鄭敏玲 羅海敏 馮俊慧 張彩云 林穎 李文均 屈平華

1廣東省婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣州 511442；2廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510006；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；4廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院皮膚科，廣州 510006；5中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）通常被認(rèn)為是一種全身性的系統(tǒng)性疾病，常合并過(guò)敏性鼻炎和哮喘等其他特應(yīng)性疾?。?］。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展與遺傳、環(huán)境和免疫等多種因素相關(guān)；而在臨床表現(xiàn)上，AD以反復(fù)發(fā)作的慢性濕疹樣皮疹及顯著的皮膚干燥和瘙癢為主要特征，部分患者瘙癢劇烈且病程綿長(zhǎng)，嚴(yán)重影響其身心健康［2］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，AD的患病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)［3］；而在中國(guó)，近10年AD患病率的增長(zhǎng)非常迅速，部分城市嬰兒AD患病率可達(dá)30.48%［4-5］。

近年來(lái)，人們通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，獲得了大量微生物與疾病和健康相關(guān)聯(lián)的信息［6］。研究發(fā)現(xiàn)，人體皮膚是一個(gè)特殊的生態(tài)系統(tǒng)，表現(xiàn)為酸性、干燥、高鹽和富含不利于大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的特殊脂質(zhì)成分。盡管環(huán)境條件惡劣，但人體皮膚表面還是存在一定數(shù)量的微生物，且在一定條件下以“菌株”的水平保持穩(wěn)定［7］。在正常條件下，人體皮膚表面微生物可與人體宿主形成穩(wěn)定的互利關(guān)系。而皮膚微生態(tài)失衡，將驅(qū)動(dòng)皮膚表面的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并與皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。因此，人體表面的皮膚菌群種類和結(jié)構(gòu)，也可以作為人體皮膚健康和皮膚疾病狀態(tài)的重要指標(biāo)。目前，有文獻(xiàn)建立了基于25個(gè)菌屬的皮膚健康微生物指數(shù)，其可以識(shí)別兒童AD的皮膚易感狀態(tài)，以及兒童AD的療效評(píng)價(jià)指導(dǎo)［9］。然而，盡管皮膚微生物群在維護(hù)皮膚健康和AD疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，但在目前，針對(duì)人體皮膚菌群的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法，還缺乏系統(tǒng)性的指導(dǎo)文件。本研究擬以AD好發(fā)的肘窩部皮膚為研究對(duì)象，以健康皮膚為對(duì)照，初步探索人體皮膚菌群的培養(yǎng)方法，并結(jié)合臨床資料，探討微生物定量培養(yǎng)在皮膚健康評(píng)價(jià)和輔助AD臨床診斷的應(yīng)用價(jià)值，從而為AD診斷和治療提供微生物學(xué)依據(jù)。

資料與方法

1、一般資料

納入2019年9月至2020年3月就診于廣東省中醫(yī)院皮膚科的AD患者34例，其中男性21例，女性13例，年齡（14.43±8.03）歲；健康志愿者26例，其中男性12例，女性14例，年齡（29.38±7.47）歲。根據(jù)前瞻性試驗(yàn)性研究方案原則，隨機(jī)選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)本的研究對(duì)象。

健康對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：沒有合并其他皮膚疾病或有明確感染指征的患者；沒有接受全身免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素治療的患者（包括系統(tǒng)及局部用藥）；沒有其他心肺基礎(chǔ)疾病的患者。

AD組的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)。⑴納入標(biāo)準(zhǔn)：符合Williams標(biāo)準(zhǔn)［10］，且近1個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素、抗真菌及糖皮質(zhì)激素藥物應(yīng)用史，1周內(nèi)未進(jìn)行任何局部治療（除了潤(rùn)膚劑）。⑵排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他皮膚疾病或有明確感染指征的患者；接受全身免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素治療的患者（包括系統(tǒng)及局部用藥）；有其他心肺基礎(chǔ)疾病的患者。

