王 慶， 張巧娥*， 張轉(zhuǎn)弟， 李 月， 李云鶴， 封 元

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏回族自治區(qū)畜牧工作站，寧夏銀川 750001）

抗生素作為一種非營養(yǎng)性飼料添加劑，有著促進動物生長、提高動物繁殖性能和存活率、降低疾病發(fā)生率、提高飼料轉(zhuǎn)化效率、降低飼料成本的作用（Dong等，2021）。但其會提高細菌對藥物耐藥性，從而使畜禽免疫力降低，導(dǎo)致內(nèi)源性感染；并且還會引起過敏反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)、以及“致癌、致畸和致突變”等；同時，大多數(shù)抗生素與畜禽糞尿一起排放到環(huán)境中后仍保持活性，對土壤微生物、水生生物和昆蟲均有不利影響（縱瑞等，2021；張利珍，2019；王亞書等，2019；Allen等，2013；Frizzoa等，2011）。自2020年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194號公告開始全面禁止抗生素的使用以來，研究學(xué)者開始探索可以完美替代抗生素的產(chǎn)品，其中益生菌是目前公認的最有前景的抗生素替代品（楊柳青，2020）。益生菌主要通過競爭排斥、直接抗菌抑制、宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、增強腸道固有免疫力、提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率、減少腹瀉和抗毒素作用以及刺激或抑制獲得性免疫等方法來提高動物生產(chǎn)性能（Beulah等，2020）。常用菌群有：酵母菌群、芽孢桿菌、乳酸菌群、革蘭氏陽性放線菌群等（李洵，2021；Vicini等，2019；Red等，2018）。

研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌對犢牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)存在一定的影響。Zhang等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，通過添加復(fù)合菌飼喂?fàn)倥?，瘤胃發(fā)酵特性無顯著差異。16S rRNA V3區(qū)擴增片段的凝膠電泳分析結(jié)果表明，56日齡斷奶前，微生態(tài)制劑對瘤胃細菌群落沒有影響。但于萍等（2009）的研究表明，飼糧中添加納豆芽孢桿菌，可以促進犢牛消化系統(tǒng)中的琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和脂解厭氧弧桿菌的定植與生長。劉程等（2020）的研究表明，每頭牛日糧中添加由地衣芽孢桿菌（活菌數(shù)≥1.0×109cfu/g）、枯草芽孢桿菌（活菌數(shù)≥2.0×109cfu/g）和米曲霉（活菌數(shù)≥2.0×104cfu/g）組成的復(fù)合益生菌20 g后，在門水平上，試驗組和對照組相對豐度前10的菌門均無顯著差異；在屬水平上，試驗組琥珀酸菌屬相對豐度顯著高于對照組，瘤胃球菌屬相對豐度提高42.1%，琥珀酸弧菌屬相對豐度顯著低于對照組。但是，目前關(guān)于酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌對犢牛瘤胃方面的研究較少，所以，本試驗將立足于前人的研究基礎(chǔ)之上，探究復(fù)合菌顆粒料對犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)的影響，為指導(dǎo)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 試驗于2020年7月6日至10月16日在寧夏壹泰牧業(yè)有限公司進行。選擇20頭出生年齡相近（7日齡）且健康的安格斯?fàn)倥?，隨機分為2組，其中對照組10頭，試驗組10頭，經(jīng)t檢驗分析，兩組體重差異不顯著（P＞0.05）[（27.7±2.85）kg]。犢牛出生后稱重，出生后0.5～1.0 h進行人工誘食，隨后初乳后自然哺乳，7 d后誘食顆粒料。試驗使用犢牛顆粒料，其原料組成為：玉米、豆粕、棉籽粕、膨化大豆、磷酸氫鈣、維生素預(yù)混合飼料、微量元素預(yù)混合飼料等，各種原料營養(yǎng)水平見表1。對照組飼喂該顆粒料；試驗組在對照組的基礎(chǔ)上添加商品型1%復(fù)合菌（酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌）顆粒料，活菌數(shù)為3×108cfu/g，試驗期間兩組自由采食，記錄每天顆粒料采食量，自由飲水。每日少量多次添加，試驗期共100 d，其中預(yù)飼期10 d，正試期90 d。

表1 顆粒料營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 測定指標(biāo)與方法 在試驗結(jié)束當(dāng)天早晨犢?？崭箷r，每組隨機選取6頭犢牛用瘤胃液采集器從口腔采集瘤胃液50 mL（棄去前20 mL），未經(jīng)紗布過濾直接裝于凍存管以保證瘤胃液中菌群的完整性。之后液氮保存并及時送回實驗室備測。

