童一涵，鄭 倩，杜新明，馮士令，周莉君，丁春邦，陳 濤

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014)

多齒紅山茶(CamelliapolyodontaHow ex Hu)隸屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaLinn.)，又稱宛田紅花油茶，1965年由How ex Hu定名并且將其歸入山茶屬紅山茶組〔Sect.Camellia(Linn.)Dyer〕[1]58。紅山茶組植物花色鮮紅，花期長(zhǎng)，雨后花色不變，被廣泛應(yīng)用于園林城市、旅游景區(qū)等的綠化，是西部地區(qū)發(fā)展觀光旅游的優(yōu)良樹(shù)種[2]。中國(guó)是紅山茶組植物的分布中心，種質(zhì)資源豐富，其中多齒紅山茶主要分布在海拔900 m的山坡闊葉林和林緣。由于紅山茶組植物所處的自然地理環(huán)境不同，物種廣泛重疊和自然雜交，導(dǎo)致種間變異，特別是具有栽培歷史的觀賞花卉和油料植物，在進(jìn)一步人工引種栽培后，還會(huì)引起染色體多倍化，使種間變異更為復(fù)雜多樣，導(dǎo)致紅山茶組植物的種類劃分、擴(kuò)散路線、分化和進(jìn)化趨勢(shì)尚存在較大分歧。

許多專家從分類學(xué)角度對(duì)山茶屬植物進(jìn)行了相關(guān)的研究，目前，國(guó)內(nèi)主要參考張宏達(dá)[1]5和閔天祿[3]的分類系統(tǒng)，但這2個(gè)分類系統(tǒng)之間存在很大的差異，其原因?yàn)樾螒B(tài)學(xué)的傳統(tǒng)物種分類方法易受環(huán)境因子影響[4]。而以分子鐘理論為基礎(chǔ)，精確地研究物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可為解決存在爭(zhēng)議的分類問(wèn)題提供更加可靠的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考[5]。20世紀(jì)60年代初，在地錢(qián)(MarchantiapolymorphaLinn.)[6]中首次報(bào)道了葉綠體基因組全序列。植物葉綠體基因組遠(yuǎn)小于核基因組，具有分子量適中、便于測(cè)序、多拷貝、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、DNA的核苷酸置換率適中、編碼區(qū)和非編碼區(qū)的分子進(jìn)化速度差異顯著以及各類群葉綠體基因組之間具有良好的共線性的特點(diǎn)[7]，且植物葉綠體具有一套獨(dú)立于核基因組外的母系遺傳的葉綠體基因組[8]。隨著系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和基因組學(xué)的交融，在植物系統(tǒng)發(fā)育研究中，基于葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究?jī)?yōu)勢(shì)漸顯端倪[9]，為一些分類困難類群的系統(tǒng)學(xué)問(wèn)題提供了新的解決方案。

目前，多齒紅山茶葉綠體基因組信息缺乏，關(guān)于山茶屬進(jìn)化分類的相關(guān)研究結(jié)論的可靠性有限，影響了該優(yōu)良資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用，隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，植物全基因組測(cè)序具備了速度快、通量高、成本低、高精度的特點(diǎn)[10]。鑒于此，本研究使用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)未被GenBank收錄的多齒紅山茶進(jìn)行高深度重測(cè)序，利用測(cè)得的核基因組序列信息組裝出葉綠體基因組，對(duì)其序列特征及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，以期為多齒紅山茶資源的開(kāi)發(fā)和利用、近緣種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及山茶屬植物的進(jìn)化和分類研究提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料多齒紅山茶為四川省雅安市天全縣城廂鎮(zhèn)大崗山(東經(jīng)102°46′59″、北緯30°04′25″)原生分布單株，樹(shù)齡約20 a，于2021年3月每株采集新稍嫩葉3～5枚，共采集6株，混合后裝入含有硅膠的自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取及測(cè)序 使用改良CTAB法[11]提取葉片總DNA，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)檢測(cè)DNA濃度和純度，將總DNA進(jìn)行隨機(jī)打斷、末端修復(fù)、連接接頭構(gòu)建500 bp的測(cè)序文庫(kù)，使用HiSeq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行雙末端重測(cè)序，測(cè)序由深圳華大基因股份有限公司完成。原始數(shù)據(jù)剔除接頭污染和低質(zhì)量序列，得到3.92 Gb合格數(shù)據(jù)。

