馬婷玉，向 麗，徐志超，陳士林，宋經(jīng)元＊＊

（1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，國家中醫(yī)藥管理局中藥資源保護重點研究室 北京 100193；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥鑒定與安全性檢測評估重點實驗室 北京 100700；3. 東北林業(yè)大學(xué)東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室 哈爾濱 150040）

青蒿素(artemisinin)是一種含有特殊過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜類化合物，20世紀70年代首次由中國科學(xué)家從中草藥黃花蒿（Artemisia annuaL.）地上部分中提取并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)[1,2]。青蒿素是目前世界上治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾最有效的藥物，具有低毒、速效、與氯喹啉無交叉抗性的抗瘧效果[3,4]。隨著青蒿素及其衍生物臨床適應(yīng)癥的研究不斷發(fā)展，市場對青蒿素的需求量也日益增加。

青蒿素作為重要的天然產(chǎn)物，已成為國際研究熱點。目前市場上供應(yīng)青蒿素主要以黃花蒿植物提取為主，優(yōu)質(zhì)的黃花蒿資源主要分布在我國秦嶺-淮河以南地區(qū)，湖南和廣西是種植黃花蒿的兩大產(chǎn)區(qū)。近年來青蒿素價格在1200 元/kg 左右，企業(yè)利潤單薄，青蒿素原料藥材占成本60%左右，青蒿素含量每提高0.1%，可降低成本10%左右[5]。因此，迫切需要一種全面的、可持續(xù)的策略來增加青蒿素的供應(yīng)。在適宜的產(chǎn)區(qū)以合理栽培方式種植優(yōu)良黃花蒿品種是保證青蒿素提取的重要前提。除了來自植物的天然產(chǎn)物提取方法，還可通過人工合成的方式獲取青蒿素，如通過合成生物學(xué)在微生物底盤細胞中重構(gòu)天然產(chǎn)物的異源合成途徑[6,7]。還可通過化學(xué)合成的全合成和半合成生產(chǎn)青蒿素，化學(xué)全合成主要以香茅醛、薄荷醇等為原料，半合成結(jié)合了合成生物學(xué)和化學(xué)合成，以青蒿酸為原料最終合成青蒿素[8,9]。本文從天然產(chǎn)物提取和人工合成的角度展開綜述，介紹青蒿素資源保障策略的重要性，對其他重要天然產(chǎn)物如紫杉醇、長春堿、人參皂苷等資源保障具有重要參考價值。

青蒿素的資源保障策略涵蓋了天然產(chǎn)物生物合成保障、合成生物學(xué)保障和化學(xué)合成保障，該策略是保證黃花蒿中藥材和青蒿素產(chǎn)業(yè)發(fā)展的有效策略（圖1）。我們將通過選擇適宜黃花蒿種植區(qū)域、選育黃花蒿優(yōu)良品種、加強栽培技術(shù)，結(jié)合青蒿素合成生物學(xué)、化學(xué)全合成、半合成等策略有效提高青蒿素收率，介紹各個實施環(huán)節(jié)的進展和影響因素，保障青蒿素資源的可持續(xù)利用。

圖1 青蒿素資源保障策略圖

1 青蒿素天然產(chǎn)物生物合成保障

1.1 黃花蒿倍半萜類天然產(chǎn)物概況

目前國內(nèi)外從黃花蒿中提取的倍半萜類化合物近60 種[10]，包括青蒿素、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)、紫穗槐-4,11-二烯、青蒿醇、青蒿醛、青蒿酸、雙氫青蒿醇、雙氫青蒿醛、雙氫青蒿酸、青蒿乙素等青蒿素合成途徑主要化合物（如圖2）。Bhakuni 等[10]從黃花蒿全草中分離得到artemisin、arteannuic alcohol、abscisic acid、abscisic acid methyl ester。Brown 等[11]采用HPLC 和硅膠色譜柱技術(shù)從黃花蒿種子中提取分離出annulide、iso-annulide、cedina-3α, 15-dihydroxy、secocadinane-artemisia、dihydroxycadinolide-artemisia、 eudesma-4(15),11-diene、eudesma-4(15),11-diene,5α-hydroperoxy、環(huán)氧青蒿酸等。Misra 等[12]利用硅膠色譜柱在黃花蒿地上部分中分離得到annuic acid。屠呦呦等[13-14]利用硅膠色譜法從黃花蒿全草分離得到青蒿素A、B、D、E，青蒿丙素。Sy 等[15]從黃花蒿葉片中分離出青蒿素H、I、J、K、L、M、N、O。倍半萜類成分為黃花蒿的特征性成分，其中青蒿素是黃花蒿特有的倍半萜類化合物，其在黃花蒿植株不同組織部位含量分布不同，主要分布于黃花蒿葉片、花蕾、莖部表面的分泌型腺毛。倍半萜類化合物法尼基焦磷酸（FPP）作為中間產(chǎn)物，也是MVA 和MEP兩個途徑合成青蒿素的重要節(jié)點化合物，紫穗槐-4,11-二烯是青蒿素合成的起始化合物，其在酶促作用下逐步合成下游的青蒿醇、青蒿醛、雙氫青蒿醇、青蒿酸等中間產(chǎn)物，最終合成青蒿素[16]。