AD嚴(yán)重程度的評(píng)估：采用三項(xiàng)嚴(yán)重程度評(píng)分（Three-Item Severity Score，TISS）標(biāo)準(zhǔn)，基于紅斑、水腫和剝脫，每個(gè)評(píng)分從0到3分；總和為0分，無(wú)濕疹；1～2分，輕度；＞2～4分，中度；＞4～6分，重度；＞6，極重度［11］。

本項(xiàng)研究已經(jīng)得到廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)為BE2019-165-01。所有研究對(duì)象或其親屬已知情并簽署知情同意書。

2、肘窩部皮膚菌群分離條件的初步探索

無(wú)菌采樣拭子施加穩(wěn)定壓力擦拭受試者肘窩部4 cm×4 cm的固定面積皮膚，在采樣點(diǎn)來(lái)回約100次（約2 min），然后置于2 ml無(wú)菌生理鹽水中。將原液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8等梯度，再吸取100 μl樣本分別涂布于血平板、巧克力平板、BCYEα和R2A平板，放置32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～7 d，初步估算其細(xì)菌數(shù)量和最適應(yīng)用于菌落計(jì)數(shù)的稀釋度。

在適宜菌落計(jì)數(shù)的樣品稀釋度下，分別置于：⑴8、10、20、28、32、35、37、40℃的溫度環(huán)境；⑵pH為4、5、6、7、8、9、10的酸堿度環(huán)境；⑶0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、9.0%、10.0%NaCl（w/v）的濃度環(huán)境；⑷普通大氣環(huán)境、5%CO2袋和厭氧袋的氣體環(huán)境。比較上述狀態(tài)下細(xì)菌生長(zhǎng)的數(shù)量和種類，以探索皮膚細(xì)菌培養(yǎng)的最適稀釋度、最適生長(zhǎng)溫度、最適pH值、最適鹽濃度和最適氣體需求。

3、肘窩部皮膚細(xì)菌培養(yǎng)和定量計(jì)數(shù)

3.1、樣品采集 采用上述采集方法進(jìn)行采集，并在2 h內(nèi)進(jìn)行樣本處理并接種相應(yīng)培養(yǎng)基。

3.2、定量培養(yǎng)的皮膚菌群的分離培養(yǎng) 參考上述探索的皮膚菌群分離培養(yǎng)條件，取10 μl來(lái)源于AD組樣本和50 μl源于健康對(duì)照組樣本分別涂布于血平板，32℃、5%CO2培養(yǎng)2～7 d。

3.3、菌種鑒定和菌落計(jì)數(shù) 選取平板上一定面積區(qū)域的全部菌株，優(yōu)先采用Vitek MS鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，具體操作參考文獻(xiàn)［12］，然后統(tǒng)計(jì)一定面積區(qū)域每類細(xì)菌的總數(shù)，按照比例計(jì)算出單位面積全部細(xì)菌的分布密度和金黃色葡萄球菌的分布密度。而對(duì)于Vitek MS不能鑒定的菌株，采用裂解法來(lái)提取待測(cè)菌株的DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的純度和濃度；使用16S rDNA通用引物27F（5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3）、1492R（5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）對(duì)細(xì)菌進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，并將測(cè)序序列遞交上傳至NCBI BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)分析［13］。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0對(duì)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M（P25，P75）表示；組間差異比較，若服從正態(tài)分布且方差齊，則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，若不符合，則采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中定義P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果與分析

1、受試者肘窩部局部皮膚性狀

本次研究共納入成人AD患者34例，其中男性21例，女性13例；健康體檢者26例，其中男性12例，女性14例。通過(guò)初步皮膚性狀分析發(fā)現(xiàn)，健康成人皮膚普遍表現(xiàn)光滑、濕潤(rùn)和有彈性；而AD患者患部皮膚主要表現(xiàn)為干燥、色澤暗淡和有破損，其發(fā)病的好發(fā)部位主要為四肢、肘窩、腘窩、面頰頸部和腹部，以肘窩部為主，部分有糜爛滲出和抓后滲液現(xiàn)象。按嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，34例AD患者，包括無(wú)濕疹10例、輕度10例、中度9例、重度5例、極重度0例。

