蒲茜，余蕾

盆腔炎性后遺癥(sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID)是臨床上婦科常見的一組疾病，是由于盆腔炎患者未及時(shí)接受規(guī)范治療或接受治療后仍遷延不愈、反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致[1]，表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、盆腔周圍結(jié)締組織炎等。據(jù)估計(jì)，15～50歲的女性中有4%～20%患有SPID[2]。

SPID病程綿長(zhǎng)、遷延不愈，且增加了女性不孕、慢性盆腔痛、異位妊娠等多種并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)女性的身心健康造成巨大影響[3]。SPID的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜,至今尚未明確，其可能的機(jī)制包括：病原體侵襲、氧自由基清除異常、血液動(dòng)力異常、免疫系統(tǒng)紊亂等[4-5]。其中免疫系統(tǒng)紊亂學(xué)說(shuō)是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，資料表明女性生殖系統(tǒng)中分布著大量Toll樣受體(TLRs)，當(dāng)其被激活后(主要包括TLR2、TLR4)可通過(guò)不同的途徑引起一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)大量細(xì)胞因子和趨化因子的分泌從而誘發(fā)炎癥[6]。國(guó)際性傳播感染聯(lián)合會(huì)(IUSTI)和疾病預(yù)防控制中心(CDC)將抗生素作為SPID推薦用藥[7]，但是引起SPID的病原體是多種多樣的，有時(shí)還會(huì)存在無(wú)細(xì)菌感染的SPID患者，因此抗生素治療的有效性仍存在不確定性。此外，有越來(lái)越多的證據(jù)表明，抗生素還會(huì)產(chǎn)生胃腸道疾病、肝臟毒性、皮膚過(guò)敏等不良作用，因此本研究將從免疫調(diào)控出發(fā)，探索新的治療方案。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)是一種具有免疫調(diào)控作用的細(xì)胞，研究表明UCMSCs可通過(guò)調(diào)低TLR2、TLR4的表達(dá)降低炎癥因子釋放(包括IL-4、IL-6、IL-8等),從而改善炎癥情況。因此UCMSCs對(duì)SPID可能存在治療作用,同時(shí)UCMSCs具有取材方便、清潔度高、易于在體外培養(yǎng)、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低且不受倫理道德限制等優(yōu)點(diǎn)[8-9]?；诖耍狙芯繉腡LR/MyD88/NF-κB通路出發(fā)探討UCMSCs對(duì)于SPID大鼠的保護(hù)作用及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物

UCMSCs，購(gòu)于美國(guó)Scien Cell Research Laboratories。SD大鼠35只，雌性，未受孕8周齡，體重約(250±20)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001]。飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件:室溫(23±2)℃，12 h光照/12 h黑暗交替，自由攝水、食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑

婦科千金片(株洲千金藥業(yè)有限公司)；白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)大鼠酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(伊萊瑞特)；TNF-α、NF-κB抗體購(gòu)于博奧森生物技術(shù)公司；TRL2，TRL4，MyD88抗體購(gòu)于美國(guó)Affinity Biosciences公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及SPID模型的建立 參照Z(yǔ)hang LJ等[10]的方法造模，雌性未受孕SD大鼠35只，隨機(jī)選取8只作為空白對(duì)照組(Control組)，剩下27只進(jìn)行SPID造模。用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，于下腹做1 cm左右切口，游離周圍組織暴露雙側(cè)子宮，沿子宮根部分別向兩側(cè)宮腔注射金黃色葡萄球菌與大腸桿菌制備的細(xì)菌混懸液0.1 mL(約1×109CFU/mL)。造模后適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d隨機(jī)抽取3只造模大鼠檢驗(yàn)是否造模成功，確認(rèn)成功后，將剩余24只造模大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(SPID組)、婦科千金片治療組(Drugs組)、UCMSCs治療組(Cells組),每組8只。

1.3.2 藥物及細(xì)胞干預(yù) Drugs組按0.25 g/kg進(jìn)行灌胃婦科千金片(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物和人之間的等效劑量公式換算)，每天1次，連續(xù)干預(yù)21 d。Cells組于造模后14 d的第1天、第7天、第14天進(jìn)行尾靜脈注射2 mL UCMSCs懸液(3×106/mL)。

