鄭友峰，陳家蘭，肖 昉，安子賢，李宜軒，賴鐘雄，牟建梅，劉生財，①

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 蘇州 215000)

莧菜(AmaranthustricolorLinn.)為莧科(Amaranthaceae)莧屬(AmaranthusLinn.)一年生C4草本植物，耐熱不耐寒，主要次生代謝產(chǎn)物甜菜色素具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1，2]。莧菜生長的適宜溫度為23 ℃～27 ℃，20 ℃以下生長緩慢，10 ℃以下種子發(fā)芽困難[3]。

溫度是影響植物生長和次生代謝產(chǎn)物合成的重要因子。低溫脅迫使植物基因表達(dá)水平和細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，物質(zhì)交換減少，水分代謝失調(diào)，葉片萎蔫，嚴(yán)重的可導(dǎo)致植株死亡[4-6]。植物光合作用對溫度變化較為敏感，低溫導(dǎo)致植物葉綠素合成減少，光合作用受到抑制，從而影響植物生長發(fā)育[7，8]。例如：低溫脅迫下小麥(TriticumaestivumLinn.)和玉米(ZeamaysLinn.)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)下降，葉綠素含量降低，光合作用減弱[9，10]。高粱〔Sorghumbicolor(Linn.)Moench〕通過光合作用相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)來響應(yīng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)及葉綠素含量的下降[11]。

目前，關(guān)于溫度對莧菜影響的研究主要在種子萌發(fā)和組培苗生長方面[12，13]，對于溫度調(diào)控莧菜光合作用的機制尚不明確，研究通過控制溫度提高莧菜的光合作用，進(jìn)而增加莧菜的產(chǎn)量及甜菜色素的含量，對于指導(dǎo)莧菜的栽培和生產(chǎn)具有重要的意義。鑒于此，本試驗以莧菜品種‘蘇莧1號’(‘Suxian No.1’)為材料，研究不同溫度處理對莧菜株高、甜菜色素含量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合作用相關(guān)基因表達(dá)的影響，探究溫度調(diào)控莧菜光合作用的機制，以期為溫度調(diào)控莧菜生長提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為莧菜品種‘蘇莧1號’種子，由蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；試驗基質(zhì)為泥炭土，由濰坊達(dá)軒商貿(mào)有限公司提供。將飽滿的種子播撒于直徑12 cm的盆中，每盆30粒，共40盆。置于恒溫培養(yǎng)室中，光照強度100 μmol·m-2·s-1、光照時間16 h·d-1、溫度(25±1)℃，間苗后每盆留7或8株培養(yǎng)至三葉一心。將材料隨機分4組，轉(zhuǎn)入不同溫度〔25 ℃(對照)、20 ℃、15 ℃、10 ℃〕的恒溫光照培養(yǎng)箱中，光照強度100 μmol·m-2·s-1、光照時間16 h·d-1。在不同溫度下處理3和6 d后，分為2組。一組進(jìn)行暗處理，用于葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定；另一組每種處理隨機取10株莧菜成熟葉片約5 g，混合后從中取30份，每份0.1 g。取3份葉片用于葉綠素含量測定，其余葉片液氮預(yù)冷后放于-80 ℃保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 株高的測定 采用直尺(精度0.1 cm)測量莧菜株高(根部至頂端第1枚葉片葉柄間的距離)，每個處理測量30株，結(jié)果取平均值。

1.2.2 甜菜色素含量的測定 參照王曉[14]的方法提取甜菜色素，取3份0.1 g莧菜葉片用液氮磨成粉末，按料液比(m∶V)1∶30加入無水乙醇，4 ℃靜置30 min，8 000 r·min-1室溫離心10 min，棄上清液，再按料液比(m∶V)1∶30加入雙蒸水，4 ℃靜置30 min，8 000 r·min-1室溫離心10 min，取上清液，用UV-900紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)在波長538 nm處測定甜菜紅素的吸光值，在波長465 nm處測定甜菜黃素的吸光值，并根據(jù)文獻(xiàn)[14]中的方法計算甜菜黃素和甜菜紅素的含量。

1.2.3 葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 參考張秀君等[15]的方法提取葉綠素，取3份0.1 g莧菜葉片置于10 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中浸泡24 h，取上清液，用UV-900紫外可見分光光度計分別在波長665和649 nm處測定葉綠素的吸光值，并根據(jù)文獻(xiàn)[15]中的方法計算葉綠素a和葉綠素b的含量。

