曲航飛，許疆維，王彥芹

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

植物表皮蠟質(zhì)是植物與外界環(huán)境直接相接觸的一層疏水保護(hù)層，在不同的物種之間，植物表皮蠟質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成均有很大差異，但都具有類似的蠟質(zhì)合成途徑，前人對(duì)該途徑的研究已經(jīng)取得了顯著的成果。植物表皮蠟質(zhì)不僅能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的水分應(yīng)對(duì)干旱、高溫等非生物脅迫，而且在限制非氣孔水分流失方面也一直起著至關(guān)重要的作用，其作為植物與病原菌的第一個(gè)接觸部位，是植物的物理屏障，不僅能夠限制病原菌的入侵，而且在植物抗細(xì)菌、真菌和昆蟲病害中發(fā)揮了多重作用，因此植物表皮蠟質(zhì)對(duì)植物的生長和發(fā)育起著重要的作用。

脂肪酸去飽和酶(FAD)是一種能夠催化脂肪酸鏈特定位置使其形成雙鍵，以此來產(chǎn)生不飽和脂肪酸的酶類［1］。不飽和脂肪酸根據(jù)雙鍵個(gè)數(shù)的不同分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸［2］。根據(jù)雙鍵的位置及其功能的不同，又可以將多不飽和脂肪酸分為ω-6系列和ω-3系列［3］。不飽和脂肪酸是植物膜脂的主要結(jié)構(gòu)成分，在大多數(shù)植物中其含量可達(dá)到75%以上［4］。從橄欖(Olea europaea cv.)中分離到3個(gè)編碼微粒體油酸脫氫酶FAD2的cDNA序列，序列分析和相應(yīng)cDNA在酵母中的功能表達(dá)證實(shí)它們編碼微粒體油酸脫飽和酶。基因表達(dá)和脂類分析表明，OeFAD2基因家族成員在亞油酸生物合成方面具有特殊的生理作用，既存在于構(gòu)成橄欖油的貯藏脂質(zhì)中，也存在于參與響應(yīng)非生物脅迫的膜脂中［5］。FAD2基因在植物的不同組織中表達(dá)不同，F(xiàn)AD2的過表達(dá)修飾了生理和營養(yǎng)特性。由于FAD2的活性導(dǎo)致二烯脂肪酸的含量增加，二烯脂肪酸含量的增加可以提高植物抗寒冷和鹽脅迫的能力，所以針對(duì)FAD2基因的研究對(duì)于提高植物抗逆性具有重要意義。

花花柴（Karelinia caspia），是菊科花花柴屬多年生草本植物，在國內(nèi)外分布廣泛，多生于干旱、半干旱地區(qū)的河谷沖積平原及沙質(zhì)草甸鹽土地［6］?；ɑú褡鳛橹匾姆里L(fēng)固沙植物，具有耐鹽堿、耐干旱、耐高溫以及耐沙埋等生理特性，是一種改善荒漠地區(qū)生態(tài)平衡的重要植物［7］。

本試驗(yàn)通過對(duì)常溫-高溫處理下的花花柴葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析及測(cè)序，從而挖掘花花柴耐高溫相關(guān)基因及生物學(xué)路徑，從基因轉(zhuǎn)錄水平揭示花花柴響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制［8］，為耐高溫分子育種提供基因資源理論和參考依據(jù)。并通過將花花柴外源基因KcFAD2轉(zhuǎn)入煙草，對(duì)轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行生理指標(biāo)等測(cè)定，以進(jìn)行其抗逆性的相關(guān)驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮花花柴采自于塔里木大學(xué)校園內(nèi)人工綠地（40°36′N，80°57′E），煙草種子‘K326’、大腸桿菌TOP10、根癌農(nóng)桿菌GV3101、超表達(dá)載體pK2GW 7.0以及用于亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)的載體pGWB406、輔助質(zhì)粒p19和核、膜Marker菌液等均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.2 花花柴蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的篩選

通過實(shí)驗(yàn)室前期常溫-高溫比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到有注釋的差異表達(dá)基因13 593個(gè)（差異表達(dá)倍數(shù)＞2），通過選取與花花柴耐高溫能力關(guān)系密切的角質(zhì)、軟木脂和蠟質(zhì)生物合成路徑的差異表達(dá)基因Kc-FAD2，Oleoyl-CoA在KcFAD2的催化下參與生成Linoleoyl-CoA。

