李琨，王炳予，張雅麗，劉長(zhǎng)發(fā)，袁星星，3

1.北京開(kāi)放大學(xué)，北京 100081；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150006

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）又稱代謝相關(guān)脂肪性肝病，是指除酒精和其他明確的損肝因素外所導(dǎo)致的脂肪組織在肝內(nèi)堆積過(guò)多，出現(xiàn)全身代謝障礙的病理綜合征。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）屬于NAFLD疾病譜范疇，是由單純性肝臟脂肪變發(fā)展而來(lái)，以肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死和纖維化。目前NAFLD全球發(fā)病率約25%，人數(shù)已超過(guò)17億，且發(fā)病率逐年升高，已成為我國(guó)第一大慢性肝臟疾病。2019年調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)NAFLD發(fā)病率約29.2%，不僅嚴(yán)重危害患者生命健康，也給社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。

NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚缺乏有效的治療藥物。中醫(yī)以辨證論治為基礎(chǔ)，對(duì)NAFLD的整體調(diào)治具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。NAFLD屬中醫(yī)學(xué)“脅痛”“肝癖”等范疇，多由飲食失節(jié)、勞逸失常及情志失暢引起，以致脾失健運(yùn)，脾氣虛無(wú)力運(yùn)化水谷精微，生化乏源，水谷精微不能正常輸布，致內(nèi)生痰濕，久之成瘀，痰瘀互結(jié)于肝之脈絡(luò)發(fā)為本病。芪參湯為臨床治療NAFLD的經(jīng)驗(yàn)方，由《博愛(ài)心鑒》保元湯化裁而來(lái)，具有益氣健脾、祛瘀化痰功效。本課題組前期研究表明，芪參湯可通過(guò)調(diào)控腸道菌群多樣性與穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮改善NASH患者肝功能、血脂異常和纖維化的作用。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芪參湯可通過(guò)抑制胰島素通路活化改善NAFLD胰島素抵抗，進(jìn)而改善肝臟脂肪沉積和肝損傷。本研究以FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號(hào)通路為切入點(diǎn)，進(jìn)一步明確芪參湯抑制肝臟炎癥的作用機(jī)制，為NAFLD治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源與處理

采用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）編號(hào)為GSE126848的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含57個(gè)肝組織樣本，其中14個(gè)健康正常體質(zhì)量樣本、12個(gè)肥胖樣本、15個(gè)非酒精性肝臟脂肪變樣本、16個(gè)NASH樣本。通過(guò)R軟件Limma包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)缺、校正及歸一化。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)貝葉斯檢驗(yàn)以＜0.05和|LogFC|≤1為條件對(duì)差異基因進(jìn)行篩選。

1.2 動(dòng)物及細(xì)胞

6周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠100只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（黑）2016-008。飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度21.5～25.5℃，濕度45.0%～55.0%，12 h光暗循環(huán)，自由攝食飲水。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.3 主要試劑與儀器

脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）抑制劑BMS-309403，美國(guó)MCE公司，貨號(hào)HY-101903；HE染液、油紅O染液、SYBR Green OneStep qRT-PCR試劑盒，上海碧云天生物，貨號(hào)分別為C0105S、C0157M、D7268S；小鼠白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、CXC趨化因子受體3（CXCR3）、趨化因子C-C-基元配體4（CCL4）試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)分別為MM-0132M2、MM-0040M2、MM-0153M2、MM-0016M2；細(xì)胞核蛋白與漿蛋白抽提試劑盒，福州飛凈生物，貨號(hào)PH0710；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本TaKaRa公司，貨號(hào)RR036A；FABP4抗體、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ抗體、κB抑制因子激酶（IKK）α抗體、核因子（NF）-κB抑制因子（IκB）α抗體、p-IκBα（Ser32）抗體、NF-κB p65抗體、Histone H3抗體、β-actin抗體，美國(guó)CST公司，貨號(hào)分別為2120、2430、2682、4812、2859、8242、4499、3700；p-IKKα（Ser176）抗 體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為ab138426、ab6721；Ly6C抗體、F4/80抗體，美國(guó)eBioscience公 司，貨 號(hào) 分 別 為14-5931-82、MF48005。CX33光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；Cobas8000全自動(dòng)生化分析儀，德國(guó)Roche公司；電泳儀、電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司；iBright CL1500凝膠成像系統(tǒng)、Attune Nx T流式細(xì)胞儀、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.4 藥物及含藥血清制備

芪參湯由黃芪、西洋參、丹參、山楂、荷葉、澤瀉、女貞子、三七、墨旱蓮、絞股藍(lán)、甘草按15∶10∶10∶10∶10∶10∶8∶5∶8∶5∶3比例組成，由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室經(jīng)浸泡、煎煮、過(guò)濾、濃縮后，制成原藥材濃度為1 g/mL濃縮液備用。鹽酸二甲雙胍片，上海上藥信誼藥廠有限公司，0.25 g/片，使用前配制成0.013 g/mL混懸液。