1.2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定 參照王敬堯（2019）方法采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨氮濃度（NH3-N），采用pH劑測定瘤胃液pH，采用考馬斯亮藍法測定菌體蛋白（MCP），采用氣相色譜儀測定瘤胃液的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸以及總揮發(fā)性脂肪酸含量。

1.2.2 瘤胃微生物多樣性測定 將在液氮中凍存的瘤胃液送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。具體流程為：將瘤胃液4℃解凍后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提DNA，合成帶有barcode的特異引物，其序列為：上游引物338F：5"-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3"；下游引物806R：5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3"。切膠回收PCR產(chǎn)物后用QuantiFlourTM-ST熒光定量，最后在MiSeq PE-300平臺進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗數(shù)據(jù)先通過Excel 2007進行初步整理，然后使用SAS 8.1統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。最終結(jié)果以“平均值±標(biāo)準差”表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表2可知，復(fù)合菌顆粒料飼喂?fàn)倥：罅鑫竷?nèi)MCP含量可以顯著提高0.37 mg/mL（P＜0.05），而氨態(tài)氮、pH、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、乙酸/丙酸以及總揮發(fā)性脂肪酸含量均表現(xiàn)為對照組與試驗組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.2瘤胃菌群結(jié)果

2.2.1 OTUs比較 由圖1可知，Illumina M iSeq測序后對12個犢牛瘤胃液樣本按照97%相似性對非重復(fù)序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。結(jié)果顯示：對照組共含有1230個OTUs，試驗組共含有1354個OTUs，其中，試驗組（B1）和對照組（A1）共同含有的OTUs數(shù)是1096個，對照組特有的OTUs數(shù)是134個，試驗組特有OTUs顯著高于對照組，有258個。說明試驗組和對照組瘤胃液菌群組成有差異。

圖1 Venn圖

2.2.2 細菌稀釋曲線 試驗組（B1）與對照組（A1）樣本的OTUs稀釋曲線結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明：隨著測序深度逐漸遞進，試驗組和對照組的OTUs數(shù)量和物種豐富度表現(xiàn)一致，在剛開始時OTUs數(shù)量陡然上升，之后達到平緩期。表明測序深度已基本覆蓋樣品中的細菌物種，測序數(shù)量足夠，結(jié)果可以反映菌群的大部分真實信息。

圖2 OTUs稀釋曲線

2.2.3 α多樣性分析 由表3可知，復(fù)合菌顆粒料對瘤胃α多樣性指數(shù)均有影響，試驗組的Sobs指數(shù)和Ace指數(shù)分別顯著高于對照組217.73和242.93（P＜0.05）；試驗組的Shannon指數(shù)極顯著高于對照組0.81（P＜0.01）；試驗組的Chao指數(shù)極顯著高于對照組263.39（P＜0.01）；對照組Simpson指數(shù)顯著高于試驗組0.04（P＜0.05）；而試驗組和對照組的覆蓋率差異不顯著（P＞0.05）。

表3 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃微生物菌群多樣性的影響

2.2.4 細菌樣本PCoA分析 主坐標(biāo)分析（PCoA）用來表示每個瘤胃液樣品間的差異，當(dāng)瘤胃液中物種組成差異越大時圖中樣品的間距就會越遠。從圖3可以看出，在PC1和PC2的分別為53.05%、37.06%時，對照組（A1）和試驗組（B1）的間距較遠，說明2組菌群差異性較明顯。除對照組的A5樣品和試驗組的B5樣品與本組的距離較遠外，組內(nèi)其他樣品距離都較近，說明組內(nèi)菌群差異性較小。

圖3 PCoA圖

2.2.5 細菌物種門水平相對豐度 從表4可知，對照組和試驗組均由擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體門（Spirochaetota）以及其他相對豐度＜1%的共18種菌門組成。表中所列菌門中兩組間的差異均不顯著（P＞0.05）。其中擬桿菌門都是兩組的優(yōu)勢菌門，但試驗組較對照組提高了8.68個百分點。

表4 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃門水平上菌群結(jié)構(gòu)的影響（相對豐度＞1%）%

2.2.6 細菌物種屬水平相對豐度 由表5可知，在屬水平上對照組和試驗組的優(yōu)勢菌屬都是普雷沃菌屬（Prevotella），但對照組的第二優(yōu)勢菌屬是理 研 菌 科_RC9腸 道 群 （Rikenellaceae_RC9_gut_group），試驗組的第二優(yōu)勢菌屬是未 分 類_f_Muribaculaceae（norank_f_Muribaculaceae），其相對豐度均在5%以上。表中所列菌屬中除試驗組的普雷沃氏菌科_UCG-003群（Prevotellaceae_UCG-003）和普雷沃氏菌科_UCG-001群（Prevotellaceae_UCG-001）顯著高于對照組（P＜0.05）外，其他各項兩組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表5 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃屬水平上菌群結(jié)構(gòu)的影響（相對豐度＞1%）%