圖2 黃花蒿主要倍半萜類成分列舉

隨著提取技術(shù)的進步，有效提高天然產(chǎn)物提取效率的同時也降低了原料成本。因此，提取技術(shù)的優(yōu)選是天然產(chǎn)物工業(yè)化發(fā)展環(huán)節(jié)的關(guān)注重要。青蒿素提取有多種方法，傳統(tǒng)提取方法主要有室溫提取、索氏提取、冷浸提取、冷循環(huán)提取、回流提取、丙酮-硅膠柱層析法等[17-20]。隨著提取工藝的發(fā)展新技術(shù)也逐步應(yīng)用于青蒿素提取中，例如微波萃取法可縮短加熱時間提高青蒿素的萃取率[21]。超臨界提取技術(shù)可減少提取時間，使提取率得到提升[22]。生物酶輔助提取法使用纖維素酶進一步增加了黃花蒿植株中活性成分的提取效率[23]。目前，石油醚為溶劑的溶媒提取以其安全性高、成本低等特點成為企業(yè)提取青蒿素最常用和經(jīng)濟的方法[24]。

1.2 影響青蒿素天然產(chǎn)物生物合成保障的主要因素

1.2.1 自然生態(tài)環(huán)境對青蒿素天然產(chǎn)物生物合成的影響

生態(tài)環(huán)境是影響中藥材種植和生長的重要因素，適宜的生態(tài)環(huán)境可影響黃花蒿藥材的品質(zhì)。黃花蒿主要適宜生長在亞洲溫帶、寒溫帶及亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)域。黃花蒿分布和生長在不同環(huán)境中，由于對不同的環(huán)境生態(tài)因子的長期趨異適應(yīng)的結(jié)果，形成具有各自穩(wěn)定形態(tài)或生理生態(tài)特征的不同個體群即生態(tài)型。黃花蒿的生態(tài)地域性由不同生態(tài)型之間的生理生化特征差異引起，其資源品質(zhì)的生態(tài)地域性本質(zhì)與環(huán)境生態(tài)因子密切相關(guān)[25]。

生態(tài)適宜性分析平臺研究黃花蒿的空間分布與氣候因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)緯度與黃花蒿分布密切相關(guān)，影響黃花蒿分布的環(huán)境生態(tài)因子主要是年均降水量、年均相對濕度、年均日照以及最熱季均溫[5]。黃花蒿生長的95-100%氣候相似區(qū)為南緯25°和北緯25°附近的亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)域，是適宜高青蒿素含量黃花蒿生長的生態(tài)環(huán)境[26]。通過《藥用植物全球產(chǎn)地生態(tài)適宜性信息系統(tǒng)》(geographic information system for global medicinal plants,GMPGIS)技術(shù)分析產(chǎn)地適宜性表明，亞洲101.89°～141.08°E 之間是黃花蒿的生態(tài)適宜產(chǎn)區(qū)，預(yù)測結(jié)果可進一步實踐和驗證[5]。

本研究組根據(jù)野外調(diào)研和文獻資料查閱，選擇青蒿素含量較高的中國南方地區(qū)進行野生資源采集，包括海南（海口、瓊中、儋州）、湖南（沅江、永安、桑植、懷化）、廣西（南寧、柳州、全州）、貴州（銅仁）、四川（宜賓、成都）、重慶（酉陽、江津）。為進一步完善黃花蒿種質(zhì)資源庫，同時收集了包括江蘇、浙江、福建、江西、貴州、云南、河南、河北、湖北、北京、天津、山東、安徽、西藏、新疆、甘肅、青海、陜西、山西、黑龍江、遼寧、吉林等21 個省份的市/縣/鄉(xiāng)野生資源（圖3），并在廣西、四川、江蘇、海南、北京和湖北建立種質(zhì)資源圃，為黃花蒿種質(zhì)資源的選育提供保障。

圖3 黃花蒿種質(zhì)資源庫及新品種快速選育平臺

黃花蒿生存適應(yīng)性強且分布廣泛，在中國大部分省市均有分布。通過對黃花蒿栽培資源的產(chǎn)地環(huán)境調(diào)研，青蒿素含量較高的產(chǎn)地主要分布在秦嶺-淮河以南[5,27]。亞熱帶地區(qū)青蒿素含量在0.4-0.7% 之間，在溫帶和寒帶地區(qū)青蒿素含量低于0.1%，中國亞熱帶濕潤氣候區(qū)中的青蒿素含量平均值大于0.5%[5-7]。目前，黃花蒿栽培資源在中國的適宜產(chǎn)區(qū)包括湖南、廣西和貴州。其中，湖南省適宜栽培資源種植產(chǎn)區(qū)面積占全國總產(chǎn)區(qū)面積的15%，廣西、貴州分別占全國總產(chǎn)區(qū)的14%和12%[28,29]。北方地區(qū)的黃花蒿野生資源青蒿素含量較低，如內(nèi)蒙古、黑龍江、北京、山東、安徽和湖北部分地區(qū)等。據(jù)報道，將位于北緯23°-30°間包括廣西、云南、四川、湖南等地的優(yōu)質(zhì)黃花蒿引種于黑龍江各地，引種品種含量低于原產(chǎn)地且含量差異較大[30]。將重慶、廣西、青海、河南的黃花蒿引種到海南，除青海外其余產(chǎn)地的黃花蒿藥材中青蒿素含量高于原產(chǎn)地[31]。因此，選擇適宜的產(chǎn)地環(huán)境是實現(xiàn)黃花蒿優(yōu)良栽培的重要前提，并且能有效保障黃花蒿的藥材品質(zhì)。