1.3 花花柴蠟質(zhì)合成相關(guān)基因KcFAD2的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)

KcFAD2的引物序列如表1所示，將PCR產(chǎn)物通過BP-LR反應(yīng)連接到pGWB406載體上，該載體在35S啟動(dòng)子后N端含有EGFP蛋白。電轉(zhuǎn)得到含有目的基因的農(nóng)桿菌GV3101菌液，然后按照基因菌液∶Marker∶P19為2∶1∶1的比例混合，注射進(jìn)1月齡的本氏煙草葉片背面，不同樣品各做3次重復(fù)，暗培養(yǎng)24 h后見光培養(yǎng)48 h，使用FV1200激光共聚焦顯微鏡（Heidelberg公司）進(jìn)行觀察。

表1 KcFAD2引物序列

1.4 植物表達(dá)載體構(gòu)建及煙草遺傳轉(zhuǎn)化

設(shè)計(jì)BPLR反應(yīng)引物，用TA克隆質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)并做膠回收。利用BP反應(yīng)試劑盒根據(jù)同源重組的原理將KcFAD2構(gòu)建到中間載體Pdoner221上，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，篩選陽性菌落并提取重組質(zhì)粒。將上述BP反應(yīng)的重組質(zhì)粒利用LR反應(yīng)試劑盒通過同源重組的原理構(gòu)建到植物表達(dá)載體pK2GW7上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，篩選陽性菌落后，提取質(zhì)粒pK2GW7-KcFAD2。利用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pK2GW7-KcFAD2轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，篩選陽性菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)［9-10］。

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

使用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA，以基因組DNA作為模板進(jìn)行花花柴KcFAD2基因的陽性檢測(cè)PCR，以野生型煙草K326基因組DNA作為陰性對(duì)照，將含有GV3101-KcFAD2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌作為陽性對(duì)照，用瓊脂糖凝膠電脈法進(jìn)行檢測(cè)。T0代具體的檢測(cè)方法參考陳駱等［11］研究方法。

1.6 轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)量檢測(cè)

按照天根公司試劑盒說明書（RNA Easy Fast，TIANGEN公司）提取轉(zhuǎn)基因煙草幼嫩葉片的RNA，按試劑盒（cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Novoprotein公司）說明書配置體系放入反轉(zhuǎn)錄儀中，得到煙草cDNA，以提取出的轉(zhuǎn)基因煙草樣品的cDNA為模板，稀釋100倍用作Real-Time模板，煙草HSC70-1為內(nèi)參基因［12］，設(shè)計(jì)KcFAD2的 Real-Time PCR 引物（表1），所有處理4次重復(fù)，配置20 μL體系，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)基因的表達(dá)量。將結(jié)果導(dǎo)入Microsft Office Excel 2016軟件中，用POWER函數(shù)對(duì)CT值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，函數(shù)為：POWER(number，power)，其中參數(shù)number表示底數(shù)；參數(shù)power表示指數(shù)，計(jì)算公式使用2-△△Ct法，得到轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)量數(shù)據(jù)。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株高溫脅迫及脯氨酸和可溶性糖含量測(cè)定

將9周齡的轉(zhuǎn)基因煙草和陰性對(duì)照在42℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫處理，做5次生物學(xué)重復(fù)，期間保持濕度。10 h后取樣拍照，植物可溶性糖用試劑盒（Plant Soluble Sugar Content Assay Kit，boxbio公司）提取。脯氨酸含量用試劑盒（Proline Content Assay Kit，Boxbio公司）提取，分別將提取后的溶液點(diǎn)于酶標(biāo)板，置于多功能酶標(biāo)儀（Enspire公司）上檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)，得到轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸和可溶性糖含量數(shù)據(jù)圖。

1.8 轉(zhuǎn)基因植株高溫脅迫后蠟質(zhì)含量的測(cè)定

將9周齡的轉(zhuǎn)基因煙草裁剪成1 g的葉片，先用天平稱出質(zhì)量，再用20 mL三氯甲烷溶液漂洗20 s，將所得溶液過濾到已知質(zhì)量的培養(yǎng)皿中，可得到蠟質(zhì)質(zhì)量與葉片質(zhì)量的比值即為蠟質(zhì)含量，重復(fù)3次取平均值，同樣的方式得到高溫處理后葉片的蠟質(zhì)含量［13］。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用 Microsoft Office Excel 2016、Microsoft Office Word、IBM SPSS Statistics 23及 Adobe Photoshop 2021軟件進(jìn)行圖片制作與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 KcFAD2基因的克隆與序列分析