取20只小鼠隨機(jī)分為空白組和芪參湯組，每組10只。芪參湯組參照前期研究得出的最佳劑量予芪參湯濃縮液18.8 g/kg灌胃，給藥體積0.376 mL/只?？瞻捉M予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。末次灌胃后，1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉小鼠，腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min離心10 min，取血清，56℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過(guò)濾后分裝凍存。

1.5 分組、造模及干預(yù)

將剩余80只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、芪參湯組和二甲雙胍組，每組20只。除空白組外，其余3組參照文獻(xiàn)[12]采用高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD小鼠模型。造模同時(shí)進(jìn)行干預(yù)，芪參湯組予芪參湯濃縮液18.8 g/kg灌胃，二甲雙胍組予二甲雙胍混懸液0.25 g/kg灌胃，空白組和模型組予生理鹽水灌胃，給藥體積均為0.376 mL/只，每日1次，連續(xù)16周。分別于第12、16周末隨機(jī)取10只小鼠以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血后，分離肝臟，用于后續(xù)檢測(cè)。以第12周肝組織油紅O染色出現(xiàn)脂滴形成為單純性脂肪變、第16周HE染色可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化為NASH判定標(biāo)準(zhǔn)。

RAW264.7細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗），置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×10個(gè)/孔接種于96孔板，置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄上清液，將細(xì)胞分為空白組、模型組、芪參湯組和抑制劑組，每組3個(gè)復(fù)孔。除空白組外，其余3組加入500 μmol/L棕櫚酸誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型，芪參湯組同時(shí)加入100 μL 10%芪參湯含藥血清，抑制劑組加入20 μmol/L BMS-309403，空白組和模型組加入100 μL 10%空白血清，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞和上清液進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 肝組織病理觀察

分別于第12、16周取小鼠部分肝臟，中性甲醛固定6 h，石蠟包埋，切片后行HE染色。另取部分肝臟以O(shè)CT包埋，冰凍切片，中性甲醛固定30 min，行油紅O染色。光學(xué)顯微鏡下觀察，參照文獻(xiàn)[14]方法計(jì)算NAFLD活動(dòng)積分（NAS）。①肝脂肪變?cè)u(píng)分。肝脂肪變程度＜5%，0分；5%≤肝脂肪變程度≤33%，1分；34%≤肝脂肪變程度≤66%，2分；肝脂肪變程度＞66%，3分。②肝小葉內(nèi)炎癥評(píng)分。肝小葉內(nèi)炎癥（200倍視野）＜2個(gè)，0分；2≤肝小葉內(nèi)炎癥≤4個(gè)，1分；肝小葉內(nèi)炎癥＞4個(gè)，2分。③肝細(xì)胞氣球樣變性評(píng)分。無(wú)肝細(xì)胞氣球樣變性，0分；少量肝細(xì)胞氣球樣變性，1分；較多肝細(xì)胞氣球樣變性，2分。NAS=肝脂肪變?cè)u(píng)分+肝小葉內(nèi)炎癥評(píng)分+肝細(xì)胞氣球樣變性評(píng)分。同時(shí)，采用Image J 1.8.0軟件計(jì)算油紅O染色面積。

1.6.2 肝功能檢測(cè)

第12、16周腹主動(dòng)脈取血，3000 r/min離心10 min，收集血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平。

1.6.3 ELISA檢測(cè)

第12、16周腹主動(dòng)脈取血，室溫、3500 r/min離心10 min，收集血清。另收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，酶標(biāo)儀測(cè)定血清及上清液炎癥因子IL-1β、TNF-α及趨化因子CXCR3、CCL4含量，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.6.4 Western blot檢測(cè)

分別取肝組織和RAW264.7細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上勻漿，3000 r/min離心5 min，取上清液，雙金雞納酸法測(cè)定蛋白濃度。取15 μg蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶封閉1 h，肝組織蛋白樣品滴加FABP4一抗（1∶1000），細(xì)胞蛋白樣品滴加FABP4一抗（1∶1000）、PPAR-γ一抗（1∶1000）、p-IKKα一抗（1∶500）、p-IκBα一抗（1∶1000）、IKKα一抗（1∶1000）、IκBα一抗（1∶1000）、β-actin一抗（1∶1000），4℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶2000），室溫孵育1 h，滴加超敏ECL顯影液，室溫靜置2 min，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

另外，通過(guò)試劑盒分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白，分別加入NF-κBp65一抗（1∶1000）、HistoneH3一抗（1∶2000）、β-actin一抗（1∶1000），并按上述步驟處理，以Histone H3為細(xì)胞核蛋白內(nèi)參，β-actin為細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參，計(jì)算NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6.5 qRT-PCR檢測(cè)