不同處理的莧菜植株暗處理0.5 h后，每盆選擇高度一致、部位相同的莧菜葉片1枚，在黑暗環(huán)境下，利用IMAGING-PAM葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(德國Walz公司)測定莧菜葉片的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量〔Y(NO)〕、PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)額〔Y(Ⅱ)〕、相對電子傳遞速率(rETR)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)和調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量〔Y(NPQ)〕6個葉綠素?zé)晒鈪?shù)。每個處理3盆(即3次重復(fù))。

1.2.4 qRT-PCR 用天漠植物RNA提取試劑盒(北京天漠科技開發(fā)公司)提取葉片RNA；用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；參照Hieff?qPCR SYBR?Gree Master Mix試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)進(jìn)行混樣。qRT-PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s、59 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共45個循環(huán)。根據(jù)Cp值(crossing point)和溶解曲線檢測結(jié)果的完整性。

根據(jù)莧菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(SRA登錄號SSR924089-SSR924092)篩選出參與光合作用的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(PPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-MDH)、NAD-蘋果酸酶(NAD-ME)、NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)和丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)的基因，通過NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對確定ORF區(qū)，用DNAMAN 9.0軟件設(shè)計引物(表1)，由福州博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

使用EXCEL 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；根據(jù)2-ΔΔCT法[16]計算基因相對表達(dá)量；使用SPSS 22.0軟件，采用多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，并進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析；使用Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同溫度對莧菜株高的影響

不同溫度對莧菜株高的影響見表2。結(jié)果顯示：處理3和6 d的莧菜株高隨著溫度降低呈現(xiàn)降低的趨勢。處理3 d，15 ℃和10 ℃處理下的莧菜株高均極顯著低于25 ℃(對照)；處理6 d，20 ℃、15 ℃和10 ℃處理下的莧菜株高均極顯著低于對照。同一處理溫度下，處理6 d的莧菜株高均高于處理3 d，但隨著溫度降低，幼苗生長逐漸受到抑制，10 ℃處理下的莧菜植株已經(jīng)基本停止生長。

表2 不同溫度對莧菜株高的影響

2.2 不同溫度對莧菜葉片中甜菜色素含量的影響

不同溫度對莧菜葉片中甜菜色素含量的影響見表3。結(jié)果顯示：處理3和6 d的莧菜葉片中甜菜色素(甜菜紅素和甜菜黃素)含量隨著溫度降低呈現(xiàn)降低的趨勢。處理3 d，20 ℃處理下葉片中甜菜黃素含量顯著低于25 ℃(對照)，15 ℃和10 ℃處理下葉片中甜菜色素含量均極顯著低于對照；處理6 d，20 ℃處理下葉片中甜菜紅素含量極顯著低于對照，15 ℃和10 ℃處理下葉片中甜菜色素含量均極顯著低于對照。隨著處理時間的延長，不同溫度處理下葉片中甜菜色素含量明顯升高。

表3 不同溫度對莧菜葉片中甜菜色素含量的影響

2.3 不同溫度對莧菜葉片中葉綠素素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

不同溫度對莧菜葉片中葉綠素含量的影響見表4，對莧菜葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見表5。

結(jié)果(表4)顯示：處理3和6 d的莧菜葉片中葉綠素(葉綠素a和葉綠素b)含量隨著溫度降低呈現(xiàn)降低的趨勢，且15 ℃和10 ℃處理下葉片中葉綠素含量總體極顯著低于25 ℃(對照)。隨著處理時間的延長，15 ℃和10 ℃處理下葉片中葉綠素含量明顯降低。

表4 不同溫度對莧菜葉片葉綠素含量的影響

結(jié)果(表5)顯示：總體上看，隨著溫度降低，處理3和6 d的莧菜葉片的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)額〔Y(Ⅱ)〕、相對電子傳遞速率(rETR)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)和調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量〔Y(NPQ)〕呈現(xiàn)波動降低的趨勢，非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量〔Y(NO)〕呈現(xiàn)波動升高的趨勢，且10 ℃處理下葉片的Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETR、qN和Y(NPQ)值極顯著低于對照，Y(NO)值則極顯著高于對照。隨著處理時間的延長，不同溫度處理下葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化不明顯。

表5 不同溫度對莧菜葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.4 不同溫度對莧菜葉片光合作用相關(guān)基因表達(dá)的影響