1.2.2 葉綠體基因組組裝與注釋 過(guò)濾后的數(shù)據(jù)使用GetOrganelle軟件[12]進(jìn)行多齒紅山茶葉綠體基因組的從頭組裝,最后獲得1條環(huán)形的葉綠體基因組序列。使用CPGAVAS2在線注釋工具(http:∥47.90.241.85:16019/analyzer/home)[13]對(duì)獲得的葉綠體基因組序列信息進(jìn)行在線注釋,以NCBI上已發(fā)表的近緣種滇山茶(CamelliareticulataLindl.)(GenBank登錄號(hào)KJ806278.1)的葉綠體基因組信息作為參考序列，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，經(jīng)人工校正后，將多齒紅山茶葉綠體基因組序列上傳至NCBI(GenBank登錄號(hào)OK377261)，最后再使用Chloroplot在線工具(https:∥irscope.shinyapps.io/Chloroplot/)[14]繪制葉綠體基因組圖譜。

通過(guò)JSHYCloud在線工具集(http:∥cloud.genepioneer.com:9929)分析并統(tǒng)計(jì)葉綠體基因組、大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSC)和反向重復(fù)區(qū)(IR)的GC含量。

1.2.3 重復(fù)序列與IR區(qū)邊界結(jié)構(gòu)差異分析 使用MISA在線工具(https:∥webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php)[15]的微衛(wèi)星定位檢測(cè)技術(shù)對(duì)多齒紅山茶葉綠體基因組序列中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列進(jìn)行搜索，參數(shù)設(shè)置參考文獻(xiàn)[16]，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最小重復(fù)值分別設(shè)置為10、6、5、5、5、5。

通過(guò)JSHYCloud在線工具集分析葉綠體基因組IR區(qū)邊界結(jié)構(gòu)差異，從NCBI中選同為紅山茶組的南山茶(C.semiserrataC.W.Chi)(GenBank登錄號(hào)MZ403753.1)和毛蕊紅山茶〔C.mairei(Lévl.)Melch.〕(GenBank登錄號(hào)KY406767.1)葉綠體基因組來(lái)比對(duì)同組不同物種間葉綠體基因組異同，選油茶(C.oleiferaAbel.)(GenBank登錄號(hào)MN078090.1)來(lái)比對(duì)不同組間物種的葉綠體基因組異同，選擇與山茶屬親緣關(guān)系最近的木荷屬(SchimaReinw.)的木荷(S.superbaGardn.et Champ.)(GenBank登錄號(hào)MH782179.1)作為外類群。

1.2.4 密碼子偏好性分析 通過(guò)Pasteur Galaxy在線工具集(https:∥galaxy.pasteur.fr/CodonW)[17]中的CodonW模塊分析密碼子使用情況，設(shè)置輸出結(jié)果為有效密碼子數(shù)(ENC)和相對(duì)同義密碼子使用度(RSCU)，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值[18]。ENC>35表示含有較多種類的稀有密碼子，且基因表達(dá)量偏低；某一密碼子的RSCU>1.00表示編碼對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)時(shí)偏好使用該密碼子，RSCU<1.00表示不偏好使用該密碼子，RSCU=1.00表示該密碼子沒(méi)有偏好性。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 將多齒紅山茶葉綠體基因組序列上傳至NCBI進(jìn)行BLASTn比對(duì)，選擇highly similar sequence(megablast)來(lái)比較相似性在95%以上的序列，檢索獲得多齒紅山茶的近緣種，以明確多齒紅山茶葉綠體基因組序列在山茶屬中的系統(tǒng)關(guān)系。

