[60]、偏最小二乘法[61]、深度學(xué)習(xí)[62]等機(jī)器學(xué)習(xí)算法,構(gòu)建CCS預(yù)測模型。例如Zhou等采用化合物分子描述符,利用支持向量機(jī)模型,先后開發(fā)了MetCCS[63]、LipidCCS[64]、ALLCCS[65]等方法實(shí)現(xiàn)對代謝物、脂質(zhì)、小分子化合物等CCS值的大規(guī)模預(yù)測?；衔顲CS預(yù)測模型及數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建,極大地拓展了其在中藥研究中的應(yīng)用。Shi等[66]分析人參、西洋參、三七的脂質(zhì)成分時(shí),應(yīng)用MS-CCS二元搜索鑒定策略,以HMDB/LipidMaps數(shù)據(jù)庫依據(jù)MS1或MS2搜索潛在的化合物結(jié)構(gòu),以LipidCCS獲取潛在的CCS值,進(jìn)而通過與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匹配,確認(rèn)未知化合物結(jié)構(gòu)。

2.3.4質(zhì)荷比-碰撞截面積趨勢分析

不同類型化合物CCS值變化與其m/z變化可能呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,當(dāng)不同類型的化合物CCS對其m/z作回歸分析時(shí),會(huì)產(chǎn)生各自的回歸曲線,該曲線也被稱之為CCS-m/z趨勢線[67]。通過化合物趨勢線的輔助分析,有助于從復(fù)雜體系中快速指認(rèn)特定類型的化學(xué)成分[68]。例如Ye等[69]分析了山楂中有機(jī)酸類、黃酮類、黃烷酮類和三萜類成分的DTCCSN2與m/z函數(shù)關(guān)系圖,結(jié)果提示4類化合物的CCS-m/z趨勢線有顯著差異。Li等[70]集成利用趨勢線分析等方法,發(fā)現(xiàn)多電荷原花青素聚合體離子DTCCSN2與m/z為乘冪關(guān)系,且與成分聚合度、電荷數(shù)、結(jié)構(gòu)單元間A型連接方式正相關(guān)。此外,Li等[71]還建立CCS-m/z乘冪回歸趨勢線預(yù)測區(qū)間,結(jié)合質(zhì)量虧損過濾,從味連、云連、雅連、延胡索中分別鑒定出86、102、73和57種異喹啉生物堿類成分,相比于經(jīng)典的質(zhì)量虧損過濾策略,該方法的準(zhǔn)確度更高。

3 總結(jié)和展望

綜上所述,IM-MS作為新型分析技術(shù),是對常規(guī)質(zhì)譜在中藥復(fù)雜體系中小分子分離和鑒定方面的有效補(bǔ)充,在中藥化學(xué)成分分析研究中逐漸被關(guān)注。但I(xiàn)M-MS在中藥研究中的應(yīng)用尚處于起步階段,還有一些值得深入研究的方向和挑戰(zhàn)。例如現(xiàn)有IM-MS技術(shù)在中藥化學(xué)成分分析中的研究主要集中在體外分離和表征分析中,很少應(yīng)用于中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定、中藥代謝組學(xué)等研究領(lǐng)域。此外,CCS作為化合物離子的固有性質(zhì),可用于中藥化學(xué)成分的表征,但現(xiàn)有報(bào)道的中藥化學(xué)成分及天然產(chǎn)物CCS非常有限,進(jìn)一步融合計(jì)算機(jī)化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科手段來構(gòu)建中藥化學(xué)成分及天然產(chǎn)物CCS庫,更有助于實(shí)現(xiàn)中藥化學(xué)成分全面、快速、精準(zhǔn)分析。