不同溫度對莧菜葉片光合作用相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響見表6。結(jié)果顯示：總體上看，隨著溫度降低，處理3 d的莧菜葉片AtrPPCK基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，AtrPEPC和AtrNADP-MDH基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，AtrMDH、AtrNAD-ME、AtrNADP-ME和AtrPPDK基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)降低的趨勢。20 ℃、15 ℃和10 ℃處理下葉片AtrMDH、AtrNAD-ME、AtrNADP-ME和AtrPPDK基因的相對表達(dá)量均極顯著低于25 ℃(對照)，10 ℃處理下葉片AtrPPCK基因的相對表達(dá)量極顯著高于對照，10 ℃處理下葉片的AtrPEPC和AtrNADP-MDH基因的相對表達(dá)量均極顯著低于對照。隨著溫度降低，處理6 d的莧菜葉片AtrPPCK基因的相對表達(dá)量也呈先降低后升高的趨勢，AtrPEPC、AtrMDH、AtrNADP-MDH、AtrNAD-ME和AtrPPDK基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，AtrNADP-ME基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后略有升高的趨勢；10 ℃處理下葉片的AtrPPCK基因的相對表達(dá)量極顯著高于對照，其他5個基因的相對表達(dá)量均極顯著低于對照。

表6 不同溫度對莧菜葉片光合作用相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

總體上看，6個基因在多數(shù)溫度下處理3和6 d均與對照有顯著差異；溫度較低(10 ℃)會抑制除了AtrPPCK基因外的其他基因的表達(dá)，隨著處理時間延長，基因相對表達(dá)量略有回升。

2.5 莧菜各指標(biāo)與溫度的相關(guān)性分析

莧菜株高和生理生化指標(biāo)與溫度的相關(guān)系數(shù)見表7。結(jié)果顯示：溫度與處理3和6 d的株高、甜菜紅素含量、甜菜黃素含量、葉綠素a含量和葉綠素b含量以及PSⅡ最大光化學(xué)效率均呈極顯著正相關(guān)，與非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額呈顯著負(fù)相關(guān)，與處理3 d的非光化學(xué)淬滅系數(shù)和調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額呈極顯著正相關(guān)，與處理6 d的PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)額和相對電子傳遞速率呈極顯著正相關(guān)。

表7 莧菜株高和生理生化指標(biāo)與溫度的相關(guān)系數(shù)1)

3 討論和結(jié)論

3.1 低溫對莧菜生長及甜菜色素含量的影響

設(shè)施大棚是保證莧菜進(jìn)行周年有效生產(chǎn)的主要方式之一，可在一定程度上緩解低溫傷害，但也存在不足之處，如沒有加溫設(shè)施的棚室晝夜溫差過大，對植物生長有更大傷害，也可能因覆蓋棚體影響光照，對莧菜生長產(chǎn)生其他影響[1]。溫度作為影響植物生長的重要環(huán)境因子，低溫環(huán)境下植物的生長發(fā)育受到抑制，表現(xiàn)出苗弱、生長遲緩、萎蔫皺縮、失綠黃化、產(chǎn)量降低等[17]。如狗牙根〔Cynodondactylon(Linn.)Persoon〕的生長速率隨著溫度降低呈顯著降低的趨勢[18]；低溫脅迫下苜蓿(MedicagosativaLinn.)幼苗植株較弱，生長緩慢，長期低溫甚至?xí)?dǎo)致幼苗死亡[19]。本研究中，莧菜株高隨著溫度的降低而降低，在15 ℃和10 ℃處理3 d時受到顯著抑制，隨著處理時間的延長，20 ℃處理6 d的莧菜生長速度也受到顯著抑制，10 ℃處理6 d的莧菜基本停止生長。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：株高與溫度呈極顯著正相關(guān)。說明溫度較低(15 ℃和10 ℃)會抑制莧菜的生長，長期處于20 ℃時莧菜的生長也會受到抑制。

溫度也是影響植物次生代謝的重要因子[20]。莧菜主要次生代謝產(chǎn)物甜菜色素的合成也受到溫度的調(diào)控，當(dāng)溫度低于20 ℃時甜菜色素的合成受到抑制[21]。本研究結(jié)果顯示：莧菜葉片中甜菜色素含量隨著溫度降低而降低，15 ℃和10 ℃處理3 和6 d葉片中甜菜色素含量均極顯著低于25 ℃(對照)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：甜菜紅素含量和甜菜黃素含量與溫度均呈極顯著正相關(guān)。說明溫度較低(15 ℃和10 ℃)會降低莧菜葉片中甜菜色素的含量，15 ℃和10 ℃均不利于甜菜色素的合成與積累。