從比對(duì)結(jié)果中篩除栽培種和地方種，下載山茶屬22個(gè)野生近緣種，使用MAFFT v7軟件[19]進(jìn)行多序列比對(duì)后，使用MEGA X軟件[20]校正序列，使用ModelFinder軟件[21]計(jì)算出最佳的最大似然法(ML)建樹(shù)模型，再以木荷葉綠體基因組序列作為外類群，使用IQ-TREE軟件[22]建樹(shù)，設(shè)置自展支持率為1 000，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，最后使用iTOL v5在線工具(https:∥itol.embl.de/)[23]和ChiPlot網(wǎng)站(https:∥www.chiplot.online/)調(diào)整系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 多齒紅山茶葉綠體基因組序列特征分析

經(jīng)過(guò)測(cè)序組裝的完整的多齒紅山茶葉綠體基因組長(zhǎng)度為156 778 bp，基因組圖譜(圖1)顯示：葉綠體基因組呈典型的四分體結(jié)構(gòu)，由1個(gè)大單拷貝區(qū)(LSC)、1個(gè)小單拷貝區(qū)(SSC)和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)(IR)共4部分組成，其中，LSC、SSC和IR區(qū)的長(zhǎng)度分別為86 493、18 219和26 033 bp。基因組的總GC含量為37.33%，其中，LSC、SSC和IR區(qū)的GC含量分別為35.34%、30.60%和42.98%。

：光系統(tǒng)Ⅰ Photosystem Ⅰ; ：光系統(tǒng)Ⅱ Photosystem Ⅱ; ：細(xì)胞色素b/f復(fù)合體Cytochrome b/f complex; ：ATP合成酶 ATP synthase；：NADH脫氫酶NADH dehydrogenase; ：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亞基Large subunit of rubisco; ：RNA聚合酶RNA polymerase；：核糖體小亞基Small subunit of ribosome; ：核糖體大亞基Large subunit of ribosome; ：蛋白酶，翻譯起始因子，成熟酶Protease，translational initiation factor, maturase; ：tRNA；：保守開(kāi)放閱讀框Conserved open reading frame; ：rRNA; ：其他Other.LSC：大單拷貝區(qū)Large single copy region; SSC: 小單拷貝區(qū)Small single copy region; IR: 反向重復(fù)區(qū)Inverted repeat region.內(nèi)圈深灰色表示GC含量，括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)為CDS基因的密碼子偏性指數(shù)The dark gray part of inner circle represents the GC content, and the data in brackets are the codon bias indexes of the CDS genes.

2.2 多齒紅山茶葉綠體基因類型分析

對(duì)多齒紅山茶葉綠體基因組進(jìn)行在線注釋，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：共注釋到光合作用基因、自我復(fù)制基因、其他基因和未知功能基因4類，包括87個(gè)CDS基因、37個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因，共132個(gè)基因。

表1 多齒紅山茶葉綠體基因列表

對(duì)有多個(gè)外顯子的葉綠體基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示：由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成的基因有19個(gè)，包括11個(gè)CDS基因和8個(gè)tRNA基因，其中有4個(gè)基因在IR區(qū)重復(fù)；由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子構(gòu)成的基因有ycf3和clpP，均為CDS基因；rps12基因?yàn)榉词郊羟?，只統(tǒng)計(jì)2個(gè)外顯子。

表2 多齒紅山茶葉綠體基因組中具有多個(gè)外顯子的基因信息

2.3 多齒紅山茶葉綠體基因重復(fù)序列分析

多齒紅山茶葉綠體基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)的類型及分布見(jiàn)表3。

表3 多齒紅山茶葉綠體基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)的類型及分布

結(jié)果顯示：在多齒紅山茶葉綠體基因組中共檢測(cè)到52個(gè)SSR位點(diǎn)，其中，有39個(gè)位于LSC區(qū)(占比75.0%)，有9個(gè)位于SSC區(qū)(占比17.3%)，有4個(gè)位于IR區(qū)(占比7.7%)。這些重復(fù)序列均為單堿基(A/T)的重復(fù)類型，其中，重復(fù)單元為A、重復(fù)頻率為11的SSR位點(diǎn)數(shù)量最多(7)，重復(fù)單元為T(mén)、重復(fù)頻率為10的SSR位點(diǎn)數(shù)量最多(12)，重復(fù)單元為A/T的最高重復(fù)頻率為17。