1.2.2 種質(zhì)資源對青蒿素天然產(chǎn)物生物合成的影響

黃花蒿優(yōu)良種質(zhì)選育對提高青蒿素天然產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)具有重要意義，優(yōu)良的種質(zhì)資源對提高青蒿素提取產(chǎn)率，降低提取成本具有重要意義。黃花蒿良種選育工作可分以下步驟具體實施：第一步：篩選黃花蒿外觀性狀佳，包括株型緊湊、葉裂片排列緊密、葉片卵形或菱形、葉色深，以及青蒿素含量高的種質(zhì)，基于基因組重測序的Indel 分子標記篩選優(yōu)良性狀標記；第二步：通過集團選育、雜交、混合選育等獲得新品種；第三步：通過組織培養(yǎng)、扦插、溫室培養(yǎng)等快速繁育新品種；第四步：結(jié)合黃花蒿龍頭企業(yè)+農(nóng)戶+科研產(chǎn)業(yè)化進一步推廣黃花蒿新品種，實現(xiàn)黃花蒿新品種快速選育平臺的建立(圖3)。針對不同選育需求，黃花蒿良種選育平臺建立了系統(tǒng)完善的工作流程，為黃花蒿優(yōu)良種質(zhì)資源的補充和保存提供了有力的保障。

自2005 年以前，由于青蒿素原料價格處于高位，因此許多人盲目使用野生種子和低含量品種栽培，盲目種植出現(xiàn)了種植品種混雜，原料青蒿素含量較低等問題，導(dǎo)致廠家拒絕收購，農(nóng)戶損失慘重等[32]。近幾年，隨著青蒿素價格持續(xù)低迷，對黃花蒿高產(chǎn)高含量新品種需求越來越高。前期通過傳統(tǒng)選育獲得的黃花蒿新品種，包括桂蒿1 號、桂蒿2 號、桂蒿3 號、藥客佳蒿1 號、鄂青蒿1 號、渝青1 號、渝青蒿2 號、湘蒿1號、湘蒿2 號、湘蒿3 號、湘蒿4 號等，青蒿素含量均在1%左右；研青1號、中康優(yōu)青1號、中康優(yōu)青2號、科蒿1 號、科蒿2 號、科蒿3 號等，青蒿素含量均在2%左右（表1）[33-37]。隨著分子育種、輻照育種等新技術(shù)的使用，將會獲得更多優(yōu)良品系。黃花蒿的生產(chǎn)需采用高含量、高產(chǎn)量、抗性強等優(yōu)質(zhì)特征的黃花蒿品種作為人工栽培的良種種源。

表1 黃花蒿新品種類型及特征

1.2.3 生產(chǎn)栽培技術(shù)對青蒿素天然產(chǎn)物生物合成的影響

黃花蒿的生產(chǎn)栽培技術(shù)是影響青蒿素產(chǎn)量的重要因素。黃花蒿的藥材質(zhì)量與種植環(huán)境、種植方式、光照、水分、品種、施肥、連作等密切相關(guān)[38-39]，合理的栽培技術(shù)可有效提高黃花蒿藥材品質(zhì)。種苗田間綜合管理和合理施肥是影響黃花蒿栽培的最主要因素，其次為病蟲害和綜合防治，最后為采收和貯藏。

優(yōu)質(zhì)種苗田間綜合管理是栽培技術(shù)中影響黃花蒿藥材產(chǎn)量的重要因素之一，包含移栽、合理配置株行距、合理灌溉及田間除草[40]。黃花蒿耐澇性較弱，忌干旱，播種期和苗期對水分有較高要求，水分不足會使種子發(fā)芽率降低，而灌溉較多或排水不暢會使病害增多，易出現(xiàn)根腐病和莖腐病。三對真葉長前的幼苗期植株生長量小，土壤過于干旱或水分過多都將影響幼苗生長，應(yīng)及時灌溉[41]。黃花蒿植株橫幅較大，還應(yīng)注意合理配置株行距，平地株行距100 cm×100 cm 開穴；坡地株行距80-100 cm×80-100cm 開穴。移栽后田間及時除雜草，定時對根部培土。

