楊新達(dá)，牛肖凡，劉仲浩，張健，張巧珍，高強(qiáng)*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)理學(xué)院，天津 300457）

棉子糖腸球菌（Enterococcus raffinosus）屬于革蘭氏陽(yáng)性腸球菌屬（Enterococcus）的兼性厭氧菌，在自然界中分布較廣[1-4]，并且廣泛存在于哺乳動(dòng)物的腸道及生殖道內(nèi)，為腸道菌群的重要組成部分[5-6]。王春艷等[7]在新疆伊犁傳統(tǒng)手工奶酪中分離出棉子糖腸球菌，旭日花[8]在通遼牧區(qū)乳制品中分離出棉子糖腸球菌菌株，進(jìn)一步證實(shí)了棉子糖腸球菌在食品發(fā)酵領(lǐng)域的生物安全性。棉子糖腸球菌為野生大熊貓腸球菌的優(yōu)勢(shì)菌，大熊貓野化放歸后，糞便中腸球菌的種類增加，均衡各類腸球菌所占比例，有利于放歸大熊貓快速適應(yīng)野外生存環(huán)境[9]。通過(guò)生物發(fā)酵法，棉子糖腸球菌可生產(chǎn) γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）。陳慧敏等[10]、段強(qiáng)等[11]使用在東北酸菜中分離出的棉子糖腸球菌進(jìn)行γ-氨基丁酸的高產(chǎn)發(fā)酵，為工業(yè)化γ-氨基丁酸的發(fā)酵生產(chǎn)提供了新的思路。

隨著儀器科學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，質(zhì)譜類儀器的檢測(cè)精度逐步提高、檢測(cè)范圍也逐步擴(kuò)大，使得準(zhǔn)確檢測(cè)出小分子代謝物成為可能[12-13]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 技術(shù)憑借其發(fā)展較成熟、靈敏度與分辨率高以及標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)豐富等特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用到代謝組學(xué)研究中[14-16]。GCMS能準(zhǔn)確地檢測(cè)出大量的胞內(nèi)小分子代謝物（相對(duì)分子質(zhì)量小于1 500 Da）[17-18]，并通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)而對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性與定量[19-20]。目前，代謝組學(xué)在微生物相關(guān)研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，通過(guò)代謝組學(xué)研究各種微生物的方法常有報(bào)道，但是關(guān)于棉子糖腸球菌的代謝組學(xué)的相關(guān)研究較少。本試驗(yàn)旨在探究棉子糖腸球菌最優(yōu)的代謝組學(xué)樣品前處理方法，著重研究樣品前處理過(guò)程中破碎方式（液氮研磨破碎和超聲破碎）、清洗次數(shù)和凍融時(shí)間對(duì)代謝物提取的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

棉子糖腸球菌（Enterococcus raffinosus）：天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心從東北酸菜中分離篩選獲得，現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5584。

1.1.2 主要試劑

甲氧基胺鹽酸鹽-吡啶、N-甲基-N（三甲基硅烷）三氟乙酰胺、氘代琥珀酸(色譜純)：北京西格瑪生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙醇、三氯甲烷(色譜純)：賽默飛世爾科技有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

5977B-7890A型單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：美國(guó)安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水制備系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖 10 g/L、乙酸鈉 5 g/L、檸檬酸銨 2.5 g/L、硫酸錳0.05 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、瓊脂15 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)液：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖10 g/L、乙酸鈉0.1g/L、檸檬酸銨2.5g/L、硫酸錳0.05g/L、硫酸鎂0.2 g/L、吐溫-80 1 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌體制備

將凍存于-80℃甘油管中的棉子糖腸球菌CGMCC No.5584菌株接種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)12 h，使用無(wú)菌接種環(huán)挑取單一菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)24 h，從而得到菌液樣品，為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品選取5個(gè)平行。

1.2.2 菌體淬滅

將甲醇和超純水按照體積比3∶1混合得到淬滅液，取150 mL預(yù)冷至-20℃以下的淬滅液與50 mL菌液，快速混合淬滅5 min，8 000 r/min、4℃離心10 min，將菌體沉淀轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌體處理

