張靜

天津市第四中心醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300140

臨床上多種疾病都可引起腸道的缺血再灌注損傷，例如嚴(yán)重的感染、外傷等，而腸道做為應(yīng)激的中心器官，其損傷可導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)的釋放，這些炎癥介質(zhì)作用于局部或全身，嚴(yán)重時導(dǎo)致全身各臟器功能衰竭［1］，因此如何減輕腸道的缺血再灌注損傷，成為臨床工作的熱點(diǎn)問題。黃芪是廣為人知的一種健脾益氣類中藥，黃芪甲苷為黃芪的單體皂苷類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎［2］、抗氧化［3］、減壓等作用，也有研究發(fā)現(xiàn)其可以維持胃黏膜組織完整［4］，對胃黏膜屏障功能起到保護(hù)作用。

本文通過在大鼠腸道組織缺血再灌注損傷前給予黃芪甲苷，觀察黃芪甲苷在腸道缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用，并探討其發(fā)揮這一作用的機(jī)制。

材料與方法

1、材料

美國R&D Systems公司的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒［二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸］，武漢博士德生物工程公司的兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體，成都地奧九泓制藥廠的黃芪甲苷。

2、方法

2.1、動物分組及模型制作2017年1月至6月選取健康Wistar雄性大鼠45只，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量180～200 g，分為3組：假手術(shù)組（A組）、缺血再灌注組（B組）及黃芪甲苷組（C組），每組15只。術(shù)前大鼠可自由飲水，禁食12 h。以水合氯醛麻醉大鼠，于腹正中線剖開腹腔，分離出腸系膜前動脈（SAM），夾閉動脈起始部45 min后松開血管夾，于再灌注24 h后處死大鼠并進(jìn)行取材。A組僅行剖腹術(shù)，B組夾閉SAM不予黃芪甲苷處理，C組夾閉SAM前10 min腹腔注射黃芪甲苷6.0 ml·kg-1。

2.2、標(biāo)本采集及檢測手段 各組大鼠缺血再灌注24 h后予以處死，于門靜脈取血，離心后取血清，將血清保存于-80℃冰箱。小腸組織沖洗干凈后部分浸泡于甲醛中固定，部分保存于-80℃冰箱中。各檢測手段：（1）依據(jù)ELISA說明書檢測血清D-乳酸和DAO水平。（2）取保存于甲醛中的腸道組織制備石蠟包塊，切片、烤片、HE染色，觀察腸道組織形態(tài)學(xué)變化。（3）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測腸道組織VEGF蛋白表達(dá)量：將留存的腸道組織勻漿后提取總蛋白，將蛋白電泳后行轉(zhuǎn)膜、封閉，滴加一抗，孵育，滴加二抗，孵育，洗膜后顯影。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)處理均由SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1、各組大鼠一般狀態(tài)

3組大鼠存活率均為100%，B組大鼠進(jìn)食水情況不良，皮毛光澤度差，毛發(fā)蓬亂，A、C兩組大鼠一般情況尚可，大體無明顯差異。

2、病理改變

光鏡下可以看出B組小腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，破壞嚴(yán)重，腸道間質(zhì)充血并可見較多炎細(xì)胞浸潤（圖1B）。A組小腸絨毛完整，排列整齊，未見明顯炎癥細(xì)胞及充血壞死（圖1A）。C組小腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞程度介于A、B兩組之間（圖1C）。

圖1 3組大鼠小腸病理改變（HE染色 ×200）。A為假手術(shù)組；B為缺血再灌注組；C為黃芪甲苷組

3、ELISA法檢測各組大鼠血清中D-乳酸、DAO水平

B、C兩組血清D-乳酸和DAO水平均高于A組，表明腸道缺血再灌注破壞了腸黏膜屏障的通透性，C組中兩者水平低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。提示：黃芪甲苷可以減輕腸道缺血再灌注對腸黏膜屏障完整性的損傷。見表1。

表1 3組大鼠血清D-乳酸和DAO的水平（±s）

表1 3組大鼠血清D-乳酸和DAO的水平（±s）

注：A組僅行剖腹術(shù)，B組夾閉SAM不予黃芪甲苷處理，C組夾閉SAM前10 min腹腔注射黃芪甲苷6.0 ml·kg-1；DAO為二胺氧化酶，SAM為腸系膜前動脈；與A、B組相比，aP＜0.05

組別A組B組C組n 1515 15 D-乳酸（μg/ml）1.24±0.087.41±1.075.78±0.48a DAO（IU/ml）2.27±0.199.36±1.036.82±0.52a