1.4 標(biāo)本采集與處理

末次尾靜脈注射后，正常喂養(yǎng)7 d，待Drugs組末次灌胃后，所有組別同時(shí)禁食不禁水，次日麻醉開腹，腹主動(dòng)脈采血，靜置1～2 h。取血后充分暴露子宮，記錄腹內(nèi)情況后取下雙側(cè)子宮，一側(cè)置于4%多聚甲醛溶液標(biāo)號(hào)用于病理學(xué)和免疫組化檢測(cè)，一側(cè)置于凍存管中標(biāo)號(hào)后置于-80℃冰箱保存用于蛋白印跡檢測(cè)(均為左側(cè)子宮置于4%多聚甲醛，右側(cè)-80℃凍存)。取材完畢后將靜置的血液進(jìn)行離心，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液于2 mL EP管內(nèi)，標(biāo)號(hào)后置于-80℃冰箱保存用于ELISA檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 大鼠盆腔及子宮形態(tài) 開腹后對(duì)比觀察雙側(cè)子宮有無(wú)充血、積液、包塊、粘連等情況。

1.5.2 大鼠子宮組織病理形態(tài) 將保存于4%多聚甲醛溶液中的子宮組織取出，使用梯度酒精對(duì)組織進(jìn)行脫水處理；然后使用二甲苯進(jìn)行組織透明；再將透明后的組織塊進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色后，顯微鏡下觀察子宮組織病理學(xué)變化。

1.5.3 免疫組織法測(cè)大鼠子宮組織中TNF-α、NF-κB的表達(dá) 將大鼠子宮按照免疫組化方法依次進(jìn)行組織脫水、組織透明、石蠟包埋、切片、烘片、抗原修復(fù)、抗原封閉、滴加一抗二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、中性樹脂封片，切片晾干后成像觀察。選取3個(gè)不同視野采集圖像，運(yùn)用IPP6.0圖像分析軟件分析相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量(平均光密度值表示)。

1.5.4 ELISA法測(cè)定血清IL-4、IL-6、IL-10水平 取待測(cè)血清，采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定血清中IL-4、IL-6、IL-10水平。

1.5.5 蛋白印跡法測(cè)定大鼠子宮中TLR2、TLR4、MyD88蛋白表達(dá) 將凍存于-80℃的子宮組織充分裂解后，用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后在4℃下12 000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20℃保存。蛋白質(zhì)定量后依次進(jìn)行制膠、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、免疫印跡顯色(封閉、一抗二抗孵育、顯色曝光)后采集圖像，采用Image J軟件分析各組顯色蛋白條帶的平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠子宮形態(tài)觀察

Control組：大鼠子宮大小、形態(tài)正常，活動(dòng)度正常，無(wú)明顯充血及水腫，無(wú)包塊形成，與周圍組織無(wú)粘連。SPID組：大鼠子宮與周圍盆腔組織廣泛粘連，質(zhì)地變硬，部分大鼠急慢性混合感染，子宮出現(xiàn)明顯充血、積液、蓄膿的情況。Drugs組：大鼠子宮活動(dòng)度一般，周圍盆腔組織粘連較輕，子宮形態(tài)部分恢復(fù)正常。Cells組：大鼠子宮活動(dòng)度較好，質(zhì)地較軟，與周圍盆腔組織粘連明顯減輕，與Drugs組相當(dāng)，子宮形態(tài)部分恢復(fù)正常。

2.2 4組大鼠子宮病理觀察

Control組：子宮壁各層形態(tài)完整，無(wú)腺體增生及破壞，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；SPID組：子宮壁各層分界不清，上皮細(xì)胞大量壞死脫落伴增生，部分腺體結(jié)構(gòu)被破壞，排列紊亂，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Drugs組：子宮壁各層形態(tài)較完整，上皮細(xì)胞稍有壞死脫落伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Cells組：子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列較規(guī)則。見圖1。

圖1 4組大鼠子宮病理情況(HE,×200)

2.3 4組大鼠子宮組織中TNF-α、NF-κB的表達(dá)比較

與Control組相比,SPID組大鼠子宮組織中TNF-α、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加(P<0.01)，表明模型建立成功。與SPID組相比,Drugs組和Cells組的TNF-α、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)，表明UCMSCs與婦科千金片對(duì)TNF-α、NF-κB均有下調(diào)作用；TNF-α的表達(dá)水平在Drugs組與Cells組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，NF-κB在Cells組中的表達(dá)水平明顯低于Drugs組(P<0.01)，表明UCMSCs在下調(diào)SPID大鼠體內(nèi)NF-κB的效果略優(yōu)于婦科千金片。見下頁(yè)圖2、圖3。