2.2.7 瘤胃細菌群落與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的關(guān)系 利用相關(guān)性分析得相關(guān)性Heatmap圖，評估了瘤胃細菌屬與瘤胃發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。如圖4所示，乙酸與norank_f_Muribaculaceae呈正相關(guān)（P＜0.05），與Rikenellaceae_RC9_gut_group呈弱負相關(guān)（P＜0.05）；丙酸與Ruminococcus呈負相關(guān)（P＜0.05），與Rikenellaceae_RC9_gut_group呈強負相關(guān)（P＜0.05）；丁酸與norank_f_Murib-aculaceae呈正相關(guān)（P＜0.05）；戊酸與Olsenella呈弱正相關(guān)（P＜0.05），與Succiniclasticum呈強正相關(guān)（P＜0.05）；總揮發(fā)性脂肪酸與norank_f_Muribaculaceae呈 正 相 關(guān) （P＜0.05）， 與Rikenellaceae_RC9_gut_group呈負相關(guān)（P＜0.05）。

圖4 瘤胃細菌屬（相對豐度最高的10個菌屬）相對豐度與瘤胃發(fā)酵參數(shù)相關(guān)性分析

3 討論

3.1 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 顆粒料中的含氮物質(zhì)是瘤胃液中NH3-N的主要來源。而NH3-N濃度主要取決于瘤胃對含氮物質(zhì)的降解率和吸收率 （李嵐捷等，2017；Ruselljb等1992）。本試驗中對照組和試驗組NH3-N濃度分別為13.70 mg/L和11.54 mg/L，差異不顯著，說明兩組犢牛對顆粒料中含氮物質(zhì)的降解率和吸收率無差異。MCP是反芻動物小腸中部分氨基酸的重要前體物，適量的MCP可平衡氨基酸的利用以降低蛋白質(zhì)飼料的使用，并能促進犢牛生長發(fā)育。本試驗中兩組MCP含量存在顯著差異，表現(xiàn)為試驗組顯著高于對照組，與謝建林等（2021）研究結(jié)果相同，并且MCP含量均比聶練等（2019）研究復(fù)合菌組60 d測得0.42 mg/mL高出1.92 mg/mL?？赡苁菑?fù)合菌顆粒料中的益生菌提高了犢牛瘤胃中微生物多樣性，進而使試驗組MCP含量較對照組的高（郭凱等，2019）。顆粒料中的碳水化合物會在瘤胃微生物的發(fā)酵作用下分解產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸物質(zhì)，然后為犢牛提供葡萄糖前體物和脂肪等，從而為犢牛機體提供70%～80%的能量（凌浩等，2021）。在本試驗中雖然兩組的揮發(fā)性脂肪酸間均無顯著差異，但整體表現(xiàn)為試驗組略高于對照組，表明給犢牛飼喂復(fù)合菌顆粒料有助于機體分解葡萄糖和淀粉等物質(zhì)以提高能量的利用。

3.2 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響 雖然犢牛瘤胃內(nèi)微生物體系還沒有完全成型，但還是可以通過高通量測序來確定犢牛瘤胃內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)和種類（李常瑞，2017），進而探究復(fù)合菌顆粒料對犢牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響。Venn圖可以直觀得觀察在97%水平下獨有和共同的OUT數(shù)，即觀察兩組樣品是否存在差異。本試驗就是基于兩組樣品的Venn圖存在差異的情況下繼續(xù)探究復(fù)合菌顆粒料對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響。

就α多樣性指數(shù)而言：Sobs指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)可反映菌群豐富度，且和菌群豐富度呈正相關(guān)；Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)可綜合反映菌群的多樣性和均勻度，而Simpson指數(shù)與菌群多樣性呈負相關(guān)，Shannon指數(shù)與菌群多樣性呈正相關(guān)，即當(dāng)Simpson指數(shù)越小、Shannon指數(shù)越大時瘤胃液菌群多樣性越大（Jami等，2013）。本試驗中試 驗 組 的Sobs指 數(shù)、ACE指 數(shù)、Chao指 數(shù) 和Shannon指數(shù)均顯著高于對照組，對照組Simpson指數(shù)顯著高于試驗組，與Hu等（2020）研究結(jié)果一致。并且與β多樣性分析相結(jié)合表明給犢牛飼喂復(fù)合菌顆粒料可以顯著增加瘤胃內(nèi)菌群的豐富度以及多樣性，為降解吸收營養(yǎng)物質(zhì)提供基礎(chǔ)。