2.4 多齒紅山茶IR區(qū)邊界結(jié)構(gòu)差異分析

結(jié)果(圖2)顯示：5種山茶科植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)從大單拷貝區(qū)(LSC)中間呈線性展開(kāi)，均由1個(gè)LSC區(qū)、1個(gè)小單拷貝區(qū)(SSC)和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)(IR)4部分組成，各個(gè)區(qū)域間對(duì)應(yīng)的連接基因也基本相同，僅南山茶注釋到了橫跨JSB(IRb和SSC區(qū)的邊界)和JSA(SSC和IRa區(qū)的邊界)邊界的假基因ycf1。

JLB: LSC和IRb區(qū)的邊界Boundary of LSC and IRb regions; JSB: IRb和SSC區(qū)的邊界Boundary of IRb and SSC regions; JSA: SSC和IRa區(qū)的邊界Boundary of SSC and IRa regions; JLA: IRa和LSC區(qū)的邊界Boundary of IRa and LSC regions.

5種植物的rps19基因橫跨JLB(LSC和IRb區(qū)的邊界)邊界，rpl2基因位于接近JLB邊界的IRb區(qū)，trnN基因位于接近JSB邊界的IRb區(qū)，且在接近JSA邊界的IRa區(qū)反向重復(fù)，而ycf1基因橫跨JSA邊界，rpl2基因位于接近JLA(IRa和LSC區(qū)的邊界)邊界的IRa區(qū)，trnH基因位于接近JLA邊界的LSC區(qū)。

由IR區(qū)邊界擴(kuò)張和收縮情況看，山茶屬植物rps19、rpl2和trnH基因相對(duì)保守，基因位置和長(zhǎng)度一致，且紅山茶組與油茶組間無(wú)差異；但與木荷相比，上述3個(gè)基因位置和長(zhǎng)度在屬間差異明顯。山茶屬植物ndhF、ycf1和trnN基因則具有位置和長(zhǎng)度的特異性，組間差異明顯；與木荷相比，屬間差異則更加明顯，說(shuō)明ndhF、ycf1和trnN基因不同程度的擴(kuò)張和伸縮導(dǎo)致了不同物種間的IR和SSC區(qū)長(zhǎng)度差異。

2.5 多齒紅山茶密碼子偏好性分析

基于多齒紅山茶葉綠體基因組中得到的87個(gè)CDS基因序列研究密碼子偏好性的常用參數(shù)，經(jīng)CodonW模塊分析，有效密碼子數(shù)(ENC)為55.3，明顯大于35，表明葉綠體基因的表達(dá)量偏低，且基因中還含有較多種類的稀有密碼子。

多齒紅山茶氨基酸的相對(duì)同義密碼子使用度(RSCU)見(jiàn)表4。結(jié)果顯示：RSCU值大于1.00的密碼子共有30個(gè)(終止密碼子除外)，其中，有27個(gè)以A或U結(jié)尾，有3個(gè)以C或G結(jié)尾，說(shuō)明多齒紅山茶葉綠體基因組的密碼子偏好以A或U結(jié)尾。RSCU值大于1.60的密碼子為編碼精氨酸(Arg)的AGA，RSCU值小于0.60的密碼子包括編碼異亮氨酸(Leu)的CUG、編碼組氨酸(His)的CAC、編碼精氨酸(Arg)的CGC、編碼天冬酰胺(Asn)的AAC、編碼丙氨酸(Ala)的GCG和編碼天冬氨酸(Asp)的GAC。

表4 多齒紅山茶氨基酸的相對(duì)同義密碼子使用度(RSCU)

綜上所述，多齒紅山茶葉綠體基因組高頻率使用AGA編碼Arg，低頻率使用CUG、CAC、CGC、AAC、GCG和GAC分別編碼Leu、His、Arg、Asn、Ala和Asp。