圖2 4組大鼠子宮組織中TNF-α、NF-κB的表達(dá)(IHC，×400)

2.4 4組大鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10水平比較

與Control相比,SPID組大鼠血清中IL-6水平顯著增加(P<0.01)，IL-4、IL-10水平明顯降低(P<0.01)。與SPID組相比,Cells組和Drugs組的IL-6水平均明顯降低(P<0.01)，Cells組中IL-4、IL-10水平明顯增加(P<0.01)，Drugs組中IL-4水平略有增加但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IL-10水平明顯增加(P<0.01),Cell組中IL-4較Drugs組增加明顯(P<0.01)；其余指標(biāo)水平在Drugs組與Cells組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明UCMSCs與婦科千金片對(duì)于SPID的治療效果接近。見下頁(yè)圖4。

注:★表示與Control組相比P<0.05,★★表示P<0.01,●表示與SPID組相比P<0.05,●●表示P<0.01,■表示與Drugs組相比P<0.05,■■表示P<0.01。

注:★表示與Control組相比P<0.05,★★表示P<0.01,●表示與SPID組相比P<0.05,●●表示P<0.01。

2.5 4組大鼠子宮組織中TLR2、TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)比較

與Control組相比,SPID組大鼠子宮組織中TLR2、TLR4、MyD88蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)。與SPID組相比,Drugs組和Cells組的TLR2、TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)水平均降低(P<0.01)；上述蛋白水平在Drugs組與Cells組中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明UCMSCs與婦科千金片對(duì)于SPID的治療效果相當(dāng)。見圖5、下頁(yè)圖6。

圖5 4組大鼠子宮組織中TLR2、TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)

注:★表示與Control組相比P<0.05,★★表示P<0.01,●表示與SPID組相比P<0.05,●●表示P<0.01。

3 討論

SPID作為一種困擾女性的常見病，輕者會(huì)出現(xiàn)表現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、盆腔疼痛、白帶異常等癥狀，重者會(huì)出現(xiàn)異位妊娠、不孕、敗血癥等嚴(yán)重后果。目前對(duì)于SPID的機(jī)制研究尚未明確，因此對(duì)其常采用對(duì)癥治療，如：(1)應(yīng)用抗生素抗感染治療，但抗生素一般應(yīng)用于急性感染期，對(duì)于已經(jīng)形成的組織損傷及粘連治療效果欠佳；(2)應(yīng)用手術(shù)解除粘連、包塊或梗阻，手術(shù)為有創(chuàng)手段，可能會(huì)造成其他的損傷；(3)應(yīng)用微波治療減少結(jié)締組織增生等；(4)應(yīng)用中藥或針灸減緩慢性炎癥，防止組織進(jìn)一步增生，但以上方法治療效果參差不齊，容易反復(fù)。而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為一種具備強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化能力的細(xì)胞，能對(duì)受損組織起到修復(fù)及保護(hù)作用，同時(shí)它還能通過(guò)多種途徑對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)控，從而起到抗炎的作用。因此本實(shí)驗(yàn)將采用HUMSCs對(duì)SPID進(jìn)行治療，并進(jìn)一步探索其可能存在的作用機(jī)制。

TLR/MyD88/NF-κB通路在SPID中發(fā)揮重要作用[11-12]，當(dāng)病原體入侵女性生殖系統(tǒng)時(shí)，會(huì)激活廣泛分布在生殖系統(tǒng)中的TLRs，其中主要包括TLR2、TLR4[13]。TLRs是一種模式識(shí)別抗體，與人體的固有免疫有著密切關(guān)系。MyD88是TLRs信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵的銜接蛋白，當(dāng)生殖系統(tǒng)中TLRs被激活后，活化下游的 MyD88，最終激活 NF-κB，促進(jìn)炎癥因子的釋放，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等，最終導(dǎo)致炎癥發(fā)生[14]。相關(guān)報(bào)道顯示，抑制TLR/MYD88/NF-κB通路，可減輕盆腔炎癥狀，改善預(yù)后[15]。

