趙夏浦，姚志軍，涂婉玉，董 磊，張騰騰，劉 奔，任明芬

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453002；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院法醫(yī)學院新鄉(xiāng)市法醫(yī)毒理學重點實驗室，河南新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院/河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)是一種強效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，被列為第一類精神藥物[1]。MA重復攝入易造成藥物成癮，而藥物成癮是一種與獎賞作用和學習記憶有關的慢性復發(fā)性腦病[2]，可改變大腦的結(jié)構與功能[3]，對各個腦區(qū)造成嚴重損害。目前，關于MA成癮的神經(jīng)毒性機制已經(jīng)較為明確，但其對心臟的毒性作用及機制尚不明確。條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)動物模型是用來研究與獎賞相關的學習、記憶功能的經(jīng)典動物模型[4]，能夠較好地模擬MA成癮者的行為特征[5]，且CPP效應的緩解與成癮性藥物的戒斷治療具有同等效果[6]。本研究擬通過CPP制備MA成癮大鼠模型，觀察MA成癮模型大鼠心臟組織學變化及心肌組織中去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體(norepinephrine transporter，NET)和多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transporter，DAT)表達的變化，探討MA成癮對大鼠的心臟毒性作用及機制，旨在為進一步研究MA成癮對心臟的毒性作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體級8周齡健康Sprague Dawley(SD)雄性大鼠17只，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2019-0010，體質(zhì)量230～250 g。對動物的實驗處理方法遵照中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑與儀器MA購自中國食品藥品檢定研究院(批準文號171212-201605)，NET一抗和DAT一抗購自上海安研商貿(mào)有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒購自武漢賽維爾生物公司，免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；正置光學顯微鏡購自日本Nikon公司，冷凍切片機購自日本Leica公司，CPP實驗視頻分析系統(tǒng)由上海移數(shù)信息科技公司提供。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理將17只SD大鼠隨機分為對照組(n=7)和MA組(n=10)。2組大鼠均單籠飼養(yǎng)，整個實驗過程自由飲水取食。將MA用生理鹽水配制成5 g·L-1MA溶液。MA組大鼠分別于實驗第 5、7、9、11、13、15、17天腹腔注射5 g·L-1MA溶液(1 mL·kg-1)，第6、8、10、12、14、16、18天腹腔注射生理鹽水(1 mL·kg-1)；對照組大鼠每日腹腔注射生理鹽水(1 mL·kg-1)。

1.3.2 CPP實驗第1～4天為適應期，每日將大鼠放入CPP箱中，將黑白箱中間的隔板取出，讓其在黑白箱中自由活動30 min適應CPP箱環(huán)境；然后對每只大鼠進行CPP測試15 min，確定大鼠的天然偏愛箱。第5～18天為訓練期，封閉CPP箱中間的隔板，2組大鼠腹腔注射MA溶液或生理鹽水后放入CPP箱訓練120 min，連續(xù)訓練14 d，于第19天對2組大鼠進行CPP測試15 min，記錄大鼠在白箱中停留時間和活動軌跡，分析活動軌跡曲線密度。在每個階段CPP測試過程中，保持安靜，每只大鼠訓練或測試結(jié)束后對CPP箱底部及側(cè)壁噴灑酒精并清潔，并保證實驗條件、時間、環(huán)境的一致。

1.3.3 心臟組織取材和處理實驗第19天，2組大鼠以20 g·L-1的戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1)麻醉，然后依次用200 mL生理鹽水和200 mL多聚甲醛溶液(4 g·L-1)行心臟灌流，取左心室，置于4 g·L-1多聚甲醛中室溫固定24 h，使用冰凍切片包埋劑包埋，連續(xù)切片(厚 10 μm)，組織切片用于后續(xù)HE染色和IHC檢測。

1.3.4 HE染色觀察2組大鼠左心室心肌組織病理學變化冰凍切片45 ℃ 烤片2 h，在搖床上洗5 min 洗去包埋劑。蘇木精染液染色5 min，自來水沖洗多余染色液；然后用體積分數(shù)1 %的鹽酸乙醇分化30 s，再用自來水充分洗滌。將組織切片置于體積分數(shù)0.5 %的伊紅乙醇溶液中復染2 min，依次在體積分數(shù)75 %的乙醇脫水2 min、體積分數(shù)85 %的乙醇脫水30 s；再依次在無水乙醇中徹底脫水2次，每次2 min；然后將組織切片依次移入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡各3 min至切片透明，中性樹膠封片。應用正置光學顯微鏡觀察心臟組織的形態(tài)學變化。

1.3.5 IHC法檢測2組大鼠左心室心肌組織中NET和DAT的表達取心臟組織冷凍切片，復溫5 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)浸洗3次，每次 5 min；用體積分數(shù)3%過氧化氫抗原封閉，PBS浸洗3次，每次5 min；室溫下滴加適量的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，孵育10 min，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加體積分數(shù)5%山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min，傾去血清；分別滴加兔抗大鼠多克隆NET一抗(滴度1200)和兔抗大鼠多克隆DAT一抗(滴度1200)，4 ℃過夜。37 ℃恒溫箱復溫30 min，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)浸洗3次，每次5 min，滴加山羊抗兔IgG標記的二抗，37 ℃孵育60 min，PBST浸洗3次，每次5 min。使用IHC試劑盒進行染色。使用Image J Basies Version 1.53軟件測量切片陽性免疫反應區(qū)域的積分光密度(integral optical density，IOD)值，計算平均光密度值(average optical density，AOD)，AOD=目標分布區(qū)域IOD值/目標分布區(qū)域的面積，以AOD代表目標物質(zhì)相對表達量。每只大鼠取3個不同層面的3張切片進行分析，取均值。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠白箱中停留時間和活動軌跡曲線密度比較實驗第19天，對照組和MA組大鼠白箱中停留時間分別為(404.478±87.512)、(165.433±27.323)s；MA組大鼠白箱中停留時間顯著長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.295，P<0.05)。MA組大鼠在白箱中的活動軌跡曲線密度明顯高于前測期，對照組大鼠在白箱中的活動軌跡曲線密度無明顯變化(圖1)。