2.6 山茶屬植物系統(tǒng)發(fā)育分析

基于22個(gè)山茶屬種類和1個(gè)木荷屬種類的葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。結(jié)果顯示：在山茶屬植物中，金花茶〔Camelliapetelotii(Merr.)Sealy〕、龍州金花茶(C.lungzhouensisLuo)和亮葉離蕊茶(C.nitidissimaChi)聚為一支，多齒紅山茶、滇山茶和南山茶聚為一支，短柱茶〔C.brevistyla(Hayata)Coh.St〕、小果油茶(C.meiocarpaHu)和茶梅(C.sasanquaThunb.)聚為一支，高州油茶(C.gauchowensisH.T.Chang)、油茶和大苞山茶(C.granthamianaSealy)聚為一支，聚在一支的種類親緣關(guān)系較近。紅山茶組、油茶組(Sect.OleiferaH.T.Chang)和短柱茶組(Sect.ParacamelliaSealy)的種類聚在了不同的分支。

進(jìn)化樹(shù)分支上的數(shù)據(jù)為自展支持率，括號(hào)內(nèi)編號(hào)為GenBank登錄號(hào)The data on the branches of evolutionary tree are bootstrap values, and the No.in brackets are the GenBank login numbers.

3 討論和結(jié)論

通常情況下，高等植物葉綠體基因組的總GC含量在34%～40%之間，而且各部分分布不均勻[7]。本研究結(jié)果顯示：多齒紅山茶葉綠體基因組的總GC含量以及大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSC)和反向重復(fù)區(qū)(IR)的GC含量與杜梨(PyrusbetulifoliaBunge)高度相似[24]，多齒紅山茶葉綠體基因組中IR區(qū)的GC含量最高(42.98%)，且明顯高于SSC區(qū)，這是因?yàn)閮H在IR區(qū)分布的4種rRNA基因具有較高的GC含量，而分布在SSC區(qū)的NADH脫氧酶基因的GC含量很低[25]。

本文中，多齒紅山茶葉綠體基因組的環(huán)狀結(jié)構(gòu)由1個(gè)LSC區(qū)、1個(gè)SSC區(qū)和2個(gè)IR區(qū)組成，與其他已報(bào)道的植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)[26]一致；多齒紅山茶有87個(gè)CDS基因、37個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因，這與山茶屬其他物種的分析結(jié)果相似，例如：‘龍井43’(Camelliasinensis‘Longjing 43’)[27]和油茶[28]等；且多齒紅山茶葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和組成與典型被子植物蘋(píng)果(MaluspumilaMill.)的葉綠體基因組[29]相同，表明植物的葉綠體基因組具有高度的保守性。而對(duì)LSC、SSC和IR區(qū)邊界結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，IR和SSC區(qū)ycf1、ndhF和trnN基因的特異性導(dǎo)致不同物種間的葉綠體基因組的序列長(zhǎng)度存在差異。通過(guò)自然選擇，例如陰暗潮濕等環(huán)境因子，會(huì)使ycf1等調(diào)節(jié)光合作用的基因面臨的選擇壓力不同，進(jìn)而使得基因的進(jìn)化速率不同[30-31]，這類進(jìn)化速率不同的基因，可以組合起來(lái)作為DNA條形碼來(lái)研究植物群落的系統(tǒng)發(fā)育研究[32]。