2、人體肘窩部皮膚細(xì)菌的分離培養(yǎng)條件探索結(jié)果

本研究選取8名健康人和8例AD患者進(jìn)行了肘窩部皮膚細(xì)菌的分離培養(yǎng)條件探索。從培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，人體肘窩部皮膚細(xì)菌普遍在有氧環(huán)境條件生長(zhǎng)良好，其分離培養(yǎng)的適宜生長(zhǎng)溫度是28～32℃，適宜pH值為6～8，適宜鹽濃度為0.5%～5.0%。在pH＜6和pH＞8的條件，各種可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量明顯降低；而在35℃和5.0%以上鹽濃度的培養(yǎng)條件下，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量也明顯降低，且一些革蘭陰性桿菌無(wú)法生長(zhǎng)。

在培養(yǎng)基的選擇上，寡營(yíng)養(yǎng)的R2A和BCYEα培養(yǎng)基相對(duì)于營(yíng)養(yǎng)豐富的血平板和巧克力平板，更有利于革蘭陰性桿菌的檢出；但血平板和巧克力平板，能檢出的細(xì)菌種數(shù)和數(shù)量，相對(duì)于R2A和BCYEα培養(yǎng)基多；且巧克力平板相對(duì)于血平板，更有利于嗜血桿菌的檢出。

在細(xì)菌數(shù)量上，在不同的個(gè)體之間，尤其是一些健康志愿者和AD患者之間，其細(xì)菌數(shù)量差異巨大；健康人肘窩部皮膚菌落計(jì)數(shù)多為10～1000 cfu/cm2，而某些AD患者金黃色葡萄球菌數(shù)量＞105cfu/cm2，需要稀釋到1000甚至更高倍數(shù)才能進(jìn)行準(zhǔn)確的菌落計(jì)數(shù)；見圖1。

3、肘窩部皮膚的細(xì)菌培養(yǎng)和定量計(jì)數(shù)比較

3.1、肘窩部皮膚在屬水平的培養(yǎng)結(jié)果比較 本研究在34例AD患者和26例健康成人中，經(jīng)Vitek MS鑒定儀和16S rRNA基因測(cè)序鑒定，共分離到20多個(gè)菌屬，包括葡萄球菌屬（Staphylococcus）、莫拉菌屬（Moraxella）、庫(kù)克菌屬（Kocuria）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、梭菌屬（Clostridium）、微球菌屬（Micrococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、念珠菌屬（Candida）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、皮膚桿菌屬（Cutibacterium）、皮桿菌屬（Dermabacter）、副球菌屬（Paracoccus）、玫瑰單胞菌屬（Roseomonas）、奇異球菌屬（Deinococcus）、短桿菌屬（Brevibacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、微桿菌屬（Microbacterium）、甲基桿菌（Methylobacterium）、冢村菌屬（Tsukamurella）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、甲基紅桿菌（Methylorubrum）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、鞘脂菌屬（Sandaracinobacter）、施萊格爾菌屬（Schlegelella）、葉桿菌屬（Phyllobacterium）等。

26例健康志愿者皮膚菌群相對(duì)于AD患者的物種多樣性更為豐富，以上20多個(gè)菌屬均有檢出，其中葡萄球菌屬是健康對(duì)照組肘窩部最常見的菌屬，檢出率為100.0%；其次為微球菌屬、莫拉菌屬、玫瑰單胞菌屬和考克菌屬，其在健康對(duì)照組的肘窩部皮膚中檢出率分別為34.6%、30.8%、26.9%和23.1%。

34例AD患者肘部共分離到7個(gè)菌屬，其中以葡萄球菌屬最常見，AD皮損組的檢出率為95.8%，而AD非皮損組的檢出率為33.3%；微球菌屬、考克菌屬、念菌菌屬、芽孢桿菌屬和短桿菌屬檢出率分別為11.8%、5.8%、2.9%、2.9%和2.9%。