3.2 低溫對莧菜光合作用及相關(guān)基因表達(dá)的影響

葉綠素是植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素[22]。低溫會破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，使葉綠素合成受到抑制，從而影響植物光合作用[23]。如海濱雀稗(PaspalumvaginatumSwartz)在低溫脅迫下葉綠素含量明顯降低[24]；秋石斛(Dendrobiumspp.)的葉綠素含量隨著溫度降低和處理時間延長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢[25]。本文中，處理3和6 d的莧菜葉片中葉綠素含量均隨著溫度降低而降低，15 ℃和10 ℃處理下葉片中葉綠素含量均顯著低于25 ℃(對照)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：葉綠素a含量和葉綠素b含量與溫度均呈極顯著正相關(guān)。說明溫度較低(15 ℃和10 ℃)不利于莧菜葉綠素的合成，降低葉綠素含量，且隨著處理時間延長，其對葉綠素含量的抑制效果更明顯。

植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)受抑制的程度與環(huán)境脅迫的程度呈顯著相關(guān)，利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可以檢測出葉綠體對溫度變化的響應(yīng)[26]。低溫條件下PSⅡ受到抑制，導(dǎo)致植物的PSⅡ光化學(xué)效率和電子傳輸能力降低，并且植物的相對凈光合速率(Pn)與PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)額〔Y(Ⅱ)〕等呈顯著正相關(guān)[27，28]。在多刺綠絨蒿(MeconopsishorridulaHook.f.et Thoms)和彩葉草〔Coleusscutellarioides(Linn.)Benth.〕的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫下其Fv/Fm值、Y(Ⅱ)值、相對電子傳遞效率(rETR)顯著降低，而qN值隨著溫度的降低先升高后降低，調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量〔Y(NPQ)〕和非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量〔Y(NO)〕則逐漸升高[29，30]。本研究結(jié)果顯示:處理3和6 d，20 ℃和15 ℃處理下莧菜葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)總體與對照無顯著差異，10 ℃處理下葉片的Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETR、qN和Y(NPQ)值總體顯著低于對照，僅Y(NO)值顯著高于對照。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：Y(NO)值與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，而Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETR、qN和Y(NPQ)值與溫度在不同處理時間呈極顯著正相關(guān)。說明20 ℃和15 ℃對莧菜的葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響不大，而10 ℃處理會引起莧菜葉綠素?zé)晒鈪?shù)的顯著變化，推測可能是較低溫度(10 ℃)下莧菜的葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，葉綠素含量降低，導(dǎo)致光合系統(tǒng)受損[7，31]。

在植物C4光合作用途徑中，PPCK先將PEPC去磷酸化，再由PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與CO2反應(yīng)生成草酰乙酸(OAA)，經(jīng)MDH和NADP-MDH將草酰乙酸催化生成蘋果酸，然后由NAD(P)-ME催化蘋果酸生成丙酮酸，再由PPDK將丙酮酸催化重新形成CO2受體PEP[32-36]。光合作用途徑中酶的活性極易受到溫度的影響，如水稻(OryzasativaLinn.)[37，38]、甘蔗(SaccharumofficinarumLinn.)[39]、擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.)Heynh.〕[40]和柳枝稷(PanicumvirgatumLinn.)[41]的光合作用酶活性在低溫下顯著下降。處理3和6 d，莧菜光合作用相關(guān)基因的表達(dá)也受到溫度的調(diào)控。qRT-PCR結(jié)果顯示：不同溫度處理下莧菜AtrPPCK、AtrPEPC、AtrMDH、AtrNADP-MDH、AtrNAD-ME、AtrNADP-ME和AtrPPDK基因的相對表達(dá)量總體與對照存在顯著差異，并且較低溫度(10 ℃)抑制除了AtrPPCK基因外其他基因的表達(dá)。此外，隨著溫度的降低AtrPPCK基因的相對表達(dá)量先降低后升高，而AtrPEPC基因的相對表達(dá)量則先升高后降低。推測隨著溫度的降低，莧菜在20 ℃和15 ℃條件下AtrPPCK基因的表達(dá)受到抑制，對PEPC的去磷酸化作用減弱，使得AtrPEPC基因上調(diào)表達(dá)；而在10 ℃環(huán)境下AtrPPCK基因的表達(dá)增加，提高了對PEPC的去磷酸化作用，AtrPEPC基因的表達(dá)受到抑制[42,43]。因此，溫度通過影響PPCK對PEPC的去磷酸化作用，可作為溫度調(diào)控植物光合作用的方式之一。

綜上所述，低溫可能通過降低莧菜的葉綠素含量，破壞光合系統(tǒng)，抑制光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低莧菜主要次生代謝產(chǎn)物甜菜色素的積累，最后導(dǎo)致植株的生長受到抑制。由于眾多的代謝通路參與到莧菜的光合作用途徑，因此，對于低溫引起光合作用基因差異表達(dá)的調(diào)控機制還有待深入了解，基因功能還需進(jìn)一步驗證。