本研究結(jié)果顯示：在多齒紅山茶葉綠體基因組中檢測(cè)到的52個(gè)SSR位點(diǎn)中，75.0%的位點(diǎn)位于LSC區(qū)，17.3%的位點(diǎn)位于SSC區(qū)，7.7%的位點(diǎn)位于IR區(qū)，不同區(qū)域中SSR位點(diǎn)的占比與其他山茶屬植物的葉綠體基因組重復(fù)序列分析結(jié)果相似[33]，但多齒紅山茶葉綠體基因組中重復(fù)序列的類型和位點(diǎn)的檢出率與殷鑫等[34]的結(jié)果不同，其原因是檢索SSR位點(diǎn)的參數(shù)設(shè)定不同，導(dǎo)致輸出的結(jié)果不同。當(dāng)重復(fù)單元的范圍設(shè)置較寬而長(zhǎng)度下限較低時(shí)(單核苷酸到六核苷酸的最小重復(fù)值分別設(shè)置為10、4、3、3、3、3)，雖然位點(diǎn)的檢出率很高，重復(fù)類型多，但會(huì)挖掘出較多難以檢測(cè)的無(wú)效位點(diǎn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)的成功率較低；反之當(dāng)重復(fù)單元的范圍設(shè)置較窄而長(zhǎng)度下限較高時(shí)(單核苷酸到六核苷酸的最小重復(fù)值分別設(shè)置為10、6、5、5、5、5)，雖然位點(diǎn)的檢出率很低、重復(fù)類型單一，但是引物設(shè)計(jì)成功率會(huì)相對(duì)更高，挖掘結(jié)果更有效。因此，若無(wú)特殊要求，重復(fù)單元長(zhǎng)度的限定應(yīng)該根據(jù)研究需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整[35]。

本文中，多齒紅山茶的相對(duì)同義密碼子使用度(RSCU)大于1.00的密碼子共有30個(gè)，其中27個(gè)以A或U結(jié)尾，3個(gè)以C或G結(jié)尾，這一結(jié)果與大多數(shù)被子植物類似，都偏好使用A或U結(jié)尾的密碼子[36]。以同一基因或基因組為對(duì)象，當(dāng)某物種的某一密碼子RSCU值大于1.60時(shí)，為高使用頻率密碼子，其使用偏好性強(qiáng)于擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.)Heynh.〕，RSCU值小于0.60時(shí)為低使用頻率密碼子，其使用偏好性弱于擬南芥[37]，本文中多齒紅山茶高頻率使用AGA編碼Arg，低頻率使用CUG、CAC、CGC、AAC、GCG和GAC密碼子分別編碼Leu、His、Arg、Asn、Ala和Asp。

聚類分析結(jié)果顯示：小果油茶、短柱茶和茶梅聚為一支，從分子系統(tǒng)發(fā)育的角度支持閔天祿[3]將短柱茶并入油茶組的觀點(diǎn)。目前，有超過(guò)32個(gè)金花茶組(Sect.ChrysanthaChang)的分類群被發(fā)表，但是其相關(guān)分類依據(jù)僅基于葉表皮特征和若干DNA片段[38，39]。本研究中，簇蕊金花茶(CamelliafascicularisH.T.Chang)僅與小花金花茶(CamelliamicranthaS.Y.Liang et Y.C.Zhong)聚為一支，而金花茶、龍州金花茶和亮葉離蕊茶聚為另一支，從分子系統(tǒng)發(fā)育的角度支持李鳳英等[39]的基于葉表皮特征的聚類結(jié)果，簇蕊金花茶有別于金花茶組其他物種，小花金花茶與簇蕊金花茶的親緣關(guān)系較近。此外，紅山茶組物種被短柱茶組和油茶組種類交錯(cuò)間隔開(kāi)，可能是由于在晚第三紀(jì)以來(lái)，古氣候的變遷和亞洲山體的隆升等巨大的環(huán)境變化導(dǎo)致了紅山茶組和油茶組在新的環(huán)境中產(chǎn)生了進(jìn)一步的分化和雜交[40]。

綜上所述,多齒紅山茶葉綠體基因組長(zhǎng)度為156 778 bp，總CG含量為37.33%，由1個(gè)LSC區(qū)、1個(gè)SSC區(qū)以及2個(gè)IR區(qū)組成，對(duì)應(yīng)GC含量分別為35.34%、30.60%和42.98%；共注釋到132個(gè)基因，包括87個(gè)CDS基因(偏好使用以A或U結(jié)尾的密碼子編碼蛋白，高頻率使用AGA編碼Arg)、37個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因，其中，ycf1、ndhF和trnN基因的特異性是導(dǎo)致IR區(qū)邊界產(chǎn)生差異的原因。檢測(cè)到的52個(gè)SSR位點(diǎn)可作為分子標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)一步用于系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果支持將短柱茶并入油茶組的觀點(diǎn)。