4、Western blot檢測結(jié)果

VEGF蛋白水平表達(dá)B、C兩組高于A組，且兩組之間C組表達(dá)更高。提示：黃芪甲苷可增強(qiáng)VEGF蛋白的表達(dá)水平，從而對腸黏膜屏障起到保護(hù)作用。見圖2、圖3。

圖2 3組大鼠小腸VEGF蛋白表達(dá)水平（×200）

圖3 3組大鼠小腸VEGF蛋白表達(dá)水平

討論

腸道是人體重要的消化器官，也是腹腔各器官中對缺血最敏感的器官，當(dāng)缺血的腸道恢復(fù)血流后，其可以釋放大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子，它們可以破壞腸黏膜屏障功能，導(dǎo)致腸黏膜通透性增高，從而使大量的細(xì)菌及內(nèi)毒素通過破損的腸道進(jìn)入人體循環(huán)，嚴(yán)重時引起全身各臟器的功能障礙。血漿中DAO、D-乳酸濃度可以間接反映腸黏膜通透性及屏障功能，二者可以用來評判腸黏膜上皮細(xì)胞的完整性［5］。因?yàn)镈AO僅存在于腸絨毛中，很少存在于其他細(xì)胞中，當(dāng)腸絨毛遭到破壞時它將大量釋放入血，導(dǎo)致其在血漿中活性升高。D-乳酸是細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，腸黏膜屏障功能受損時，它可以大量釋放入血，使其在血漿中濃度增加。有研究發(fā)現(xiàn)血漿DAO和D-乳酸的水平與腸黏膜屏障功能呈負(fù)相關(guān)［6］。本研究證實(shí)，腸道缺血再灌注時兩者在血漿中的含量增多，表明缺血再灌注破壞了腸黏膜屏障的完整性，導(dǎo)致其通透性增加。

VEGF廣泛分布于人和動物的各器官，它是一種可以特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，從而促進(jìn)新生血管形成的細(xì)胞因子，是目前促進(jìn)血管生成活性最強(qiáng)，專一性最高的因子［7］。它可以促進(jìn)損傷區(qū)域的血管化，恢復(fù)損傷組織的血液供應(yīng)，從而減輕受損組織的缺血缺氧損傷，挽救瀕死組織。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可以參與大腦、腎臟［8-9］等器官的缺血損傷修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)腸道缺血再灌注損傷時VEGF蛋白表達(dá)水平上調(diào)，機(jī)體通過增加VEGF蛋白的表達(dá)改善腸道的血運(yùn)，使腸道獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì)，從而加快腸黏膜損傷的愈合。

黃芪是益氣補(bǔ)血、活血化瘀的一類中藥，它具有改善循環(huán)、擴(kuò)張血管、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療。其可通過各種核心靶點(diǎn)，作用于多種信號通路，對糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展起到一定作用［10］。其中，黃芪甲苷是黃芪的單體皂苷類化合物，是評價黃芪藥材質(zhì)量的指標(biāo)物質(zhì)［11］。黃芪甲苷具有促進(jìn)新生血管形成，保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心功能的作用［12］。徐勝艷等［13］研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以抑制結(jié)腸炎小鼠的炎性反應(yīng)，對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的黏膜組織起到保護(hù)作用。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷不僅可以正向促進(jìn)新生血管生成，而且可以抑制負(fù)向控因子表達(dá)，從而發(fā)揮促血管生成作用［14］。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪可以通過促進(jìn)VEGF蛋白的表達(dá)，改善腦組織缺血［15］。黃芪甲苷也可以通過上調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)，增加微血管密度，從而促進(jìn)心肌梗死大鼠血管生成，表明黃芪甲苷對心肌缺血有改善作用［16］。黃芪可以抑制氧自由基，降低胃黏膜的氧化損傷，可以提高VEGF水平，促進(jìn)胃潰瘍的愈合［17］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單純?nèi)毖俟嘧⒔M比較，黃芪甲苷預(yù)處理組大鼠腸屏障通透性減低，VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高。表明黃芪甲苷對腸道缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，原因可能與它可以調(diào)節(jié)VEGF蛋白的表達(dá)水平有關(guān)，這可能是黃芪治療腸道缺血再灌注損傷的機(jī)制之一，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究為臨床上應(yīng)用黃芪治療各種缺血性疾病提供了一個有用的理論依據(jù)，相信隨著研究的不斷深入，將會不斷發(fā)掘黃芪的更多功效，使其更好地服務(wù)于臨床。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突