1.2.3.1 清洗

將淬滅好的菌體加入4℃預(yù)冷的清洗液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的NaCl溶液）混勻，8 000 r/min、4℃離心 10 min，棄上清液，分別重復(fù)2、3、4次；離心后得到菌體沉淀，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 破碎

液氮研磨法：取清洗3次后的菌體，將菌體置于潔凈的16層醫(yī)用紗布濾去水分，再將處理后的菌體置于液氮預(yù)冷的研缽中，研磨至細(xì)粉狀，稱取100 mg菌體粉末至液氮預(yù)冷的2 mL離心管中，置于冰上保存；每管樣品加入1 mL提取液，渦旋3 min混勻至乳白色，置于冰上保存。

超聲破碎法：取清洗3次后的菌體與4℃預(yù)冷的甲醇混勻，置于40 kHz的超聲儀中破碎，放入冰袋保持低溫環(huán)境，超聲30 min，每隔5 min將菌體搖勻1次，真空冷凍干燥后，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 凍融

將液氮研磨破碎處理后的樣品置于液氮中凍融，凍融時(shí)間分別為 2、3、4 min，重復(fù) 4 次，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾至1.5 mL離心管中，封口，于-80℃保存。

1.2.4 胞內(nèi)小分子代謝物提取

在裝有樣品的1.5 mL離心管中加入1 mL提取液，渦旋3 min混勻至乳白色，置于冰盒上保存。

1.2.5 衍生化反應(yīng)

（1）取 200 μL 樣品提取液加入 20 μL 的 1 mg/mL氘代琥珀酸，真空冷凍干燥之后，加80 μL甲氧基銨鹽酸鹽-吡啶溶液，將樣品充分溶解，40°C水浴80 min。

（2）水浴后的樣品中加入120 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均勻后，置于40℃水浴鍋中水浴衍生80 min。

（3）衍生后的樣品于10000r/min、4℃離心5min后，取上清液100 μL加入已編號(hào)的進(jìn)樣瓶中，室溫靜置2 h后置于-80℃保存，用于后續(xù)的GC-MS檢測(cè)[21]。

1.2.6 GC-MS檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5（60mm×0.25mm×0.25 μm）；載氣為氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度為280℃；進(jìn)樣量為1 μL；流速為 1 mL/min；分流比為 5∶1；采用程序升溫，初始溫度70℃保持2 min，以5℃/min程序升溫至290℃并保持5min。

質(zhì)譜條件：接口溫度為280℃；電離方式為電子轟擊電離；離子源溫度為230℃；掃描質(zhì)量范圍m/z 50～800[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將由GC-MS采集的原始數(shù)據(jù)和NIST 17.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)搜索得到的相應(yīng)代謝物去除冗雜峰和重峰，然后將峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化處理，對(duì)相應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行匹配，用于后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同破碎方法處理棉子糖腸球菌的主要代謝物成分比較

本試驗(yàn)通過(guò)采用超聲和液氮凍融兩種方式對(duì)菌體進(jìn)行破碎，然后經(jīng)代謝組學(xué)方法對(duì)不同處理方式的菌體進(jìn)行胞內(nèi)代謝物檢測(cè)及分析，探究不同破碎方式對(duì)棉子糖腸球菌代謝組學(xué)樣品前處理的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。不同處理獲得的小分子代謝物差異的韋恩圖見(jiàn)圖2。

圖1 不同破碎方式處理的小分子代謝物色譜圖Fig.1 Chromatograms of small molecular metabolites released from the cells pretreated by different crushing methods

表1 不同處理獲得的小分子代謝物差異情況Table 1 Differences of small molecular metabolites released from the cells pretreated by different methods

續(xù)表1 不同處理獲得的小分子代謝物差異情況Continue table 1 Differences of small molecular metabolites released from the cells pretreated by different methods

圖2 不同處理獲得的小分子代謝物差異的韋恩圖Fig.2 Venn diagrams of small molecular metabolites released from the cells pretreated by different methods