分別取肝組織和RAW264.7細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Green OneStep qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性8 min，95℃變性15 s，60℃退火65 s，共40個(gè)循環(huán)；終末60℃補(bǔ)延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2法計(jì)算mRNA表 達(dá) 量。引 物 序 列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

收集各組細(xì)胞，3000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀加入Ly6C-PE和F4/80-APC一抗，避光孵育30 min。PBS洗滌，3000 r/min離心5 min，棄上清液，多聚甲醛重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。先選取F4/80陽(yáng)性細(xì)胞群，再根據(jù)Ly6C熒光強(qiáng)度分為L(zhǎng)y6C和Ly6C巨噬細(xì)胞亞群。通過(guò)FlowJo 10.4軟件計(jì)算各亞群比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果

將GSE126848數(shù)據(jù)集中14個(gè)健康正常體質(zhì)量樣本和12個(gè)肥胖樣本定義為Health，15個(gè)單純脂肪病變和16個(gè)NASH樣本定義為NAFLD。共篩選出1246個(gè)差異基因，其中493個(gè)上調(diào)、753個(gè)下調(diào)（見(jiàn)圖1）。差異表達(dá)基因中，F(xiàn)ABP4水平在NAFLD演變過(guò)程中逐漸升高，因此本研究主要對(duì)FABP4表達(dá)及功能展開(kāi)研究。

圖1 GSE126848數(shù)據(jù)集NAFLD差異表達(dá)基因熱圖

2.2 芪參湯對(duì)模型小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

HE染色和油紅O染色顯示，第12周空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞排列整齊；模型組小鼠肝細(xì)胞明顯腫脹，呈氣球樣變，有大量脂滴形成；芪參湯組和二甲雙胍組小鼠肝細(xì)胞腫脹、氣球樣變及脂質(zhì)堆積有所改善。第16周模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)大量氣球樣變，炎癥細(xì)胞局部浸潤(rùn)，肝細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂滴；芪參湯組和二甲雙胍組小鼠肝臟脂肪變程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脂滴較模型組明顯減少。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組小鼠肝組織形態(tài)（HE染色，×400）

圖3 各組小鼠肝組織形態(tài)（油紅O染色，×400）

與空白組比較，模型組小鼠第12、16周NAS和油紅O染色面積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和二甲雙胍組小鼠第12、16周NAS和油紅O染色面積顯著減少（＜0.01，＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)NAS和油紅O染色面積比較（±s）

2.3 芪參湯對(duì)模型小鼠肝功能及血清細(xì)胞因子的影響

與空白組比較，模型組小鼠第12、16周血清AST、ALT、IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和二甲雙胍組小鼠 第12、16周 血 清AST、ALT、IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量顯著減少（＜0.05，＜0.01）。見(jiàn)表3、表4。

表3 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肝功能指標(biāo)比較（±s，U/L）

表4 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)血清細(xì)胞因子含量比較（±s，pg/mL）

2.4 芪參湯對(duì)模型小鼠肝組織脂肪酸結(jié)合蛋白4表達(dá)的影響

Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠第12、16周肝組織FABP4蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和二甲雙胍組小鼠第12、16周肝組織FABP4蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.01）。見(jiàn)表5、圖4。

表5 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肝組織FABP4表達(dá)比較（±s）

圖4 各組小鼠肝組織FABP4蛋白免疫印跡

2.5 芪參湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液細(xì)胞因子含量的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞上清液IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和抑制劑組細(xì)胞上清液IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見(jiàn)表6。

表6 各組RAW264.7細(xì)胞上清液細(xì)胞因子含量比較（±s，pg/mL）

2.6 芪參湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα及細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高，PPAR-γ、IκBα及細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和抑制劑組細(xì)胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα及細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低，PPAR-γ、IκBα及細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）。各組IKKα蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見(jiàn)圖5、表7。

表7 各組RAW264.7細(xì)胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

圖5 各組RAW264.7細(xì)胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB通路相關(guān)蛋白免疫印跡

2.7 芪參湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞Ly6Clow和Ly6Chigh亞群比例的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞Ly6C亞群比例顯著減少，Ly6C亞群比例顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和抑制劑組RAW264.7細(xì)胞Ly6C亞群比例顯著增加，Ly6C亞群比例顯著減少（＜0.01）。見(jiàn)圖6、表8。