3.3 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃菌群門水平的影響對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的研究表明擬桿菌門和厚壁菌門是瘤胃中的優(yōu)勢菌群 （吳瓊等，2020；Wu等，2020；Hein等，2020），本試驗共測得的18個門中優(yōu)勢菌群與這些研究結(jié)果相同。本試驗擬桿菌門占比達到60%以上，為第一優(yōu)勢菌群，但是這些菌群也是機會性致病菌群，當(dāng)犢牛體內(nèi)正常的微生態(tài)平衡被外界環(huán)境打破時這些菌群有可能會引起犢牛機體內(nèi)源性的發(fā)?。↙i等，2017）。同時，擬桿菌基因編碼的外周蛋白SusC和SusD可以調(diào)節(jié)淀粉與細菌表面的接觸，從而起到分解多糖的作用（Fredrik等2004），本研究中雖然兩組間擬桿菌門豐度差異不顯著，但表現(xiàn)為試驗組比對照組略高，這也是瘤胃中試驗組丙酸含量比對照組高的原因。說明飼喂復(fù)合菌顆粒料有助于犢牛對多糖物質(zhì)的分解。同時Evans等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門具有參與分解纖維物質(zhì)的作用，從而促進瘤胃內(nèi)乙酸和丁酸的產(chǎn)生，本試驗中試驗組和對照組的厚壁菌門豐度以及乙酸和丁酸的含量之間差異均不顯著，表明復(fù)合菌顆粒料對厚壁菌門無顯著影響，但從乙酸和丁酸含量的結(jié)果來看，試驗組的乙酸和丁酸含量均略高于對照組，這可能是瘤胃內(nèi)其他菌群的作用導(dǎo)致，具體還有待研究。

3.4 復(fù)合菌顆粒料對瘤胃菌群屬水平的影響 在屬水平上，本試驗共測得241個屬，而相對豐度大于1%的只有20種。其中普雷沃氏菌屬為第一優(yōu)勢菌屬，這與陳林（2020）研究結(jié)果一致。而Purushe等（2010）和Matsui等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬具有多重功能和多個基因型，具有裂解寡糖、蛋白質(zhì)和淀粉以及降解半纖維素的功能，另外有研究表明，普雷沃氏菌屬可以在瘤胃中消耗氫，可以通過丙烯酸和琥珀酸途徑發(fā)酵糖類物質(zhì)而產(chǎn)生丙酸（Flinth，2008）。本試驗中試驗組的普雷沃氏菌科_UCG-003群和普雷沃氏菌科_UCG-001群均顯著高于對照組，說明復(fù)合菌顆粒料可以提高普雷沃氏菌的相對豐度，從而促進犢牛對寡糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的利用以及產(chǎn)生更多的丙酸為機體提供能量，進而促進犢牛的生長發(fā)育。

3.5瘤胃細菌群落與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的關(guān)系 本試驗分析了瘤胃菌屬中前10相對豐度的菌屬與瘤胃發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)性關(guān)系。其中有9個菌屬相對豐度與瘤胃發(fā)酵參數(shù)呈顯著關(guān)系。與其他瘤胃發(fā)酵參數(shù)相比，本試驗中更多菌屬與乙酸、丙酸、丁酸、戊酸以及總揮發(fā)性脂肪酸顯著相關(guān)，本結(jié)果與陳林（2020）研究結(jié)果相似，但與曾鈺等（2020）研究結(jié)果存在差異，這可能是因為品種以及飼料類型等因素的影響。但主要都是表現(xiàn)為乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸與瘤胃菌屬之間有相關(guān)關(guān)系。所以揮發(fā)性脂肪酸的水平可能是影響瘤胃菌群的關(guān)鍵因素，瘤胃菌群可通過發(fā)酵作用產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，進而刺激犢牛瘤胃的發(fā)育（Rey等，2014）。本試驗結(jié)果說明乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的含量對norank_f_Muribaculaceae有促進作用，對Rikenellaceae_RC9_gut_group有抑制作用，說明揮發(fā)性脂肪酸的濃度與瘤胃菌群的組成密切相關(guān)。

4 結(jié)論

復(fù)合菌顆粒料可以顯著提高犢牛瘤胃中MCP的含量，對乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸以及總揮發(fā)性脂肪酸有增長的趨勢；并且可以增加犢牛瘤胃菌群豐富度，其中擬桿菌門相對豐度較對照組提高8.68個百分點，普雷沃菌屬、普雷沃氏菌科_UCG-003群以及普雷沃氏菌科_UCG-001群等相對豐度也有所提高。