雷昌，凌成利，黃丹，鄒蔓姝，趙洪慶，張秀麗，劉建軍，蘇捷，王宇紅，向韻

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

抑郁癥是危害人類身心健康的常見(jiàn)情感障礙疾病，嚴(yán)重者有自殺傾向，已成為全球疾病負(fù)擔(dān)的主要原因。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，西醫(yī)治療存在效果欠佳、復(fù)發(fā)率較高、不良反應(yīng)大等問(wèn)題。中醫(yī)治療抑郁癥能緩解癥狀，且具有標(biāo)本兼治、不良反應(yīng)少、不易復(fù)發(fā)等優(yōu)勢(shì)，逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視。

人參味甘、微苦，有補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、益心智功效；貫葉金絲桃味辛、性寒，入肝經(jīng)，具有疏肝解郁、清熱利濕功效。兩藥是常用的抗抑郁中藥，但目前尚未見(jiàn)有關(guān)兩藥配伍抗抑郁作用的研究?；诖?，本研究以抑郁癥模型大鼠為研究對(duì)象，采用基線等比增減設(shè)計(jì)法觀察人參、貫葉金絲桃不同配比對(duì)模型大鼠行為學(xué)，血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），下丘腦-垂體-腎上腺軸指標(biāo)促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)酮（CORT）含量的影響，優(yōu)選兩者發(fā)揮抗抑郁作用的最佳配比，并測(cè)定最佳配比組大鼠海馬組織糖皮質(zhì)激素受體（GR）、血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1（SGK1）蛋白表達(dá)，探討人參、貫葉金絲桃配伍抗抑郁的可能機(jī)制，為兩藥配伍抗抑郁的實(shí)驗(yàn)研究及藥物開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，相對(duì)濕度（50±5）%，溫度（25±2）℃，光暗交替周期12 h。

1.2 藥物

人參、貫葉金絲桃飲片，購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心黃丹老師鑒定，人參為五加科植物人參C.AMey的干燥根和根莖，貫葉金絲桃為藤黃科植物貫葉金絲桃L.的干燥地上部分。鹽酸氟西汀膠囊，禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)0722A，20 mg/粒，將1粒膠囊內(nèi)容物溶于37 mL蒸餾水中，4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

IL-6、TNF-α、ACTH、CORT ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號(hào)分別為210317R05、210317R11、210423R09、210422R07），GR、SGK1抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為24050-1-AP、28454-1-AP），protein marker（美 國(guó)Thermo，貨號(hào)26616），Tris（德國(guó)BioFroxx，貨號(hào)115KG001-1KG），BCA蛋白定量試劑盒（安徽biosharp，貨號(hào)69107317），RAPI裂解液（北京索萊寶，批號(hào)01408/35020），HRP-山羊抗兔IgG（美國(guó)Proteintech，貨號(hào)20000373）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph），open field敞箱（成都泰盟公司），Morris水迷宮（北京智鼠多寶生物科技公司），AL204電子分析天平（德國(guó)梅特勒托利多），5804R離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電），蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（北京六一），Qption-Q超純水儀（英國(guó)ELGALabWaters）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物及制備

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》人參用量3～9 g、貫葉金絲桃用量2～3 g，取成人臨床常用量，人參9 g、貫葉金絲桃3 g，二者配伍用量12 g，換算成大鼠等效劑量為1.3 g/kg（人參0.975 g/kg、貫葉金絲桃0.325 g/kg）。

按不同配比稱取藥物飲片，用60%乙醇回流提取2次，第1次加8倍量提取2 h，第2次加6倍量提取1 h，合并2次提取液，過(guò)濾（300目篩），回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.25稠膏。藥渣加水煎煮2次，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并2次濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.25稠膏，與上述稠膏合并，混勻，60～65℃真空干燥，使用時(shí)配制成人參、貫葉金絲桃不同配比的總濃度為0.13 g/mL溶液。

2.2 分組與給藥

采用基線等比增減設(shè)計(jì)法，根據(jù)前期基礎(chǔ)，以人參-貫葉金絲桃5∶1作為配比基線，人參和貫葉金絲桃用量以16.6%向兩側(cè)遞增或遞減，分別設(shè)置人參-貫葉金絲桃5∶1組（人參1.08 g/kg+貫葉金絲桃0.22 g/kg）、人參-貫葉金絲桃2∶1組（人參0.87 g/kg+貫葉金絲桃0.43 g/kg）、人參-貫葉金絲桃1∶1組（人參0.65 g/kg+貫葉金絲桃0.65 g/kg）、人參-貫葉金絲桃1∶2組（人參0.43 g/kg+貫葉金絲桃0.87 g/kg）、人參-貫葉金絲桃1∶5組（人參0.22 g/kg+貫葉金絲桃1.08 g/kg），另設(shè)人參組（0.975 g/kg）、貫葉金絲桃組（0.325 g/kg）、陽(yáng)性藥組（5.4 mg/kg）、模型組和空白組，每組8只。造模同時(shí)灌胃給藥，各中藥組按相應(yīng)配比稱取飲片，按“2.1”項(xiàng)下方法制備后灌胃，陽(yáng)性藥組灌胃鹽酸氟西汀溶液，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水。灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)28 d。

