何秋映，曾紅

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

由于抗菌藥物的濫用，細(xì)菌耐藥性問題［1］日趨嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)“超級細(xì)菌”，致病真菌更是產(chǎn)生了極強(qiáng)的耐藥性，而生物被膜（bacterial biofilm，BF）的形成有利于致病真菌有效躲避免疫系統(tǒng)，增加自身耐藥性。BF是指微生物附著于生物材料或人體組織表面，由自身產(chǎn)生的大量包裹細(xì)菌水合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落［1］。在食品方面，BF常為食源性致病菌提供生存保護(hù)［2］，從而導(dǎo)致食品污染，如果人食用食源性致病菌污染的食品會引發(fā)食物中毒甚至威脅生命，此外食源性致病菌形成的BF也會加大食品消毒難度［3］。在醫(yī)療方面BF的形成會增加革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏陽性球菌、表皮葡萄球菌、念珠菌、腸球菌、綠膿桿菌等病原菌對抗生素的耐藥性，并且會隨著醫(yī)療器械轉(zhuǎn)移，使臨床病原菌感染的疾病治療難度增加［4-5］。

白色念珠菌（Candida albicans）對宿主表面的黏附能力是決定BF能否形成的前提，如果形成的BF越多，其致病力越強(qiáng)［6-7］。白色念珠菌BF是由酵母相的孢子、菌絲及假菌絲構(gòu)成的三維立體結(jié)構(gòu)［8-10］，該結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了白色念珠菌的適應(yīng)能力、抵擋抗真菌藥物作用的能力以及躲避宿主免疫殺傷的能力［11］。此外，白色念珠菌BF能不斷脫落并釋放真菌細(xì)胞，使其菌體可以遷移至機(jī)體其他部位，導(dǎo)致宿主反復(fù)發(fā)生感染，大大增加治愈真菌感染的難度［12］。

植物是各種生物活性分子的重要來源，使用植物分子對抗多重耐藥菌株以及白色念珠菌的BF生長是一種極具前景的策略［13］。目前植物來源的醌類［14］、萜類［15］、黃酮類［16］、生物堿類［17-18］以及苯丙素類［19］等化合物顯示出較好的抗白色念珠菌BF活性。槐定堿（Sophoridine）是從豆科槐屬植物苦豆子中提取的單體生物堿，具有抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常、抗炎抑菌及免疫抑制等廣泛藥理活性［20-21］，其可以輕度抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成，使細(xì)胞增殖阻斷在G2期，并且槐定堿對DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ有抑制作用［22］，但目前關(guān)于槐定堿對BF抑制活性的相關(guān)研究報道較少。本試驗研究槐定堿對白色念珠菌BF形成的抑制作用，通過檢測槐定堿對白色念珠菌的MIC值、形態(tài)特征、胞外蛋白酶、磷脂酶活性以及胞外DNA的影響，探討槐定堿對白色念珠菌BF形成的影響，為研發(fā)抑制白色念珠菌藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：白色念珠菌（Candida albicans）ATCC64550，購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

藥品：槐定堿，純度：99.4%，CAS號：6882-68-4；兩性霉素B，純度：USP級，750 mg/g，CAS號：1397-89-3；蛋白酶K，純度：30 U/mg，CAS號：39450-01-6；以上藥品均購自中國上海源葉生物科技有限公司。

培養(yǎng)基：沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA），4%葡萄糖，1%蛋白胨，2%瓊脂粉；沙氏液體培養(yǎng)基（SDB），4%葡萄糖，1%蛋白胨；牛奶培養(yǎng)基，10%脫脂奶粉，1%瓊脂。

主要試劑：氯仿、丙酮、無水乙醇等有機(jī)試劑均為分析純，購自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；Lyticase溶壁酶，購自美國Sigma試劑公司。