如圖1和表1所示，液氮研磨法可檢測(cè)出253種小分子代謝物，在NIST 17.0數(shù)據(jù)庫(kù)中準(zhǔn)確匹配到8類共47種物質(zhì)，其中酯類5種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類5種、酸類30種、糖類1種、苯環(huán)類2種、其他（3-羥基吡啶，普遍認(rèn)為是衍生劑吡啶的菌體羥化物）1種；超聲破碎法卻只能檢測(cè)出211種小分子代謝物，而且僅準(zhǔn)確匹配到7類共39種物質(zhì)，其中酯類4種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類4種、酸類26種、糖類1種、苯環(huán)類1種。圖2a表明，液氮研磨法準(zhǔn)確匹配的47種物質(zhì)完全覆蓋了超聲破碎法準(zhǔn)確匹配的39種物質(zhì)。因此，后續(xù)的試驗(yàn)均采用液氮研磨法對(duì)棉子糖腸球菌進(jìn)行菌體破碎。

2.2 不同清洗次數(shù)處理棉子糖腸球菌的主要代謝物成分比較

清洗次數(shù)對(duì)棉子糖腸球菌代謝組學(xué)樣品前處理的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同清洗次數(shù)提取小分子代謝物的色譜圖Fig.3 Chromatograms of small molecular metabolites released from the cells washed for different times

如圖3和表1所示，清洗2次可以檢測(cè)出238種小分子代謝物，包括準(zhǔn)確匹配出的7類43種物質(zhì)，其中酯類4種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類4種、酸類28種、糖類1種、苯環(huán)類2種；清洗3次可以檢測(cè)出253種小分子代謝物，包括準(zhǔn)確匹配出的8類47種物質(zhì)，其中酯類5種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類5種、酸類30種、糖類1種、苯環(huán)類2種、其他1種；清洗4次可以檢測(cè)出197種小分子代謝物，包括準(zhǔn)確匹配出的7類36種物質(zhì)，其中酯類4種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類4種、酸類24種、糖類1種、苯環(huán)類2種。圖2b表明，3次清洗得到的準(zhǔn)確匹配的8類47種小分子代謝物完全覆蓋2次和4次清洗準(zhǔn)確匹配的7類43種和36種小分子代謝物。因此，后續(xù)的試驗(yàn)均對(duì)棉子糖腸球菌進(jìn)行3次菌體清洗。

2.3 不同凍融時(shí)間處理棉子糖腸球菌的主要代謝物成分的比較

凍融時(shí)間對(duì)棉子糖腸球菌代謝組學(xué)樣品前處理的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同凍融時(shí)間提取小分子代謝物的色譜圖Fig.4 Chromatograms of small molecular metabolites released from the cells frozen-thawn for different time periods

如圖4和表1所示，凍融2 min后可以檢測(cè)出229種小分子代謝物，包括精確匹配出的7類41種物質(zhì)，其中酯類5種、烷烴類1種、醇類4種、酸類27種、糖類1種、苯環(huán)類2種、其他1種；凍融3 min可以檢測(cè)出253種小分子代謝物，包括精確匹配出的8類47種物質(zhì)，其中酯類5種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類5種、酸類30種、糖類1種、苯環(huán)類2種、其他1種；凍融4 min可以檢測(cè)出197種小分子代謝物，包括精確匹配出的8類45種物質(zhì)，其中酯類4種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類5種、酸類29種、糖類1種、苯環(huán)類2種、其他1種。圖2c表明，凍融3 min得到的準(zhǔn)確匹配的47種小分子代謝物完全覆蓋了凍融2 min和4min準(zhǔn)確匹配的41種和45種小分子代謝物。因此，后續(xù)試驗(yàn)對(duì)棉子糖腸球菌的凍融時(shí)間控制為3 min。

棉子糖腸球菌胞內(nèi)小分子代謝物成分的總離子流圖見(jiàn)圖5所示。

圖5 棉子糖腸球菌胞內(nèi)小分子代謝物成分的GC-MS總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of small molecular metabolites of Enterococcus raffinosus