通過RT-PCR技術(shù)克隆花花柴KcFAD2基因的CDS全長序列，分析結(jié)果表明其編碼384個(gè)氨基酸，與NCBI數(shù)據(jù)庫中多種植物的FAD2均具有較高的同源性，與向日葵（Helianthusannuus）的相似性最高，達(dá)90.86%，同時(shí)因?yàn)榛ɑú窈喎Q為Kc，因此命名為Kc-FAD2，基因的登錄號(hào)為MW528401。

2.2 KcFAD2基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果

如圖1所示，通過亞細(xì)胞定位結(jié)果分析可知，綠色熒光主要存在于細(xì)胞膜上，其他部位并未出現(xiàn)綠色熒光，且能夠與膜Marker（CBL1:RFP）的紅色熒光發(fā)生共定位，表明該基因的表達(dá)產(chǎn)物定位在細(xì)胞膜上，為膜定位蛋白。

圖1 KcFAD2的亞細(xì)胞定位分析

2.3 KcFAD2轉(zhuǎn)基因煙草的轉(zhuǎn)化及鑒定

通過遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)共獲得KcFAD2陽性轉(zhuǎn)基因煙草10株，基因組DNA陽檢結(jié)果顯示如圖2A。Kc-FAD2基因在陽性轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量如圖2B所示，轉(zhuǎn)基因煙草的遺傳轉(zhuǎn)化過程如圖2C所示，選取表達(dá)量較高的陽性植株進(jìn)行后續(xù)抗性鑒定。

圖2 KcFAD2轉(zhuǎn)基因煙草的轉(zhuǎn)化及鑒定

2.4 KcFAD2轉(zhuǎn)基因煙草耐高溫性鑒定

由于KcFAD2基因是從花花柴高溫脅迫后的轉(zhuǎn)錄組中篩選出的上調(diào)表達(dá)基因，故本研究對(duì)該基因的耐高溫性進(jìn)行了研究。42℃高溫處理前轉(zhuǎn)基因煙草如圖3A所示，42℃高溫處理10 h后轉(zhuǎn)基因煙草如圖3B所示，WT煙草處理后呈明顯萎蔫狀態(tài)，而轉(zhuǎn)入KcFAD2基因的煙草無明顯改變，恢復(fù)正常溫度后長勢(shì)良好。

圖3 KcFAD2轉(zhuǎn)基因煙草和WT轉(zhuǎn)基因煙草高溫處理前后對(duì)比

圖4是對(duì)高溫脅迫下的野生型和KcFAD2轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量、可溶性糖含量等生化指標(biāo)測(cè)定。分析可知，在42℃高溫處理10 h后，轉(zhuǎn)基因煙草 K6-5、K6-6、K6-8、K6-10、K6-12脯氨酸含量顯著高K6-WT煙草(圖4A)；轉(zhuǎn)基因煙草K6-5、K6-6、K6-8、K6-10、K6-12可溶性糖含量顯著高于K6-WT煙草(圖4B）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)KcFAD2基因煙草在高溫脅迫后，能積累更多的可溶性糖和更多的脯氨酸。

圖4 轉(zhuǎn)基因煙草42℃處理10 h后脯氨酸含量和可溶性糖含量變化分析

2.5 KcFAD2轉(zhuǎn)基因煙草高溫處理前后蠟質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

如圖5所示，在42℃高溫處理10 h后，KcFAD2轉(zhuǎn)基因煙草的蠟質(zhì)含量均有提升，其中K6-5、K6-6、K6-8、K6-10、K6-12在高溫處理后蠟質(zhì)含量顯著上升，這可能與高溫促進(jìn)了蠟質(zhì)合成相關(guān)基因KcFAD2編碼蛋白合成有關(guān)，進(jìn)而提高了煙草葉片的蠟質(zhì)含量。