儀器：萬分之一電子分析天平（ML204/02，奧豪斯儀器有限公司）；紫外分光光度計（Evolution 201，賽默飛世爾科技公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Chem-Doc XRS+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；光學(xué)顯微鏡（BH-2，奧林巴斯有限公司）；掃描電子顯微鏡（Apreo S，賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 微量稀釋法檢測槐定堿最小抑菌濃度

最小抑菌濃度（MIC）板制備：參照WAYNE P［23］研究方法并稍作改進(jìn)，將濃度為1×108CFU/mL的白色念珠菌菌液重新懸浮并稀釋至1×106CFU/mL。先在96孔板A1～C8孔中加入100 μL的SDB培養(yǎng)基，再吸取100 μL濃度為512 mg/mL的槐定堿溶液加入A1～C1孔中，與100 μL的SDB培養(yǎng)基混勻，分別吸取100 μL混勻后的溶液加入到A2～C2孔中再混勻，依次類推，最后棄去A8～C8孔中的100 μL混合溶液，得到不同濃度（256 mg/mL、128 mg/mL、64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL）的槐定堿溶液［24］，將100 μL濃度為 1×106CFU/mL的菌液加入到已經(jīng)混合好的槐定堿溶液所在的96孔板中，使得槐定堿溶液再次被稀釋，終濃度為128 mg/mL、64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL。另外將A10～C10孔設(shè)置為陰性對照組（SDB培養(yǎng)液 100 μL+菌液100 μL）、A12～C12孔設(shè)置為空白對照組（SDB培養(yǎng)液200 μL）。按照同樣的方法用兩性霉素B做陽性對照組，由于兩性霉素B抑菌效果顯著，因此設(shè)置其終濃度分別為64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL。上述試驗每個濃度均設(shè)3次重復(fù)。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。

MIC值判定：孔內(nèi)完全抑制菌株生長的最低藥物濃度為MIC值，且僅當(dāng)空白對照組內(nèi)菌株沒有生長以及陰性對照組內(nèi)菌株正常生長時，數(shù)據(jù)有效。

1.2.2 光學(xué)顯微鏡下觀察槐定堿對白色念珠菌BF的抑制作用

采用細(xì)胞爬片法［25］觀察白色念珠菌BF結(jié)構(gòu)?；倍▔A終濃度分別為16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL，另外做兩組陰性對照，并在6孔板孔底放置無菌蓋玻片。37℃靜置培養(yǎng)72 h后取出蓋玻片，蒸餾水沖洗3次去除浮游細(xì)胞，置于光學(xué)顯微鏡下觀察白色念珠菌BF結(jié)構(gòu)。

1.2.3 掃描電子顯微鏡下觀察槐定堿對白色念珠菌BF的抑制作用

前期處理及槐定堿終濃度參照1.2.2，24 h后取出6孔板，在無菌PBS緩沖溶液中清洗3次。用0.1 mol/L二甲基乙酸鈉緩沖液（pH 7.3）配制2.5%戊二醛溶液后，于4℃條件下固定6孔板中的蓋玻片12 h，經(jīng)無菌PBS緩沖溶液漂洗3次后依次使用30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水15 min，隨即對樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥、噴金，使用掃描電子顯微鏡觀察白色念珠菌［26］。

1.2.4 不同時期槐定堿對白色念珠菌BF形成的抑制率檢測

采用微量稀釋法檢測不同時期槐定堿對白色念珠菌BF形成的抑制率。將100 μL菌液（1×106CFU/mL）加入96孔板中，37℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)白色念珠菌BF培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 時，在孔板的第1～4行分別加入100 μL濃度為64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL的槐定堿溶液，使得槐定堿終濃度為32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL，第5列也在同樣的時間點(diǎn)加入100 μL的SDB培養(yǎng)基作為陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔設(shè)置3次重復(fù)。用酶標(biāo)儀在490 nm下檢測各孔的OD值，根據(jù)公式利用GraphPad Prism 7.0軟件計算BF抑制率，BF抑制率=（1-OD處理組/OD陰性對照組）×100%。