合理施肥是中藥材栽培生產(chǎn)的重要部分，也是栽培技術(shù)中影響黃花蒿藥材產(chǎn)量和含量的重要因素之一。黃花蒿合理施肥應(yīng)釆取不同施肥措施，不僅要做到適時施肥，還應(yīng)保證氮磷鉀合理使用，有機、無機肥料配合，以及微量元素的噴施等，不斷提高有效成分的累積[42-43]。黃花蒿不同器官在不同生長期的養(yǎng)分主要以K 變化最大，P 變化最小。黃花蒿植株內(nèi)N、P、K的積累在快速生長期后至現(xiàn)蕾期前后期變化較大，高施肥后N、K主要轉(zhuǎn)移至根、莖和枝葉中，P主要轉(zhuǎn)移至根和枝葉中，高施N、K、P肥和中施N、K、P肥有助于青蒿素含量的積累[44-45]。因此，黃花蒿施肥需注重含N、K、P的復(fù)合肥施用。

病蟲害和綜合防治會直接影響藥材的產(chǎn)量和采收。黃花蒿田間栽培發(fā)生病害和蟲害較少，其綜合防治主要分為化學(xué)防治和物理防治。針對黃花蒿病害和蟲害種類，科學(xué)合理選用化學(xué)防治技術(shù)，采用高效、低毒、低殘留的農(nóng)藥，以降低農(nóng)藥殘留及重金屬污染等[46,47]。病害主要包括根腐病、莖腐病和白粉病。根腐病和莖腐病可用惡霉靈、多菌靈等進行防治，白粉病可用代森錳鋅、三唑酮防治。預(yù)防病害物理防治包括合理密植、及時排水，降低土填濕度，適量施加氮肥，增強磷鉀肥和有機肥，還可選用抗性品種[48]。蟲害主要為蚜蟲、象甲蟲、菊癭蚊、蠐螬和小地老虎。蚜蟲和菊癭蚊的化學(xué)防治可使用吡蟲啉、啶蟲脒等按劑量噴霧，象甲蟲可用菊酯類殺蟲劑，蠐螬和小地老虎可用辛硫磷進行防治。蚜蟲的物理防治可采用黃板誘蟲消滅，蠐螬、小地老虎成蟲均有趨光性，可用黑光燈、頻振式殺蟲燈誘殺成蟲。菊癭蚊生長季及時摘除蟲癭并銷毀。發(fā)現(xiàn)象甲蟲時，在植株下方鋪放塑料薄膜，可輕晃植株并集中消滅掉到薄膜上的象甲蟲[46-48]。在無法避免使用農(nóng)藥的情況下，應(yīng)盡量減少使用次數(shù)和使用量，且在采收前30天內(nèi)不得施用化學(xué)農(nóng)藥。

科學(xué)的采收和貯藏方式會有效提升黃花蒿藥材質(zhì)量和減少青蒿素損耗。黃花蒿的采收時間為現(xiàn)蕾前，一般應(yīng)在八月份生長盛期采收[49,50]。黃花蒿干葉中青蒿素含量隨貯藏時間而逐漸降解，放置半年的干葉中青蒿素含量可降解30%[51-52]。因此，合理加工和貯藏黃花蒿干葉能提高青蒿素的提取價值，并有效降低生產(chǎn)成本。

目前，市場上通過黃花蒿植物提取仍然是最主要獲取青蒿素的方法，因此選擇適宜的生態(tài)環(huán)境、優(yōu)良的種質(zhì)資源和科學(xué)的栽培技術(shù)是提高青蒿素天然產(chǎn)物生物合成保障的重要因素。隨著青蒿素及其衍生物適應(yīng)癥的擴大，全球每年對青蒿素及其衍生物的需求量逐漸增加，黃花蒿天然產(chǎn)物生物合成保障策略因其容易操作、成本較低和產(chǎn)量保障，成為目前最理想和經(jīng)濟的保障策略。

2 青蒿素合成生物學(xué)保障

2.1 青蒿素合成生物學(xué)途徑

隨著青蒿素生物合成途徑的逐步闡明，其合成生物學(xué)研究也隨之發(fā)展起來。二氫青蒿酸和青蒿酸在青蒿素生物合成中通過酶促或非酶促的光氧化反應(yīng)生成青蒿素，但青蒿素最后一步生物合成的分子機制尚不明確，目前主要以合成生物學(xué)制備的青蒿酸為底物，再通過化學(xué)合成獲得青蒿素。

Keasling 等[53-54]使用合成生物學(xué)將紫穗槐-4,11-二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）和釀酒酵母細胞中的甲羥戊酸途徑（MVA）途徑引入大腸桿菌中，前體物質(zhì)紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量達到24 mg/L，進一步研究將HMG-CoA 合酶引入大腸桿菌，紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量達到27 mg/L；后續(xù)通過優(yōu)化法尼基焦磷酸生物合成途徑，以釀酒酵母細胞為底盤細胞，選擇青蒿酸為底物，將紫穗槐-4,11-二烯合酶（ADS）、細胞色素還原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）和細胞色素 P450 單加氧酶（amorphadiene-12-hydroxylase，CYP71AV1）在底盤細胞中表達，使得青蒿酸的產(chǎn)量達到153 mg/L[55]。研究表明，CEN.PK2 釀酒酵母更適合成為萜類化合物生物合成的底盤細胞，并可進一步優(yōu)化合成步驟實現(xiàn)青蒿酸的大量生成，例如：通過過表達甲羥戊酸途徑基因增加前體物質(zhì)累積；實現(xiàn)高密度發(fā)酵，使紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量達到40 g/L[56]；引入青蒿醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1），優(yōu)化發(fā)酵條件后得到的青蒿酸產(chǎn)量達到25 g/L[7]。

