郭斐斐，王思農(nóng)，牛凡琪，劉 婧，牛凡紅

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000

近年來(lái)，由多種因素造成體表菌群失調(diào)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)成為痤瘡發(fā)病機(jī)制中研究的重點(diǎn)內(nèi)容［1］，相關(guān)研究表明，從起病階段的白頭、黑頭粉刺到中期丘疹和紅斑，再到后期色素沉著、痤瘡瘢痕的形成，炎癥反應(yīng)貫穿痤瘡發(fā)病的各個(gè)階段［2］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號(hào)通路可傳導(dǎo)刺激信號(hào)，介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行一系列的病理反應(yīng)［3］。本研究觀察三黃凝膠對(duì)痤瘡大鼠的干預(yù)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)Wistar 雌性大鼠48 只，周齡4～8 周，體質(zhì)量（180±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（甘）2018-005。喂養(yǎng)條件一致。

1.2 藥品與試劑三黃凝膠［含3.6 g（生藥）/10 g，院內(nèi)制劑試生產(chǎn)階段，由窯街煤電集團(tuán)有限公司總醫(yī)院提供］；0.025%維A 酸乳膏（商品名：迪維，重慶華邦制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H50021817，規(guī)格：15 g/盒）；100%油酸500 mL（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：101212）。磷酸化-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(P-ERK)試劑盒（上海莼試生物科技有限公司，貨號(hào)：CS-E02542）；血清磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶P38 抗體（P-P38MAPK）試劑盒（上海白益生物科技有限公司，貨號(hào)：BY-PD5629S）。

1.3 方法

1.3.1 三黃凝膠制備方法 將三黃膏經(jīng)驗(yàn)方中的黃芩、黃連、黃柏、苦參、白芷、丹參、紫草等進(jìn)行低溫滅菌，粉碎干燥，制成粗顆粒，過(guò)200 目篩，用乙醇做溶劑，用滲漉法提取有效成分溶液，溶液靜置24 h 后，過(guò)濾，將冰片溶于濾液中，配制成三黃原液。對(duì)原液進(jìn)行脫色處理，將脫色液低溫濃縮備用，得三黃濃縮液。加入4.5 倍蒸餾水，再加入40%NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.0～7.0 制成三黃pH 調(diào)節(jié)液備用。將4%Cb940、2%月桂氮酮、10%甘油均勻混合制成成膠基質(zhì)，將三黃pH 調(diào)節(jié)液、成膠基質(zhì)、0.2%山梨酸鉀、2.0%～2.5%的三乙醇胺均勻攪拌混合，加蒸餾水，即得三黃凝膠［4］。

1.3.2 造模 將48 只大鼠遵循簡(jiǎn)單排序隨機(jī)化原則分為6 組，適應(yīng)環(huán)境24 h 后，除空白組外，其余5 組開(kāi)始造模，造模方法［5］：每只大鼠右耳內(nèi)側(cè)耳廓導(dǎo)管開(kāi)口處涂抹100%油酸，每次0.5 mL，每日1 次，連續(xù)造模3 周。隨機(jī)取2 只模型鼠，取鼠耳進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）染色及形態(tài)學(xué)、病理學(xué)觀察，結(jié)果（+）～（+++）表示大鼠痤瘡模型造模完成。痤瘡組織學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)［6］見(jiàn)表1。