由圖5可知，經(jīng)優(yōu)化后的前處理方法處理的樣品，通過(guò)GC-MS檢測(cè)共鑒定出253種胞內(nèi)小分子代謝物，經(jīng)NIST17.0數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共匹配出8類47種物質(zhì)，結(jié)合表1可知，其中酯類5種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類5種、酸類30種、糖類1種、苯環(huán)類2種、其他1種。

3 討論與結(jié)論

在GC-MS檢測(cè)過(guò)程中，不同的前處理方式對(duì)提取的小分子代謝物種類貢獻(xiàn)不同[23-25]。

本試驗(yàn)首先比較了液氮研磨法和超聲破碎法對(duì)菌體的破碎效果。結(jié)果表明，液氮研磨法共提取出253種小分子代謝物，超聲破碎法則只能提取出211種小分子代謝物。其中可以精確匹配的8類小分子代謝物中，超聲破碎較液氮研磨法有不同程度的減少，其中酯類、醇類、苯環(huán)類和其他類分別減少了1種，而差異性最明顯的酸類減少了4種，說(shuō)明液氮研磨法更有利于小分子代謝物的提取，尤其是酸類物質(zhì)。

不同的清洗次數(shù)對(duì)小分子代謝物的提取具有較明顯的影響。清洗次數(shù)為2次時(shí)，檢測(cè)出238種小分子代謝物；清洗3次時(shí)，檢測(cè)出253種小分子代謝物，其中精確匹配的小分子代謝物的類別和數(shù)量最多，為8類47種；清洗4次時(shí)，檢測(cè)出197種小分子代謝物。在一定范圍內(nèi)，增加清洗次數(shù)有利于小分子代謝物的提取，清洗次數(shù)過(guò)多則會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)小分子代謝物泄露，進(jìn)而影響后續(xù)試驗(yàn)的精度。所以，清洗3次為最佳清洗次數(shù)。

不同的凍融時(shí)間也對(duì)小分子代謝物的提取有一定的影響。凍融時(shí)間為2 min時(shí)，檢測(cè)出229種小分子代謝物；凍融時(shí)間為3 min時(shí)，檢測(cè)出253種小分子代謝物，其中精確匹配的小分子代謝物的類別和數(shù)量也最多，為8類47種；凍融時(shí)間為4min時(shí)，檢測(cè)出247種小分子代謝物。在一定范圍內(nèi)，增加凍融時(shí)間有利于小分子代謝物的提取，但凍融時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)小分子代謝物的提取影響不大，所以，3 min凍融時(shí)間為最佳凍融時(shí)間。

綜上所述，基于本試驗(yàn)結(jié)果，選取液氮研磨破碎、凍融3 min、清洗3次對(duì)棉子糖腸球菌菌體樣本進(jìn)行前處理，能最多檢測(cè)到253種小分子代謝物，并最大限度地精確匹配出其中的8類47種，更有利于后續(xù)代謝組學(xué)試驗(yàn)的進(jìn)行。

本研究利用GC-MS技術(shù)，通過(guò)探究不同菌體破碎方式、清洗次數(shù)和凍融時(shí)間對(duì)棉子糖腸球菌胞內(nèi)代謝物提取的影響，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)母淖兦疤幚矸椒ǖ牟糠謪?shù)，可有效地增加胞內(nèi)代謝物提取數(shù)量和種類，對(duì)于液氮研磨破碎、清洗3次、凍融3 min優(yōu)化處理的樣品，共檢測(cè)出253種胞內(nèi)小分子物質(zhì)，使用NIST 17.0數(shù)據(jù)庫(kù)可精確匹配出47種物質(zhì)，其中酯類5種、烯烴類1種、烷烴類2種、醇類5種、酸類30種、糖類1種、苯環(huán)類2種、其他1種。本研究為棉子糖腸球菌代謝組學(xué)樣品前處理研究提供了一定的參考依據(jù)。