2.2 影響青蒿素合成生物學(xué)保障的主要因素

2.2.1 青蒿素生物合成途徑與關(guān)鍵酶基因的調(diào)控

明確的生物合成途徑是保證倍半萜類活性成分合成生物學(xué)順利進行的重要前提，因此國內(nèi)外學(xué)者開展解析青蒿素生物合成途徑的研究，為青蒿素及青蒿酸等活性成分的合成生物學(xué)研究提供支撐。如圖4所示，青蒿素生物合成途徑上游所需的2 分子異戊烯基焦磷酸（IPP）和1 分子二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)由細胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑（MVA）和質(zhì)體中的異戊二烯途徑（MEP）兩個途徑共同產(chǎn)生[57]。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)DS)通過催化異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)生成青蒿素的重要前體物質(zhì)法尼基焦磷酸（FPP）；進一步地，紫穗槐二烯合酶(ADS)催化FPP 環(huán)化產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯，這是合成途徑的第一個直接前體物質(zhì)；再通過CYP71AV1 和CPR 催化紫穗槐-4,11-二烯，經(jīng)三步氧化反應(yīng)產(chǎn)生青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸；青蒿醛通過青蒿醛雙鍵還原酶（artemisinic aldehyde delta11(13)-reductase，DBR2/DBR1）催化后被還原為雙氫青蒿醛，再由ALDH1 催化后轉(zhuǎn)化為雙氫青蒿酸；青蒿醛經(jīng)CYP71AV1、ALDH1 和CPR 催化后被氧化為青蒿酸。最后，雙氫青蒿酸通過非酶促的光氧化反應(yīng)生成青蒿素，青蒿酸可能經(jīng)歷了多步反應(yīng)合成青蒿乙素，最后由青蒿乙素轉(zhuǎn)化為青蒿素[58-59]。生物合成途徑的明確解析為利用合成生物學(xué)技術(shù)和改造大腸桿菌及酵母菌株生產(chǎn)合成青蒿素奠定了基礎(chǔ)。

圖4 青蒿素生物合成途徑

青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶調(diào)控研究使得基因工程手段能夠有效增加黃花蒿植株中青蒿素的含量。已報道合成途徑中HMGR，F(xiàn)PS，DXR，ALDH1，ADS，DBR2 等單基因過表達，但青蒿素含量增幅有限；因此通過多基因過表達可進一步增加青蒿素累積，例如ADS/CYP71AV1/CPR，CYP71AV1/CPR，HMGR/ADS，HMGR/FPS，F(xiàn)PS/CYP71AV1/CPR多基因組合；也可以通過下調(diào)競爭支路基因的表達，增加前體物質(zhì)FPP 流向青蒿素代謝途徑。因此，基因工程有效策略也能同時增強青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達。隨著分子調(diào)控機制研究的深入，WRKY、AP2/ERF、bZIP、bHLH 等轉(zhuǎn)錄因子也被發(fā)現(xiàn)參與青蒿素生物合成調(diào)控。例如Ma 等[60]克隆了一個WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子AaWRKY1，可促進ADS基因表達，從而增加青蒿素在植株內(nèi)的積累。AP2/ERF 類轉(zhuǎn)錄因子AaORA 在黃花蒿分泌型腺毛（GSTs）中特異性表達，轉(zhuǎn)基因植株中過表達AaORA基因可以上調(diào)ADS，CYP71AV1 和DBR2 關(guān)鍵基因的表達，從而促進青蒿素生物合成[61]。AabZIP1具有促進ADS和CYP71AV1 基因表達的作用[62]；AabHLH1也被報道能夠促進ADS和CYP71AV1基因表達，提高青蒿素的積累[63]；唐克軒[64]等報道了一個bHLH 轉(zhuǎn)錄因子AaMYC2 能夠提高CYP71AV1 和DBR2基因表達，從而促進青蒿素合成。此外，過表達和抑制AaMIXTA1基因，會分別導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因黃花蒿的GSTs數(shù)量和青蒿素含量的增加和降低，轉(zhuǎn)錄因子AaMIXTA1在青蒿腺分泌腺毛的生成和表皮膠質(zhì)層的生物合成中發(fā)揮作用[65]。此外，青蒿素調(diào)控核心轉(zhuǎn)錄因子AaORA 能夠與AaTCP14 形成復(fù)合物，在茉莉酸刺激下共同激活關(guān)鍵酶基因促進青蒿素的合成[61,66]。

2.2.2 青蒿素合成生物學(xué)的生物元件和底盤細胞開發(fā)