2.3 造模

采用慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激法建立抑郁癥大鼠模型，應(yīng)激方式包括4℃冷水浴3 min、熱水?。?0～42℃）3 min、噪音8 h、夾尾1 min、45°傾籠24 h、晝夜顛倒24 h，每日隨機(jī)采用1種刺激，且同一種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，造模期間動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，不予任何刺激，連續(xù)28 d。

2.4 行為學(xué)檢測(cè)

2.4.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

末次給藥1 h后，采用底部和四壁均為黑色的敞箱（80 cm×80 cm×40 cm），底部用白線劃分成5×5個(gè)方格，觀察并記錄大鼠在3 min內(nèi)水平穿越底面方格次數(shù)及垂直活動(dòng)次數(shù)（雙足離開(kāi)地面至雙足放下計(jì)為1次）。

2.4.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)

從第23日開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，將水迷宮分為A、B、C、D共4個(gè)象限，在A象限放置一平臺(tái)，加水沒(méi)過(guò)平臺(tái)2 cm，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠自由爬上平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，若90 s內(nèi)仍未爬上平臺(tái)，引導(dǎo)其至平臺(tái)上并停留15 s，此時(shí)逃避潛伏期為90 s，連續(xù)測(cè)量5 d。第28日移走平臺(tái)，將大鼠放入水中，觀察其30 s內(nèi)活動(dòng)情況，記錄其在A象限停留的時(shí)間，即目標(biāo)象限停留時(shí)間。

2.5 ELISA檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛腹腔注射（4 mL/kg）麻醉，仰臥于手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈采血，靜置2 h，4℃、3000 r/min離心15 min，將血清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管備用。ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α、CORT、ACTH含量，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.6 Western blot檢測(cè)

脫頸處死大鼠，斷頭取腦，冰盒上迅速剝離海馬并稱重，按每1 mg海馬組織加入4 μL裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），于冰上勻漿，4℃、12000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法檢測(cè)蛋白含量，上清液加入1/4體積loading buffer混勻，95℃加熱5～10 min使蛋白變性。取各組蛋白樣品上樣，凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以脫脂牛奶室溫封閉2 h，滴加GR一抗（1∶2000）、SGK1一抗（1∶1000）、β-actin一抗（1∶20000），4℃孵育過(guò)夜，PBST清洗3次，加入相應(yīng)二抗（1∶15000），室溫孵育2 h，PBST清洗3次。采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光，AlphaEaseFC軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 人參-貫葉金絲桃不同配比對(duì)模型大鼠行為學(xué)的影響

與空白組比較，模型組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平穿格次數(shù)和垂直活動(dòng)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平穿格次數(shù)和垂直活動(dòng)次數(shù)均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01），其中人參-貫葉金絲桃1∶1組作用最明顯，與其他配比組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平穿格次數(shù)、垂直活動(dòng)次數(shù)比較（±s）

與空白組比較，模型組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（＜0.01），目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期明顯縮短（＜0.05，＜0.01），除人參-貫葉金絲桃1∶5組外，其余各組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（＜0.05，＜0.01），其中人參-貫葉金絲桃1∶1組作用最明顯，與其他配比組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間比較（±s，s）

4.2 人參-貫葉金絲桃不同配比對(duì)模型大鼠血清白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)酮含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α、ACTH、CORT含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，人參組、貫葉金絲桃組、人參-貫葉金絲桃2∶1、1∶1組大鼠血清TNF-α、IL-6含量明顯減少（＜0.05，＜0.01），人參-貫葉金絲桃2∶1、1∶1、1∶2組大鼠血清CORT、ACTH含量明顯減少（＜0.05，＜0.01），其中人參-貫葉金絲桃1∶1組作用最明顯，與其他配比組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、ACTH、CORT含量比較（±s，ng/mL）

4.3 人參-貫葉金絲桃最優(yōu)配比對(duì)模型大鼠海馬組織糖皮質(zhì)激素受體、血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1蛋白表達(dá)的影響

為明確人參-貫葉金絲桃最佳配比抗抑郁的作用機(jī)制，采用Western blot檢測(cè)空白組、模型組、人參組、貫葉金絲桃組、人參-貫葉金絲桃1∶1組（最佳配比組）大鼠海馬組織GR、SGK1蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠海馬組織GR蛋白表達(dá)明顯降低，SGK1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，貫葉金絲桃組、最佳配比組大鼠海馬組織GR蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01），人參組、貫葉金絲桃組、最佳配比組大鼠海馬組織SGK1蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表4、圖1。