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草在42℃處理10 h后蠟質(zhì)含量的變化

3 討論

全球氣候變暖會(huì)加劇氣候事件的嚴(yán)重程度，高溫作為非生物脅迫嚴(yán)重影響我國作物生產(chǎn)［14］，因此提高作物的耐高溫性顯得尤為重要?；ɑú褡鳛榛哪参?，具有良好的耐高溫、抗干旱的優(yōu)點(diǎn)，其中表皮蠟質(zhì)發(fā)揮了重要的作用，表皮蠟質(zhì)不僅具有防止外力損傷的作用，還可以抵抗外界脅迫。蠟質(zhì)在植物抗細(xì)菌、真菌和昆蟲病害中也發(fā)揮了多重作用［15］。因此本試驗(yàn)以克隆花花柴蠟質(zhì)合成相關(guān)基因作為外源基因，構(gòu)建超表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以期改善作物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的能力。

FAD2基因在植物的不同組織中表達(dá)不同，F(xiàn)AD2的過表達(dá)不僅修飾了生理和營養(yǎng)特性，其活性也導(dǎo)致二烯脂肪酸的含量增加，因此增加了抗寒冷和鹽脅迫的能力［16］，所以針對(duì)FAD2的研究對(duì)于提高植物抗逆性有重要意義。由于本研究的基因KcFAD2是從花花柴常溫-高溫對(duì)比的RNA-seq數(shù)據(jù)中篩選出的差異表達(dá)基因，故選取的處理方式是高溫脅迫處理，42℃高溫脅迫處理10 h后的KcFAD2轉(zhuǎn)基因煙草在植株外在表觀、可溶性糖含量、脯氨酸含量的表現(xiàn)均優(yōu)于陰性對(duì)照WT煙草。綜合來看，糖類物質(zhì)是構(gòu)成植物體重要組成成分之一，不僅是新陳代謝的主要原料和貯存物質(zhì)，也可作為轉(zhuǎn)移介質(zhì)、功能分子和調(diào)節(jié)因子等調(diào)控植物的生長和發(fā)育［17］，結(jié)果表明Kc-FAD2基因上調(diào)表達(dá)可以促進(jìn)可溶性糖含量的提升；脯氨酸在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒、調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢(shì)以及提高植物的抗逆性等方面起重要作用［18］，從測(cè)得的數(shù)據(jù)分析可知Kc-FAD2轉(zhuǎn)基因表達(dá)量高的植株脯氨酸含量也高。在KcFAD2轉(zhuǎn)基因材料中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量最高的株系K6-6的脯氨酸含量以及可溶性糖含量均高于其他陽性植株，因此推測(cè)KcFAD2轉(zhuǎn)基因材料面對(duì)高溫脅迫能力的提升與脯氨酸含量提高和可溶性糖含量上升有關(guān)。同時(shí)在李銘楊等［19］研究大豆GmGolS1基因轉(zhuǎn)化煙草的試驗(yàn)中也存在表達(dá)量高的植株抗逆表現(xiàn)高于表達(dá)量低的植株的現(xiàn)象，因此推測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)高溫脅迫能力與KcFAD2基因的表達(dá)量呈正相關(guān)的趨勢(shì)。蠟質(zhì)在植物非生物和生物脅迫耐受中起著重要作用，并且與過度紫外線輻射、高溫、細(xì)菌和真菌病原體、昆蟲、高鹽度和低溫的防御機(jī)制有關(guān)［20］。本試驗(yàn)也對(duì)高溫處理前后的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了蠟質(zhì)含量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)含量在處理后普遍上升，由于在花花柴高溫表達(dá)譜中KcFAD2基因一直為上調(diào)表達(dá)，推測(cè)高溫促進(jìn)了蠟質(zhì)合成相關(guān)基因KcFAD2編碼蛋白的合成，進(jìn)而導(dǎo)致葉片蠟質(zhì)含量的上升。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，KcFAD2可以提高煙草抵抗高溫脅迫的能力，并且抵抗高溫脅迫的能力與基因的表達(dá)量為正相關(guān)，表達(dá)量越高，抵抗高溫脅迫的能力越強(qiáng)，同時(shí)可以促進(jìn)葉片蠟質(zhì)含量的升高。但由于轉(zhuǎn)基因植株在抗逆鑒定中表現(xiàn)出來的抗逆性僅為初步的研究結(jié)果，所以還需要在后代中做進(jìn)一步的抗逆鑒定。