生物元件是經(jīng)過功能表征鑒定、編碼某種生物學(xué)功能的核苷酸序列。植物天然產(chǎn)物合成途徑的解析過程，實際上就是發(fā)現(xiàn)與鑒定參與合成反應(yīng)的關(guān)鍵酶編碼基因的過程。合成生物學(xué)將天然產(chǎn)物合成所必需的生物元件構(gòu)建成相應(yīng)的合成途徑，轉(zhuǎn)入到合適的底盤細胞中進行異源合成。開發(fā)和優(yōu)化青蒿素生物合成途徑各個關(guān)鍵酶基因的效率，如增加基因拷貝數(shù)、啟動子修飾、密碼子優(yōu)化等，能夠增加基因的表達效率，進而有效地提高工程菌中青蒿酸等重要前體物質(zhì)的產(chǎn)量[67]。其次，底盤細胞的性質(zhì)差異會對天然產(chǎn)物的產(chǎn)量造成較大影響，選擇適合該物種天然產(chǎn)物的底盤細胞是合成生物學(xué)的關(guān)鍵步驟。目前已報道使用的底盤細胞包括大腸桿菌、釀酒酵母、植物細胞和其他微生物。大腸桿菌是原核生物，也是所有工程菌中發(fā)展最早的一類，由于其適合表達不同基因產(chǎn)物，且易操作、生長速度較快、生長周期較短，成為合成生物學(xué)研究中首選的底盤細胞。已在大腸桿菌中合成青蒿酸[68]、紫穗槐-4, 11-二烯[69]等前體化合物。釀酒酵母是真核生物，更適合細胞色素P450 氧化酶等表達。釀酒酵母在青蒿素合成生物研究中占有重要的地位，可作為紫穗槐-4,11-二烯[70]、青蒿酸[71]和二氫青蒿酸[72]等重要中間產(chǎn)物的底盤細胞（圖5）。植物細胞也同樣具有精細的調(diào)控系統(tǒng)，雖然利用植物表達系統(tǒng)制備的萜類化合物產(chǎn)量較低，但植物表達系統(tǒng)也是獲得代謝產(chǎn)物種類最多的底盤細胞。通過煙草植株已獲得紫穗槐-4,11-二烯[73]、青蒿醇[74]、二氫青蒿醇[74]、青蒿酸糖苷[75]和青蒿素[76]代謝產(chǎn)物[70]。除以上底盤細胞外，曲霉也被報道用于生產(chǎn)和制備紫穗槐-4,11-二烯[77]。

圖5 青蒿素前體物質(zhì)的酵母工程菌研究

2.2.3 青蒿素合成生物學(xué)的工藝優(yōu)化

天然產(chǎn)物合成途徑的生物元件和底盤細胞開發(fā)僅僅是實現(xiàn)生物合成的前提條件，還需優(yōu)化合成生物學(xué)的工藝，目的保證有更多的代謝流進入青蒿素生物合成途徑，工藝優(yōu)化也是提高工程菌產(chǎn)量的關(guān)鍵。

青蒿素合成生物學(xué)的具體工藝優(yōu)化包括：一、增加前體物質(zhì)供應(yīng)和提高底物利用效率。首先，對代謝途徑上下游的基因進行改造或優(yōu)化可有效增加中間體產(chǎn)量，如增加目的基因拷貝數(shù)，修飾啟動子，密碼子優(yōu)化等。孔建強等[78]增加HMGR和FPP編碼基因拷貝數(shù)，有效提高紫穗槐-4,11-二烯含量。其次，青蒿素合成的特異途徑是在ADS 的競爭作用下將上游生成的部分FPP 引入青蒿素生物合成途徑。因此，將更多的FPP引流至青蒿素特異途徑是提高工程菌中青蒿素及中間體產(chǎn)量的重要措施。Keasling 等[55]強化表達MVA途徑全部關(guān)鍵基因，增加前體FPP 的積累，是提高工程菌產(chǎn)量的有效方式，這一措施使得前體物質(zhì)的合成擁有充足的代謝流。同時應(yīng)當(dāng)減少前體物質(zhì)的流失，除了合成青蒿素，F(xiàn)PP 同樣也是其他倍半萜類化合物的前體物質(zhì)，應(yīng)抑制青蒿素的競爭支路基因表達，減少FPP 流入其他途徑，增加FPP 流入青蒿酸合成途徑并提高其產(chǎn)量[69,78]。最后，通過異源底盤細胞重構(gòu)代謝途徑，使用活性更強的同工酶代替原來途徑的酶，增加重構(gòu)代謝途徑中酶的催化效率，可有效增加工程菌中目的代謝物產(chǎn)量。通過上述有效措施，可增加底物利用效率，在提高單個基因效率的同時也優(yōu)化平衡整條代謝途徑，對最終產(chǎn)物的影響也是最直接的。

二、優(yōu)化培養(yǎng)和生產(chǎn)條件。培養(yǎng)條件對工程菌產(chǎn)生青蒿素及其前體物質(zhì)有相當(dāng)大的影響。如在發(fā)酵大腸桿菌工程菌生產(chǎn)青蒿酸時去除有機相覆膜可顯著提升青蒿酸的產(chǎn)量[68]。在發(fā)酵制備紫穗槐-4,11-二烯過程中加入有機相，紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量顯著增加[69]。因此，選擇適當(dāng)?shù)臈l件優(yōu)化可針對不同對象進行設(shè)計。此外，不利的細胞質(zhì)環(huán)境阻止后期青蒿素前體的形成也是青蒿素含量低的原因。為了克服這一限制，F(xiàn)arhi 等[76]在煙草中異源合成青蒿素，利用信號肽cox4與ADS 融合表達，再通過質(zhì)體導(dǎo)肽將CYP71AV1、DBR2、CPR 定位于葉綠體內(nèi)，最后在葉綠體中引入整條酵母MVA途徑增加萜類前體供應(yīng)，獲得的煙草植株中青蒿素高達0.8 mg。該研究有效提高轉(zhuǎn)基因煙草中二氫青蒿酸的表達量，高效地將二氫青蒿酸氧化為青蒿素。