MSCs在先天免疫與適應(yīng)性免疫中都具有免疫調(diào)節(jié)作用，但是MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用與炎癥微環(huán)境中各種細(xì)胞因子息息相關(guān)[16]。當(dāng)炎癥發(fā)生后，MSCs可迅速參與到炎癥微環(huán)境的形成中。在早期，MSCs可促進(jìn)炎癥因子釋放清除病原體；晚期時(shí)，抑制過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)[17]。且有研究表明，MSCs在一些存在炎性損傷的疾病中，能降低TLR2、TLR4的表達(dá)，從而起到修復(fù)組織改善病情的作用[18]。因此本研究將盆腔炎可能存在的免疫學(xué)機(jī)制與MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)TLR/MYD88/NF-κB通路探討UCMSCs是否對(duì)SPID有治療作用。

SPID目前缺乏特異性的治療手段，根據(jù)2020年發(fā)布的《中成藥治療盆腔炎性疾病后遺癥臨床應(yīng)用指南》，婦科千金片為治療SPID的推薦用藥[1]。婦科千金片由功勞木、單面針、千斤拔、當(dāng)歸、穿心蓮、黨參、雞血藤、金櫻根等組成，具有益氣養(yǎng)血、活血化瘀等功效[19]。但中成藥起效慢，作用機(jī)理復(fù)雜，尚未得到廣泛認(rèn)可。在部分文獻(xiàn)報(bào)道中表明婦科千金片治療SPID的作用機(jī)制或與下調(diào)TLR相關(guān)，基于其臨床療效及可能存在的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)將其作為與HUMSCs治療SPID的對(duì)比用藥[20]。

在SPID發(fā)生發(fā)展中，會(huì)產(chǎn)生大量的炎性因子，包括TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10等。這些因子會(huì)擾亂機(jī)體正常免疫調(diào)控，引發(fā)細(xì)胞聯(lián)級(jí)反應(yīng)，產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)釋放，加重炎癥反應(yīng)[21]。其中TNF-α、IL-6屬于前炎癥因子，具有趨化作用，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集與活化，加劇炎癥[22]；IL-4、IL-10均為抗炎因子，其中IL-4主要來(lái)源于Th2細(xì)胞，IL-10主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等，在炎癥發(fā)生過(guò)程中，這兩種因子的增加可有效地減輕炎癥反應(yīng)[23]。本實(shí)驗(yàn)中，SPID組大鼠中TNF-α、IL-6水平明顯增加，IL-4、IL-10水平顯著下降，細(xì)胞因子嚴(yán)重失衡，出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)。而Cells組與Drugs組在給予治療后，組織中的TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)較SPID組均明顯降低，從而減少了下游TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放，同時(shí)還上調(diào)了抗炎因子IL-4、IL-10的釋放，使得炎癥減輕。這表明HUMSCs可通過(guò)下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，抑制下游炎癥因子的表達(dá)從而起到抗炎作用，且本研究結(jié)果表明HUMSCs抑制NF-κB的作用略優(yōu)于婦科千金片。NF-κB是一種普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子，參與介導(dǎo)了細(xì)胞炎癥、細(xì)胞炎增殖、分化、凋亡和免疫應(yīng)答等生理活動(dòng)，研究表明在NF-κB被激活后，體內(nèi)釋放大量炎癥因子，而這些炎癥因子中，TNF-α和IL-1β的表達(dá)又可進(jìn)一步增加NF-κB的活性，引起其他炎癥介質(zhì)的釋放，放大炎癥信號(hào)，增加炎癥程度[24]。因此降低NF-κB的表達(dá)可有效地改善SPID大鼠的癥狀。相對(duì)于傳統(tǒng)的口服藥來(lái)說(shuō)，HUMSCs具有治療次數(shù)少的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)有治療方式復(fù)雜的缺點(diǎn)，如果可以利用間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢性，開發(fā)灌洗類、口服類藥劑，將大大提高其利用率。

綜上，本研究結(jié)果表明HUMSCs可通過(guò)下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB通路減少促炎因子釋放，上調(diào)抗炎因子的表達(dá)從而減輕SPID大鼠的炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療SPID的效果，有望成為治療盆腔炎的新型藥物。