1.2.5 槐定堿對白色念珠菌胞外蛋白酶的影響

采用牛乳平板法［25］測定胞外蛋白酶活性。用無菌打孔器在凝固的牛奶培養(yǎng)基上打出6個小孔，按1.2.1的微量稀釋法收集濃度為16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的槐定堿處理過的菌液以及陰性對照組的菌液，離心得到上清；將離心后的上清、蛋白酶K（20 μg/mL）、無菌PBS緩沖溶液各20 μL加入孔中，蛋白酶K（20 μg/mL）、無菌PBS緩沖溶液分別作為陽性對照組和空白對照組，于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6 h。用游標(biāo)卡尺測量孔周圍因蛋白質(zhì)降解形成的透明水解圈直徑。

1.2.6 槐定堿對白色念珠菌磷脂酶的影響

采用卵黃平板法［27］測定磷脂酶活性。在96孔板A1～C12孔中加入 100 μL SDB 培養(yǎng)基，分別在 A1～A3、A4～A6、A7～A9孔加入 100 μL 64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL的槐定堿溶液，隨后將其按列依次稀釋，棄去C1～C9孔的100 μL混合溶液，最后在96孔板A1～C12孔中加入100 μL菌液（1×106CFU/mL）與槐定堿溶液混合，使槐定堿終濃度分別為16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL，A10～C12孔為陰性對照組，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。用微量移液器分別取10由16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL槐定堿溶液處理后的菌液滴在蛋黃瓊脂培養(yǎng)基中間，使形狀呈圓形。將蛋黃瓊脂培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，若白色念珠菌分泌胞外磷脂酶，則菌落周圍會出現(xiàn)一圈白色沉淀。使用游標(biāo)卡尺測量各組的白色念珠菌菌落直徑和白色沉淀圈直徑，并計算菌落直徑和沉淀圈直徑的比值［28-29］，即沉淀圈值（precipitation zone，PZ）。

1.2.7 槐定堿對白色念珠菌胞外DNA的影響

采用SDS法［25］提取白色念珠菌基因組總DNA含量。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果分析

2.1 槐定堿對白色念珠菌MIC值的測定結(jié)果

如圖1a所示，從右至左依次觀察可知，陰性對照組的白色念珠菌生長狀況良好，而空白對照組的SDB培養(yǎng)基內(nèi)無白色念珠菌的生長。在濃度為8～128 mg/mL的槐定堿作用下，白色念珠菌幾乎不能生長。在1～4 mg/mL的槐定堿作用下，白色念珠菌可以正常生長。如圖1b所示，從右至左依次觀察可知，兩性霉素B的濃度為2～64 μg/mL時未見白色念珠菌生長，而兩性霉素B濃度為0.5～1 μg/mL時有白色念珠菌生長。因此，判定槐定堿對白色念珠菌的MIC值為8 mg/mL。

圖1 不同濃度槐定堿對白色念珠菌MIC值的測定

2.2 光學(xué)顯微鏡下觀察槐定堿對白色念珠菌BF生長的影響

通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，陰性對照組可見大量兩相細(xì)胞（即酵母相細(xì)胞和菌絲相細(xì)胞)共存，兩相細(xì)胞彼此依附，相互粘連，形成了大片結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、彼此交錯的網(wǎng)格區(qū)域，并且存在濃度依賴關(guān)系（圖2a）。當(dāng)槐定堿濃度為4 mg/mL時，在光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞類型主要為酵母相細(xì)胞及少量短小的菌絲相細(xì)胞，短小的菌絲相細(xì)胞彼此粘連，形成較小的芽管結(jié)構(gòu)（圖2b）。當(dāng)槐定堿濃度為8 mg/mL時，在光學(xué)顯微鏡下觀察到少數(shù)粘連的酵母相細(xì)胞，未見菌絲相細(xì)胞，酵母相細(xì)胞彼此粘連（圖2c）。當(dāng)槐定堿濃度為16 mg/mL時，在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有少量的酵母相細(xì)胞存在，粘連情況發(fā)生較少，槐定堿對白色念珠菌BF的影響明顯（圖2d）。