表1 痤瘡組織學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 分組及給藥 根據(jù)臨床有效劑量與大鼠用藥量換算，給藥方案：維A酸乳膏組5 g/（kg·d）；三黃凝膠低、中、高劑量組分別用0.02、0.04、0.08 g（生藥）/（kg·d）每日1 次，外用涂抹4 周?？瞻捉M與模型組外用生理鹽水涂抹4 周，每日1次。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠耳廓皮損情況 造模3周后隨機(jī)取2只模型鼠，切取其造模右耳，HE 染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，判斷造模效果。干預(yù)4 周后處死大鼠，切取大鼠造模右耳，HE 染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.4.2 大鼠血清P-P38MAPK、P-ERK含量測(cè)定 干預(yù)結(jié)束后大鼠心臟采血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)血清中P-P38MAPK及P-ERK含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠耳廓皮損組織病理學(xué)空白組：表皮及角質(zhì)層未見(jiàn)明顯增厚，結(jié)構(gòu)完整，皮脂腺及毛囊未見(jiàn)擴(kuò)張。模型組：表皮及角質(zhì)層增厚，顆粒層及棘細(xì)胞層增厚明顯，毛囊及皮脂腺擴(kuò)張，角栓堵塞于毛囊內(nèi)，見(jiàn)大量角化物質(zhì)堆積，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。干預(yù)后維A酸乳膏組：表皮及角質(zhì)層較模型組變薄，毛囊稍有擴(kuò)大，皮脂腺結(jié)構(gòu)正常，偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。干預(yù)后三黃凝膠高劑量組：表皮及角質(zhì)層明顯變薄，毛囊及皮脂腺體積縮小，見(jiàn)少量角化物質(zhì)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目減少。干預(yù)后三黃凝膠中劑量組：表皮及角質(zhì)層較模型組變薄，結(jié)構(gòu)完整，皮脂腺擴(kuò)大，毛囊漏斗部可見(jiàn)少量致密角化物質(zhì)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減輕。干預(yù)后三黃凝膠低劑量組：表皮結(jié)構(gòu)完整，增厚明顯改善，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少，毛囊及皮脂腺擴(kuò)大程度減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠耳廓皮損的組織病理學(xué)（HE×100）

2.2 血清P-P38MAPK、P-ERK 含量模型組大鼠血清P-P38MAPK 含量較空白組升高（t=-37.46，P＜0.01）。維A酸乳膏組及三黃凝膠低、中、高劑量組大鼠血清P-P38MAPK含量降低（P＜0.01）。三黃凝膠中、低劑量組大鼠血清P-P38MAPK含量與維A酸乳膏組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t5=-1.46，t6=-2.07，P＞0.05），三黃凝膠高劑量組與維A 酸乳膏組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.09，P＜0.05）。模型組大鼠血清P-ERK含量高于空白組（t=-44.84，P＜0.01）。維A 酸乳膏組及三黃凝膠低、中、高劑量組大鼠血清P-ERK 降低（P＜0.01）。三黃凝膠低、中劑量組與維A酸乳膏組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t5=1.03，t6=-0.18，P＞0.05）。三黃凝膠高劑量組與維A 酸乳膏組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.63，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清P-P38MAPK及P-ERK含量（）

表2 各組大鼠血清P-P38MAPK及P-ERK含量（）

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；※表示與維A酸乳膏組比較，P＜0.05?！?”表示等劑量生理鹽水

3 討論

作為人體最大的保護(hù)器官［7］，皮膚成為繼腸道后第二大復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其表面定居各種復(fù)雜的細(xì)菌、古生菌、真菌和病毒，保持各種微生物共存的動(dòng)態(tài)平衡不僅不會(huì)傷害到皮膚組織本身的結(jié)構(gòu)和功能，還能對(duì)外來(lái)刺激起防御抵抗作用［8］，由于各種體內(nèi)外因素打破了這種動(dòng)態(tài)平衡，微生物入侵皮膚，導(dǎo)致皮膚及機(jī)體發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生各種病理變化。近年來(lái)醫(yī)者越來(lái)越重視痤瘡丙酸桿菌增殖在痤瘡發(fā)病過(guò)程中的作用［9］，認(rèn)為痤瘡丙酸桿菌的增殖過(guò)程打破了皮膚的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)病變發(fā)展，痤瘡丙酸桿菌表面的肽聚糖（peptidoglycan，PGN）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）激活巨噬細(xì)胞表面的炎癥信號(hào)通路，從而發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)［10］。P38MAPK 通路是存在于細(xì)胞表面的一種促蛋白質(zhì)磷酸化酶，是MAPK 通路中最重要的一條亞通路［3］，具有參與炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡的作用，ERK 是重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，將外來(lái)刺激信號(hào)傳達(dá)到細(xì)胞核內(nèi)［11］。痤瘡丙酸桿菌過(guò)度增殖導(dǎo)致皮膚表面微生態(tài)環(huán)境被破壞，該通路將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞，引導(dǎo)表皮及真皮細(xì)胞進(jìn)行分化、凋亡，促使淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