通過合成生物學(xué)制備青蒿素及其中間體的研究成功，無論對青蒿素本身還是對未來天然藥物的生產(chǎn)格局都會產(chǎn)生深遠的影響。通過合成生物學(xué)制備青蒿素，不受環(huán)境和土地的制約, 能在短時間內(nèi)獲得大量的青蒿素, 能穩(wěn)定世界市場上青蒿素的供應(yīng), 有效地降低青蒿素的價格,有利于控制瘧疾在貧困國家的肆虐。

3 青蒿素化學(xué)合成保障

3.1 青蒿素化學(xué)合成途徑

青蒿素是一個含過氧基團的倍半萜內(nèi)酯化合物,過氧基以內(nèi)型方式固定在兩個四級碳上從而形成橋型結(jié)構(gòu)，這一特殊結(jié)構(gòu)的化學(xué)全合成極具挑戰(zhàn)性。1983 年, 瑞士科學(xué)家Schmid 和Hofheinz[8]首次實現(xiàn)了青蒿素的化學(xué)全合成路線，總收率為4.9%。1986 年，周維善研究組[9]經(jīng)13 步反應(yīng)以5.6%的總收率得到青蒿素。此外，根據(jù)報道已有十幾條化學(xué)合成路徑從光學(xué)活性的倍半萜或單萜起始成功獲得青蒿素，其中關(guān)鍵步驟為過氧基團的引入。2011和2012年，伍貽康研究組[79]和張萬斌研究組[80]分別使用不同的非光照氧化條件引進過氧基團，以高收率獲得了青蒿素。

青蒿素的化學(xué)合成根據(jù)起始原料的復(fù)雜程度可以劃分為化學(xué)全合成和半合成兩種類型。第一類化學(xué)全合成，總體路線長且反應(yīng)總收率較低。同時，大都需用到光化學(xué)反應(yīng)條件，部分反應(yīng)需要低溫條件進行，其設(shè)備要求高，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。第二類半合成，總體路線縮短且反應(yīng)總收率大幅提高，但由于半合成起始原料結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有一定的工業(yè)化難度。因此，目前以合成生物學(xué)技術(shù)制備的青蒿酸為原料，再通過無需光照的化學(xué)氧化反應(yīng)合成青蒿素。該策略在前期研究基礎(chǔ)上以較短的合成路線，溫和、簡便的反應(yīng)條件實現(xiàn)青蒿素的高效人工合成，成為人工合成青蒿素工業(yè)化生產(chǎn)的首選方案。

3.2 影響青蒿素化學(xué)合成保障的主要因素

3.2.1 理論依據(jù)與實施效率

合理的青蒿素化學(xué)合成理論依據(jù)即合成路線的設(shè)計與探索，標志著合成路線的可行性，同時為進一步實現(xiàn)青蒿素化學(xué)合成工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅實的基礎(chǔ)。其次，化學(xué)合成路線的實施效率決定理論依據(jù)的可靠性，合成路線的縮短和青蒿素或重要中間產(chǎn)物收率的提升，有效降低工業(yè)化生產(chǎn)成本并增加收益。

第一階段為化學(xué)全合成。（1）以香茅醛為原料。1996年周維善經(jīng)13步反應(yīng)，以香茅醛為原料完成青蒿素合成，雖然收率低于1%，但實現(xiàn)了青蒿素的立體選擇性全合成[9]。2010 年Yadav 等[81]經(jīng)過9 步反應(yīng)完成光氧化反應(yīng)合成青蒿素，但由于最后一步光氧化反應(yīng)效率較低，總收率為5%。（2）以薄荷酮為原料。1992年Avery 等[82]以薄荷酮為原料，經(jīng)10 步反應(yīng)完成青蒿素全合成，最后采用一鍋法經(jīng)多步復(fù)雜的環(huán)化反應(yīng)得到青蒿素，收率為5%。（3）以環(huán)己烯酮為原料。2012年Cook 等[83]通過串聯(lián)反應(yīng)，通過5 步簡潔的合成青蒿素，總收率達到10%以上。其中以鉬酸銨為催化分解得到單線態(tài)氧，氧化物中間體最終轉(zhuǎn)化為青蒿素總收率為29-42%，最終達到幾十克級別規(guī)模。后續(xù)又出現(xiàn)以異胡薄荷醇、檸檬烯、β-蒎烯等為原料的全合成路線，但青蒿素總收率都不高。