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察槐定堿對白色念珠菌BF生長的影響

2.3 掃描電子顯微鏡下觀察槐定堿對白色念珠菌BF生長的影響

由掃描電子顯微鏡結(jié)果觀察可知，陰性對照組（圖3a，圖3e）可見白色念珠菌形成明顯的BF，兩相細(xì)胞同時存在；與陰性對照相比，槐定堿的濃度為4 mg/mL時，仍存在BF，可觀察到兩相細(xì)胞，酵母相細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凹陷（圖3b，圖3f）；當(dāng)槐定堿濃度為8 mg/mL時，有BF形成情況，細(xì)胞也發(fā)生凹陷（圖3c，圖3g）；當(dāng)槐定堿濃度為16 mg/mL時，白色念珠菌難以發(fā)現(xiàn)BF，細(xì)胞發(fā)生明顯凹陷（圖3d，圖3h）；因此，推測槐定堿對白色念珠菌BF的形成具有一定的抑制作用。

圖3 掃描電子顯微鏡下觀察槐定堿對白色念珠菌BF生長的影響

2.4 不同時期槐定堿對白色念珠菌BF形成的抑制率

如表1所示，在白色念珠菌BF形成的初期（0～4 h），濃度≥8 mg/mL的槐定堿對白色念珠菌BF的生長均有明顯的抑制作用，抑制率均在80%以上。在BF生長最快的時期（4～12 h）內(nèi)，濃度≥16 mg/mL的槐定堿能干預(yù)白色念珠菌BF的形成。在BF趨于成熟時（12 h）再加入槐定堿處理，發(fā)現(xiàn)僅有高濃度（≥16 mg/mL）槐定堿具有抑制作用，而低濃度（≤8 mg/mL）槐定堿無明顯抑制作用。

表1 不同時期槐定堿對白色念珠菌BF形成的抑制率

2.5 槐定堿對白色念珠菌胞外蛋白活性的影響

2.5.1 槐定堿對白色念珠菌胞外蛋白酶活性的影響

牛乳平板法試驗結(jié)果表明（圖4），白色念珠菌分別與濃度為16 mg/mL、8 mg/mL及4 mg/mL槐定堿溶液共同培養(yǎng)后的上清液于牛奶培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后未見透明水解圈，相同條件下的陰性對照組也未見透明水解圈，而陽性對照組（蛋白酶K）具明顯透明水解圈，可推斷槐定堿對于白色念珠菌的胞外蛋白酶活性沒有影響。

圖4 不同濃度槐定堿溶液對白色念珠菌胞外蛋白酶活性的影響

2.5.2 槐定堿對白色念珠菌磷脂酶活性的影響

參照1.2.6槐定堿對白色念珠菌磷脂酶活性的影響所述，白色念珠菌磷脂酶活性與PZ值的關(guān)系由圖5a～5d分析可知槐定堿對白色念珠菌磷脂酶活性具有抑制作用，其濃度為16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL時，抑制磷脂酶活性作用明顯，PZ值分別為1、0.98±0.01和0.74±0.02，而陰性對照組PZ值為0.73±0.01，說明磷脂酶活性隨著槐定堿濃度的增加而降低，并呈一定的濃度依賴關(guān)系。

圖5 不同濃度槐定堿溶液對白色念珠菌胞外蛋白的影響

2.6 槐定堿對白色念珠菌胞外DNA活性的影響

根據(jù)白色念珠菌總DNA瓊脂糖電泳圖結(jié)果顯示（圖6），終濃度為32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL對應(yīng)泳道內(nèi)的DNA并未被降解，因此判定濃度為32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL的槐定堿溶液對白色念珠菌胞外DNA沒有作用。