圖1 2組大鼠CPP測試軌跡圖

2.2 2組大鼠左心室心肌組織病理學變化比較結(jié)果見圖2。對照組大鼠左心室心肌細胞排列整齊，未見心肌損傷表現(xiàn)；MA組大鼠左心室心肌細胞排列紊亂，可見心肌組織出血、心肌細胞波紋樣改變、心肌內(nèi)炎癥細胞聚集。

A:對照組大鼠正常心肌組織；B:MA組大鼠心肌組織內(nèi)出血；C:MA組大鼠心肌細胞呈波紋樣；D：MA組大鼠心肌組織中可見炎癥細胞。

2.3 2組大鼠左心室心肌組織中NET、DAT相對表達量比較結(jié)果見表1和圖3。免疫組織化學染色顯示，NET和DAT陽性表達為棕黃色染色，定位于左心室心肌細胞膜。MA組大鼠左心室心肌組織中NET和DAT相對表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 2組大鼠左心室心肌組織中NET和DAT相對表達量比較

A:對照組大鼠心肌組織中NET的表達；B:MA組大鼠心肌組織中NET的表達；C:對照組大鼠心肌組織中DAT的表達；D：MA組大鼠心肌組織中DAT的表達。

3 討論

MA成癮性強、復吸率高，故其濫用已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題和社會問題[7]。MA是一種間接的擬交感神經(jīng)藥物[8]，可通過冠狀動脈收縮壓持續(xù)升高[9]以及氧自由基大量累積[10]對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。MA對心血管系統(tǒng)造成的毒副作用已成為MA濫用者死亡的重要原因[11]。研究發(fā)現(xiàn)，MA成癮對神經(jīng)系統(tǒng)的影響與大腦中NET和DAT的表達和調(diào)控密切相關[12]，但目前MA對心血管系統(tǒng)的影響尚不清楚[13]。

本研究通過給予大鼠MA結(jié)合CPP訓練制備MA成癮模型，結(jié)果顯示，MA組大鼠在白箱中停留時間顯著長于對照組，MA組大鼠給藥后在白箱中活動軌跡曲線密度明顯高于前測期，而對照組大鼠在白箱中活動軌跡曲線密度無明顯變化；說明MA可以使大鼠產(chǎn)生明顯的CPP效應，對MA產(chǎn)生軀體和精神依賴，證實造模成功。此外，本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠左心室心肌細胞排列整齊；MA組大鼠左心室心肌細胞排列紊亂，可見心肌出血、心肌細胞波紋樣改變、心肌內(nèi)炎癥細胞聚集；說明MA可引起大鼠左心室心肌細胞壞死、變性及心肌組織炎癥反應等病理變化，對大鼠心肌組織有一定的損傷作用。

NET可高密度地表達于去甲腎上腺素能神經(jīng)元質(zhì)膜上，也表達于膠質(zhì)細胞中[14]，其通過調(diào)節(jié)突觸間隙釋放的去甲腎上腺素水平，在許多中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)生理機制中發(fā)揮關鍵作用，NET功能障礙已被證明與注意缺陷多動障礙、恐慌、抑郁癥等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，NET對心血管穩(wěn)態(tài)至關重要，NET功能障礙通常與高血壓[15]、體位性心動過速綜合征[16]、立位不耐受和心力衰竭[17]等心血管病變中交感神經(jīng)過度活動有關。DAT可將多巴胺從細胞外迅速轉(zhuǎn)運到突觸前神經(jīng)元細胞質(zhì)中，以維持多巴胺穩(wěn)態(tài)[18]，DAT功能異常參與注意力缺失過動癥、DAT缺乏綜合征、孤獨癥、精神分裂、藥物成癮及帕金森病等多種神經(jīng)和精神疾病的發(fā)生[19]。研究表明，MA和其他精神興奮劑作用于NET和DAT，可破壞去甲腎上腺素和多巴胺的再攝取[20]。本研究結(jié)果顯示，對照組和MA組大鼠心肌組織中均有NET、DAT的表達，而MA組大鼠心肌組織中NET、DAT相對表達量顯著低于對照組。這一結(jié)果說明，MA成癮可造成心臟組織中NET和DAT表達降低，從而造成對兒茶酚胺的清除減少[12]，導致突觸后兒茶酚胺水平激增，引起血管痙攣、缺血、活性氧產(chǎn)生以及線粒體損傷等，最終造成心肌損傷[21]。有研究報道，靜脈注射三硝基去甲腎上腺素過程中，三硝基去甲腎上腺素在心臟中的分布比例遠遠超過在腎臟、前臂、腿部、大腦和肺部，提示NET功能缺陷可能會增強交感神經(jīng)化學信號，增加情感性疾病個體心血管疾病發(fā)展的風險[22-23]。

綜上所述，MA成癮可通過降低心肌組織中NET和DAT表達水平，導致心肌損傷。但本研究未檢測突觸后兒茶酚胺水平變化，NET和DAT表達變化對突觸后兒茶酚胺水平的確切影響尚未證實，這需在今后的實驗中進行研究；而且未來可對心臟損害和MA用藥時間的關系進行研究，以指導臨床對MA成癮導致的心肌損傷進行預防和治療。