中醫(yī)古籍稱痤瘡為“粉刺”“酒刺”“面粉皶”“肺風(fēng)粉刺”等。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中首次提到風(fēng)、寒、濕、熱之邪促其發(fā)病?！锻饪拼蟪伞し物L(fēng)酒刺》中指出肺衛(wèi)失調(diào)發(fā)病及從肺經(jīng)論治粉刺的觀點(diǎn)。后世醫(yī)家認(rèn)為粉刺的發(fā)病與飲食不潔、胃腸積熱；肝氣不暢、氣機(jī)阻滯，郁而化熱；肝胃不和，傷及肺臟，發(fā)為粉刺。后又提出陰虛發(fā)病的觀點(diǎn)，認(rèn)為粉刺發(fā)病離不開(kāi)腎陰氣虛，精血不能濡養(yǎng)，外邪復(fù)擾，無(wú)力抵抗，發(fā)為粉刺［12］。五臟失衡發(fā)病的觀點(diǎn)為后世醫(yī)家提供了診治思路。三黃凝膠是在王文春教授的經(jīng)驗(yàn)方“三黃膏”的基礎(chǔ)上加減化裁而成，方中黃芩、黃連、黃柏為君，性味苦寒，泄三焦郁熱。黃芩歸肺經(jīng)，清肺熱，燥濕涼血，活血散結(jié)；黃連歸心、脾、肝經(jīng)，清心瀉火，涼血消肝；黃柏歸腎經(jīng)，滋陰瀉火，解毒燥濕。從五臟論治，使五臟調(diào)達(dá)，正氣盛則邪去；苦參、丹參苦寒，主清熱燥濕，活血涼血，解毒消癰；白芷微溫，平和諸藥之苦寒，以防諸藥寒涼傷及脾胃，兼消腫排膿散結(jié)；紫草、冰片活血涼血，通諸竅，暢情志?，F(xiàn)代藥理研究表明：黃芩的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL 時(shí)對(duì)痤瘡丙酸桿菌及表皮金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯［13］。黃連可對(duì)抗病原微生物增殖，抑制毛囊擴(kuò)張，抑制皮脂腺過(guò)多分泌油脂，調(diào)節(jié)面部水油平衡［14］；黃柏可調(diào)節(jié)皮膚表面菌群失調(diào)，促進(jìn)表皮修復(fù)［15］；苦參中所含苦參堿有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡的作用［16］；白芷中所含歐前胡素、異歐前胡素具有抗炎、抗感染且能軟化角質(zhì)的作用［17］；丹參中含有的丹參酮可抑制炎癥細(xì)胞趨化性，抑制炎癥發(fā)展，還可調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平［18］；紫草中紫草素可抑菌、抗感染，且能調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力［19］；冰片在抗炎的同時(shí)還增加組方中藥的透皮吸收率，2%天然冰片和2%合成冰片對(duì)于藥物的經(jīng)皮吸收效果最好［20］。諸藥合用清熱涼血，活血散瘀，治療痤瘡。

三黃凝膠采用凝膠機(jī)制，改進(jìn)了三黃膏的制備工藝，使藥物濃度更高，透皮吸收率更高，增加了藥物的有效治療時(shí)間，同時(shí)還可減少痤瘡患者面部色素沉著及預(yù)防痤瘡瘢痕的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三黃凝膠可促進(jìn)恢復(fù)痤瘡大鼠模型表皮微生態(tài)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，改善痤瘡癥狀。