第二階段為化學(xué)半合成。圍繞以合成生物獲得的青蒿酸為原料，即以青蒿素仿生合成為目的進行探索，實現(xiàn)合成生物與化學(xué)合成攜手完成全合成的過程。1986 年Jung 等[84]嘗試以青蒿酸為原料合成青蒿素，雖遺憾地沒有獲得青蒿素，但反應(yīng)結(jié)果得到了重要代謝中間產(chǎn)物脫氧青蒿素5k，為研究青蒿素半合成奠定了基礎(chǔ)。1989年，Ye等[85]使用重氮甲基化經(jīng)多步反應(yīng)最終得到青蒿素，總產(chǎn)率高達37%，是非常具有工業(yè)化價值的合成方法。此外，1992年P(guān)eter等[86]以青蒿酸或青蒿素B 半合成得到青蒿素。2011 年上海有機所伍貽康等[79]參考并優(yōu)化Peter 的合成方法，使青蒿素產(chǎn)率達到近70%。2012年上海交通大學(xué)張萬斌等[80]采用RuPHOX-Ru 為催化劑用于青蒿酸的不對稱催化氫化反應(yīng)，最終收率達到了60%，這一技術(shù)已完成青蒿素公斤級合成放大試驗，并與企業(yè)合作并投入工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2.2 技術(shù)條件和制備工藝

青蒿素化學(xué)合成中光化學(xué)反應(yīng)是最關(guān)鍵的一步，光照條件增加了設(shè)備的復(fù)雜性和合成成本。這一苛刻的反應(yīng)條件是阻礙青蒿素化學(xué)合成實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的一個重要因素。如果希望該光化學(xué)反應(yīng)充分進行，只能以盡量小規(guī)模的方式進行，難以滿足市場對青蒿素用量的需求。如果采用分步式工藝，所使用的化學(xué)反應(yīng)罐規(guī)格雖然較大，卻很難保證光線均勻照到反應(yīng)罐內(nèi)部，從而降低光化學(xué)反應(yīng)的效率。賽諾菲通過設(shè)備改造使反應(yīng)液經(jīng)過一個管道，然后用光束照射玻璃管，但此舉造成設(shè)備成本大大增加，該工藝也因為設(shè)備代價大、合成成本高等原因而停產(chǎn)[87]?？梢?，要實現(xiàn)青蒿素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，還需要探索非光照條件下的高效人工合成方法。其次，實驗中青蒿素制備收率低，二氫青蒿酸反應(yīng)選擇性差導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難等問題，同樣也是制約青蒿素化學(xué)合成發(fā)展的重要因素。

青蒿素的化學(xué)合成，可以通過新反應(yīng)、新試劑和新路線，合成毫克級或克級的產(chǎn)物，并且市場現(xiàn)有的實驗設(shè)備、工業(yè)設(shè)備非常成熟和完善。化學(xué)合成是通過人工設(shè)計的合成路線，以經(jīng)典的有機反應(yīng)進行，具有更強的可控性。青蒿素合成生物開發(fā)了由單糖制備青蒿酸的可產(chǎn)業(yè)化合成工藝，精確地完成每一步反應(yīng)并保持幾乎100%的立體選擇性和區(qū)域選擇性，但由青蒿酸形成過氧鍵合成青蒿素的步驟成為合成生物學(xué)的難點?；瘜W(xué)合成方法則攻克這一難點，實現(xiàn)了由青蒿酸到青蒿素的高效化學(xué)合成工藝，從而打通了青蒿素人工合成的全產(chǎn)業(yè)鏈。合成生物學(xué)結(jié)合化學(xué)合成的方法是實現(xiàn)青蒿素大規(guī)模生產(chǎn)的一種有效生產(chǎn)模式，也將穩(wěn)定或降低青蒿素的價格，成為生產(chǎn)青蒿素的重要供應(yīng)來源之一。

4 結(jié)論和展望

本文從青蒿素天然產(chǎn)物生物合成、合成生物和化學(xué)合成的各個環(huán)節(jié)詳述了青蒿素資源保障策略要點。青蒿素的全球年需求量約260 噸，中國提供約240 噸。目前，中國市場上最經(jīng)濟和主要獲取青蒿素的方法是通過黃花蒿植物提取。隨著全球每年對青蒿素及其衍生物的需求量逐漸增加，栽培黃花蒿藥材成為目前市場應(yīng)用最理想的保障策略。而當(dāng)栽培的黃花蒿藥材在產(chǎn)量、栽培品種以及提取工藝達到最高值限制時，合成生物學(xué)能在短時間內(nèi)獲得大量的青蒿酸，不受環(huán)境和土地的制約,能穩(wěn)定世界市場上青蒿素的供應(yīng)，有效地降低價格，利于控制瘧疾在貧困國家的肆虐。通過結(jié)合合成生物學(xué)和化學(xué)合成的半合成能夠獲得大量的青蒿素，這一成熟的半合成體系是目前工業(yè)化生產(chǎn)青蒿素最常用的方法。通過栽培、合成生物學(xué)和化學(xué)合成多種方法的實施全面保障了青蒿素資源的來源，有利于青蒿素產(chǎn)業(yè)的標準化和可持續(xù)化，使黃花蒿資源和青蒿素的使用和安全得到保障，也為紫杉醇、長春堿、人參皂苷、丹參素、紅景天苷、天麻素等天然產(chǎn)物的資源保障提供重要參考價值。