3.2、肘窩部皮膚在種水平的培養(yǎng)結(jié)果比較 從檢出的菌種種類的多樣性來(lái)看，不同健康者肘窩部皮膚的菌種種類完全不同，部分健康者的肘窩部皮膚表現(xiàn)為菌群種類單一的人葡萄球菌，而某一健康者的肘窩部皮膚檢出23個(gè)已知菌種和9個(gè)未能確切鑒定的潛在新種。

人葡萄球菌是健康人體中最常見的定植菌種，其檢出率為92.3%；其次為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、頭葡萄球菌（Staphylococcus capitis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、粘 液 玫 瑰 單 胞 菌（Roseomonas mucosa）和奧斯陸莫拉菌（Moraxella osloensis），其在健康對(duì)照組肘窩部皮膚中檢出率分別為69.2%、34.6%、30.8%、30.8%、26.9%和23.1%。

金黃色葡萄球菌是AD患者肘窩部皮膚中最常見的定植菌種，AD皮損組的檢出率為95.8%，而AD非皮損組的檢出率為30.0%；其次為表皮葡萄球菌，AD皮損組的檢出率為25.0%，而AD非皮損組的檢出率為50.0%；對(duì)于整個(gè)AD組，藤黃微球菌的檢出率為11.1%。此外，還有分離到頭葡萄球菌、溶血葡萄球菌、嗜根考克菌、人葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌、干酪短桿菌和白色念珠菌等，但檢出率均低于10.0%。

3.3、AD患者和健康志愿者肘窩部皮膚菌群定量細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果的比較 對(duì)AD患者和健康志愿者肘窩部皮膚菌群定量細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照組肘窩部皮膚菌群微生物菌落計(jì)數(shù)普遍在40.00～50000.00 cfu/cm2（中位數(shù)為325.45 cfu/cm2），而AD皮損組患者微生物菌落計(jì)數(shù)普遍在112.60～125000.00 cfu/cm2之間（中位數(shù)為1346.88 cfu/cm2），AD非皮損組患者微生物菌落計(jì)數(shù)普遍在50.00～6250.00 cfu/cm2之間（中位數(shù)為125.00 cfu/cm2），這3組的微生物計(jì)數(shù)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=15.54，P＜0.05）；成對(duì)比較顯示，AD皮損組微生物菌落數(shù)明顯高于AD非皮損組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=24.25，P＜0.05）；AD皮損組微生物菌落數(shù)也明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=13.41，P＜0.05），但是AD非皮損組微生物菌落計(jì)數(shù)與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=-10.84，P＞0.05）（表1）。而在微生物種類上，這3組檢出的金黃色葡萄球菌的分布密度總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=13.136，P＜0.05）；成對(duì)比較顯示，AD皮損組皮膚中金黃色葡萄球菌的檢出和數(shù)量均顯著高于AD非皮損組和健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=12.03，P＜0.05；H=16.28，P＜0.05），AD非皮損組和健康對(duì)照組檢出的金黃色葡萄球菌的分布密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 AD皮損組、AD非皮損組與健康對(duì)照組金黃色葡萄球菌分布密度的比較[cfu/cm2,M（P25，P75）]

根據(jù)Spearman相關(guān)性，分析，皮損患者中檢出的金黃色葡萄球菌的分布密度與AD的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)（r=0.411，P=0.046），見圖2。

圖2 皮損患者中金黃色葡萄球菌比例與AD的嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

討論

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)日益成為人體微生態(tài)研究的重要手段。然而，由于人體皮膚的生態(tài)環(huán)境較為特殊，其正常狀態(tài)下單位面積的皮膚微生物總量普遍較低，故常規(guī)皮膚采樣方法難以達(dá)到宏基因組測(cè)序的DNA樣本濃度要求，從而限制了16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)和宏基因組測(cè)序技術(shù)在皮膚微生態(tài)研究中的應(yīng)用［14］。因此，分離培養(yǎng)技術(shù)仍然是當(dāng)前皮膚微生態(tài)的重要手段，并且該技術(shù)還是探索關(guān)鍵微生物在疾病中作用和致病機(jī)理的重要前提。