表8 各組RAW264.7細(xì)胞Ly6Clow和Ly6Chigh亞群比例比較（±s，%）

圖6 各組RAW264.7細(xì)胞F4/80-Ly6C檢測(cè)流式圖

3 討論

NAFLD發(fā)病機(jī)制與“二次打擊”密切相關(guān)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生，進(jìn)一步引起炎癥壞死及肝纖維化。隨著對(duì)NAFLD研究的深入，“多重平行打擊”學(xué)說(shuō)認(rèn)為，炎癥反應(yīng)早于單純脂肪變性并且可導(dǎo)致隨后的肝脂肪病變。在炎癥應(yīng)激作用下，脂質(zhì)代謝相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白功能發(fā)生障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而引起脂質(zhì)過(guò)度蓄積。本研究通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)制備NAFLD小鼠模型，12周即可造成單純性脂肪變，16周可出現(xiàn)典型的NASH病理特征，是目前公認(rèn)的NAFLD動(dòng)物模型。結(jié)果顯示，模型小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-1β含量增加，并通過(guò)體循環(huán)進(jìn)入肝臟，進(jìn)一步加重肝臟炎癥損傷與糖脂代謝紊亂。芪參湯干預(yù)可顯著減少模型小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-1β含量，改善肝臟炎癥和脂質(zhì)代謝紊亂。

巨噬細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞，可分為常駐枯否細(xì)胞和從外周募集的單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞。肝臟募集的單核源性巨噬細(xì)胞通過(guò)循環(huán)轉(zhuǎn)移并浸潤(rùn)至肝臟組織，通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟免疫微環(huán)境參與代謝性炎癥，促進(jìn)NAFLD進(jìn)展。CXCR3作為CXC趨化因子家族的一員，通過(guò)CCL4激活并招募單核巨噬細(xì)胞到達(dá)炎癥位點(diǎn)，分泌炎癥因子，進(jìn)一步加重NASH。單核巨噬細(xì)胞根據(jù)Ly6C水平可分為L(zhǎng)y6C和Ly6C2個(gè)亞群，其中Ly6C亞群由Ly6C亞群轉(zhuǎn)化而來(lái)，具有抗炎和促進(jìn)修復(fù)作用，Ly6C亞群在損傷應(yīng)答及趨化信號(hào)中富集，表現(xiàn)為促炎作用。Ly6C和Ly6C亞群比例可作為評(píng)估肝臟單核源性巨噬細(xì)胞功能的重要指標(biāo)。本研究中，模型組小鼠血清CXCR3、CCL4含量顯著增加，芪參湯能顯著抑制CXCR3和CCL4分泌，從而抑制單核源性巨噬細(xì)胞向肝臟募集。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)棕櫚酸誘導(dǎo)構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥模型，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，模型組細(xì)胞Ly6C亞群比例減少，Ly6C亞群比例增加，芪參湯干預(yù)能顯著促進(jìn)Ly6C亞群向Ly6C亞群轉(zhuǎn)化及炎癥因子和趨化因子分泌，發(fā)揮抗炎作用。

FABP4主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，表達(dá)于脂肪細(xì)胞的FABP4具有調(diào)控胰島素抵抗及糖脂代謝作用，表達(dá)于巨噬細(xì)胞的FABP4通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥因子分泌發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用。PPARs屬于核激素受體，包括PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ 3種異構(gòu)體，在胰島素抵抗、糖脂代謝、炎癥反應(yīng)及肝纖維化中均發(fā)揮重要作用。研究表明，F(xiàn)ABP4可直接與PPAR-γ結(jié)合并促進(jìn)PPAR-γ降解，F(xiàn)ABP4敲除的巨噬細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)顯著升高。炎癥發(fā)生時(shí)，IKKα被可游離脂肪酸磷酸化，激活的IKKα進(jìn)一步磷酸化IκBα/β，使IκBα/β泛素化并被降解，致NF-κB p65和IκBα/β二聚體解離，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，調(diào)控TNF-α、IL-1β等炎癥因子產(chǎn)生，加重NAFLD發(fā)展。PPAR-γ通過(guò)抑制激活蛋白-1、NF-κB及JAK/STAT等途徑發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)作用。本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)分析NAFLD差異表達(dá)基因，篩選出FABP4進(jìn)行后續(xù)研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NAFLD模型小鼠肝組織FABP4表達(dá)顯著上調(diào)，芪參湯能顯著抑制模型小鼠肝組織FABP4表達(dá)。因此我們推測(cè)，芪芪參湯治療NAFLD可能與抑制FABP4表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，模型組RAW264.7細(xì)胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα和細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高，PPAR-γ、IκBα和細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低。芪參湯干預(yù)能顯著抑制細(xì)胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα和細(xì)胞核p65蛋白表達(dá)，上調(diào)PPAR-γ、IκBα和細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白表達(dá)，表現(xiàn)出與BMS-309403相同趨勢(shì)。以上結(jié)果提示，芪參湯抑制炎癥的機(jī)制是通過(guò)抑制FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號(hào)通路活化實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，芪參湯主要通過(guò)抑制FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號(hào)通路活化，進(jìn)而促進(jìn)Ly6C巨噬細(xì)胞亞群向Ly6C巨噬細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化，發(fā)揮治療NAFLD炎癥的作用。