表4 各組大鼠海馬組織GR、SGK1蛋白表達(dá)比較（±s）

圖1 各組大鼠海馬組織GR、SGK1蛋白免疫印跡

5 討論

抑郁癥屬中醫(yī)學(xué)“郁證”范疇，病始在肝，累及心神，與腦相關(guān)，氣血失調(diào)是其關(guān)鍵病機(jī)。肝主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，與氣血運(yùn)行關(guān)系密切。肝主情志，若情志不遂，氣機(jī)失調(diào)，氣血運(yùn)行受阻，氣滯血瘀，瘀血內(nèi)阻，神明不能內(nèi)守，則見(jiàn)心悸、失眠、健忘、性情急躁。因此，治宜疏肝解郁、活絡(luò)安神。本課題組針對(duì)郁證病機(jī)研發(fā)抗抑郁中藥復(fù)方百事樂(lè)膠囊，前期研究顯示，其可提高皮質(zhì)酮暴露下海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞可塑性，緩解模型大鼠抑郁樣行為，通過(guò)調(diào)控海馬PI3K信號(hào)通路關(guān)鍵因子發(fā)揮抗抑郁功效，且對(duì)肝郁氣滯型抑郁癥患者療效確切。該方由人參、貫葉金絲桃、姜黃組成，具有理氣活血、寧心安神功效。方中人參大補(bǔ)元?dú)狻采褚嬷?；貫葉金絲桃疏肝解郁，取散諸結(jié)之意；姜黃活血化瘀、行氣止痛，善破肝脾二經(jīng)之血瘀氣結(jié)，主血瘀氣滯諸證。前期拆方研究發(fā)現(xiàn)，人參與貫葉金絲桃配伍有良好的抗抑郁作用。人參作為常用補(bǔ)氣中藥，其抗抑郁作用成為近年研究熱點(diǎn)。貫葉金絲桃是常用抗抑郁中藥，其提取物對(duì)輕、中度抑郁癥療效好，且不良反應(yīng)小。因此，研究人參、貫葉金絲桃最佳配比能提高治療抑郁癥效果，最大程度發(fā)揮中藥功效。

基線等比增減設(shè)計(jì)法適用于效應(yīng)明確的中藥小復(fù)方（或藥對(duì)）配比優(yōu)化，該方法不僅能較好地分析藥物在不同劑量配比下效應(yīng)的區(qū)別，還能極大地減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)與成本。本研究以人參、貫葉金絲桃在百事樂(lè)膠囊中的配比5∶1為基線，兩藥用量以16.6%向兩側(cè)遞增或遞減確定不同配比，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，人參-貫葉金絲桃在一定范圍內(nèi)配比能夠明顯提高模型大鼠活動(dòng)次數(shù)和學(xué)習(xí)記憶能力，改善抑郁樣行為，降低血清IL-6、TNF-α、ACTH、CORT含量，其中以人參-貫葉金絲桃1∶1配比效果最佳，優(yōu)于其他配比組及人參、貫葉金絲桃單味藥組。課題組研究發(fā)現(xiàn)，百事樂(lè)膠囊主要化學(xué)成分為黃酮類、皂苷類、有機(jī)酸類、萜類和姜黃素類。而有研究表明，抗抑郁藥物活性成分主要集中在黃酮類、皂苷類、酚酸和揮發(fā)油類。提示人參與貫葉金絲桃主要有效成分，如皂苷類、黃酮類和酚酸類成分產(chǎn)生了協(xié)同作用，且配伍可能增強(qiáng)二者抗抑郁作用。

抑郁癥機(jī)制尚未闡明，其研究假說(shuō)主要有單胺遞質(zhì)假說(shuō)、第二信使失衡假說(shuō)、受體假說(shuō)等，上述假說(shuō)均與海馬神經(jīng)元再生障礙密切相關(guān)。SGK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與海馬神經(jīng)元再生密切相關(guān)。SGK1作為GR的下游靶基因，可通過(guò)糖皮質(zhì)激素信號(hào)調(diào)節(jié)GR活性，亦可反饋調(diào)控p-GR水平及核轉(zhuǎn)移。采用海馬神經(jīng)前體細(xì)胞聯(lián)合GR、SGK1抑制劑發(fā)現(xiàn)，SGK1是CORT降低海馬神經(jīng)元再生的下游位點(diǎn)，并維持其上游GR的功能。有研究表明，SGK1不僅參與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的人海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖和分化減少，并且在模型大鼠海馬組織中表達(dá)升高，而SGK1表達(dá)升高與重度抑郁癥致病性應(yīng)激假說(shuō)有關(guān)。本研究根據(jù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和ELISA檢測(cè)結(jié)果，對(duì)最佳配比組及人參、貫葉金絲桃單味藥組大鼠海馬組織GR、SGK1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，人參-貫葉金絲桃1∶1配比可降低大鼠海馬組織SGK1蛋白表達(dá)，升高GR蛋白表達(dá)，推測(cè)兩藥配伍可能通過(guò)降低SGK1表達(dá)，調(diào)節(jié)GR功能，維持下丘腦-垂體-腎上腺軸平衡，從而發(fā)揮抗抑郁功效。然而抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，課題組后續(xù)將進(jìn)一步驗(yàn)證人參-貫葉金絲桃的最佳配比，同時(shí)對(duì)兩藥配伍抗抑郁的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。