近年來(lái)，隨著高通量快速鑒定技術(shù)的發(fā)展，尤其是MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)和在臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用，為對(duì)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的所有菌落進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)提供了可能，也同時(shí)為人體皮膚微生態(tài)研究提供新的思路和方法。目前，有一項(xiàng)前瞻性研究，從17名健康志愿者的干燥部位（前臂）、濕潤(rùn)部位（肘窩）和皮脂部位（前額）采集皮膚樣本，采用14種培養(yǎng)條件，并最終分離到800多種微生物（其中包括30余個(gè)細(xì)菌屬和14個(gè)真菌屬），從而為皮膚細(xì)菌的培養(yǎng)組學(xué)方法建立奠定了基礎(chǔ)［15］。本文在該文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，以健康志愿者皮膚為對(duì)照，對(duì)AD好發(fā)的肘窩部皮膚進(jìn)行了培養(yǎng)組學(xué)的嘗試。從研究結(jié)果來(lái)看，人體肘窩部皮膚菌群培養(yǎng)的最適宜生長(zhǎng)溫度為28～32℃，最適pH值為6～7，最適鹽濃度范圍為0.5%～5.0%，其中以血平板和巧克力平板檢出細(xì)菌種類和數(shù)量最多；并且，采用單一血平板，即從26例健康志愿者的肘窩部皮膚中培養(yǎng)出20多個(gè)菌屬，且血平板會(huì)比巧克力平板更利于觀察菌落形態(tài)，例如溶血環(huán)等特征，從而大大簡(jiǎn)化了流程，并提高了分離效率。

本研究初步探索了人體肘窩部皮膚菌群的培養(yǎng)條件，并基于此，初步建立起了人體肘窩部皮膚菌群培養(yǎng)方法，且分離出此部位絕大部分的優(yōu)勢(shì)菌種，這與采用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序的結(jié)果一致［16］，即以葡萄球菌屬為主，而AD患者主要以金黃色葡萄菌為主，健康人群以凝固酶陰性葡萄球菌為主，例如人葡萄球菌、表皮葡萄球菌等，且比對(duì)AD組和健康對(duì)照組皮膚菌群的培養(yǎng)結(jié)果，在葡萄球菌屬方面，呈現(xiàn)出此消彼長(zhǎng)的現(xiàn)象。此外本研究基于培養(yǎng)獲得AD好發(fā)部位的微生物學(xué)特征與文獻(xiàn)基于宏基因組獲得與AD具有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)的皮膚B型具有較好的一致性，即是痤瘡皮膚桿菌、皮生球菌屬和甲基桿菌屬減少，葡萄球菌屬（如表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、金黃色葡萄球菌）的豐度增加［17］。另外，我們同時(shí)還對(duì)健康對(duì)照組、AD皮損患者和AD非皮損患者的肘窩部皮膚進(jìn)行定量細(xì)菌培養(yǎng)分析，研究表明皮損患者中檢出的金黃色葡萄球菌的占比與AD的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)，這也與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致［18］。這也為后續(xù)的個(gè)性化治療提供了微生物學(xué)依據(jù)。

總之，AD是一種與皮膚菌群失調(diào)密切相關(guān)的慢性復(fù)發(fā)性和難治性的皮膚疾病，而金黃色葡萄球菌可作為AD嚴(yán)重程度和療效觀察的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。本研究中初步建立的AD肘窩部皮膚菌群的定量微生物培養(yǎng)方法，操作簡(jiǎn)單、方便快捷，可快速獲得AD患者肘窩部皮膚菌群的關(guān)鍵微生物分布信息，并用于患者皮膚損傷的嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)，能夠?yàn)锳D的臨床治療和療效評(píng)價(jià)提供判斷依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突