圖6 不同濃度槐定堿溶液對白色念珠菌胞外DNA的影響

3 討論

生物堿是一種具有較強(qiáng)生物活性的堿性含氮化合物，是許多藥用植物的藥理活性成分［30］。OZCELIK B等［31］研究發(fā)現(xiàn)長春堿和葫蘆巴堿對白色念珠菌的MIC值分別為4 μg/mL和8 μg/mL，均低于其他生物堿。天仙藤中roemerine對白色念珠菌只有微弱的抑制作用［32］，但是能顯著抑制其形態(tài)轉(zhuǎn)變和BF形成，且呈濃度依賴關(guān)系［33］。SHAO J等［18］從苦參中提取的苦參堿能抑制白色念珠菌的BF表型以及菌絲形成。袁琳琳［25］報道白色念珠菌的不同生長階段、表面疏水性、BF胞外基質(zhì)和毒力基因均可影響白色念珠菌BF的形成，但槐定堿并不通過抑制白色念珠菌胞外蛋白的活性和降解白色念珠菌胞外DNA的方式來抑制其BF形成。利用qRT-PCR技術(shù)對白色念珠菌相關(guān)基因的研究表明［34-36］，可通過下調(diào)白色念珠菌hwp1、als3、efg1等相關(guān)毒力基因的表達(dá)來抑制白色念珠菌BF的形成。

本試驗結(jié)合槐定堿對白色念珠菌MIC值測定以及16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL槐定堿對白色念珠菌BF作用后的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)槐定堿濃度≥8 mg/mL時，白色念珠菌的生長受到抑制，形成BF的能力有明顯的下降，說明槐定堿對白色念珠菌的生長有顯著抑制作用。通過卵黃平板法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)槐定堿濃度≥8 mg/mL時可通過抑制白色念珠菌磷脂酶活性來減弱白色念珠菌的毒力影響，這個結(jié)果與高明［28］所研究的鈣通道阻滯劑與氟康唑聯(lián)用抗白色念珠菌的毒力因子作用結(jié)果類似。而在槐定堿濃度為16 mg/mL時的平皿中未見到單菌落，因此判斷該濃度下白色念珠菌的磷脂酶無活性。而槐定堿濃度為8 mg/mL、4 mg/mL時，磷脂酶活性依次增強(qiáng)，說明槐定堿濃度越高，其抑制白色念珠菌磷脂酶活性越明顯，并呈濃度依賴關(guān)系。

白色念珠菌作為人體常見的機(jī)會性致病真菌，其BF為其粘附在生物與非生物物質(zhì)表面提供了幫助，白色念珠菌的粘附能力與其本身的毒力是呈正相關(guān)性的。通過MIC值的測定、形態(tài)學(xué)觀察以及對白色念珠菌胞外蛋白和胞外DNA等研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)槐定堿濃度≥8 mg/mL時，白色念珠菌的生長受到抑制，說明槐定堿可通過抑制白色念珠菌生物量來抑制其BF的形成，使其黏附能力下降，從而導(dǎo)致毒力減弱。本試驗為設(shè)計和治療白色念珠菌感染的相關(guān)藥劑提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，槐定堿對白色念珠菌MIC值為8 mg/mL；通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)槐定堿濃度增加會使白色念珠菌的數(shù)量減少及其形成BF能力下降；通過掃描電子顯微鏡觀察到濃度為4 mg/mL的槐定堿會使白色念珠菌表面形成凹陷；在測定不同時期槐定堿對白色念珠菌BF形成的抑制率時發(fā)現(xiàn)16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的槐定堿溶液對白色念珠菌BF的黏附期和生長期具有明顯的抑制作用，而進(jìn)入成熟期后抑制作用減弱，且只有在濃度為16 mg/mL時有抑制作用，說明槐定堿對白色念珠菌BF形成有一定的影響；此外，濃度為16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的槐定堿溶液對白色念珠菌胞外DNA和胞外蛋白酶無影響，當(dāng)槐定堿濃度≥8 mg/mL時對磷脂酶活性有明顯抑制作用，并呈一定的濃度依賴關(guān)系。