王亢宗，李 敏，田濟(jì)銘，張嘉頎，薛哲勇，宋 偉，華 欣

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 哈爾濱 150006）

重樓皂苷（polyphyllin）是重樓植物（Paris polyphylla）中一類重要次生代謝產(chǎn)物，已被報(bào)道具有多種良好的藥理活性，包括抗腫瘤，抗氧化，抗炎，抗菌，促凝血，修復(fù)胃黏膜等[1-9]。重樓皂苷結(jié)構(gòu)多樣，以薯蕷皂苷型和偏諾皂苷型為主。植物中通過(guò)甲羥戊酸途徑合成2,3-氧化鯊烯，由環(huán)阿屯醇合酶環(huán)氧化形成環(huán)阿屯醇，再經(jīng)過(guò)去甲基、還原、異構(gòu)、羥化等多步反應(yīng)合成薯蕷皂苷元（diosgenin），薯蕷皂苷元C-17位的氫被羥基取代，形成偏諾皂苷元（pennogenin）[10-11]。而后，在苷元C-3 和C-26 位連接D-葡萄糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖，進(jìn)而產(chǎn)生多種重樓皂苷。近年來(lái)，含C17α-OH 的甾體天然產(chǎn)物因其有趣的結(jié)構(gòu)和多樣的生物活性而受到廣泛關(guān)注，C17α-OH 的存在對(duì)它們的生物活性至關(guān)重要，因此如何大量獲得含C17α-OH 的甾體的骨架對(duì)該類化合物的研究具有重要的意義。

偏諾皂苷元通常與糖基結(jié)合形成糖苷，在植物中穩(wěn)定存在，其自身幾乎不能通過(guò)常規(guī)酸水解分離提取[12]。同時(shí)，對(duì)包括七葉一枝花在內(nèi)的多種重樓屬植物資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)造成了其資源匱乏[13]。目前已有利用化學(xué)方法合成偏諾皂苷元的報(bào)道，例如在薯蕷皂苷元引入C17α-OH，但存在反應(yīng)步驟繁瑣、條件苛刻、產(chǎn)率低、毒副作用等問(wèn)題。近年，已有一些使用商業(yè)酶轉(zhuǎn)化苷類獲得苷元的研究，具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、無(wú)污染和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[14-17]。因此，通過(guò)商業(yè)酶轉(zhuǎn)化偏諾類皂苷，可能成為大量制備偏諾皂苷元的可行方法。蝸牛酶是從蝸牛的嗉囊和消化道中提取的一種混合酶[9]，目前已明確其含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶，具有很強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化能力，能夠特異性切割β-D-吡喃葡萄糖苷鍵。重樓皂苷VI是在偏諾皂苷元C-3位連接二糖，相對(duì)較易提取分離，適合作為轉(zhuǎn)化的原料。本文研究了蝸牛酶轉(zhuǎn)化重樓皂苷VI獲得偏諾皂苷元的制備條件，確定了影響轉(zhuǎn)化率的多個(gè)因素，通過(guò)響應(yīng)面分析法確定了最佳酶解條件，開(kāi)發(fā)了一種利用蝸牛酶在較短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化重樓皂苷VI制備偏諾皂苷元的水解方法，且具有較高的產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，包括紫外檢測(cè)器（美國(guó)Thermo 公司）；恒溫混勻儀MTH-100（杭州米歐儀器有限公司）；真空離心濃縮儀CV200（北京吉艾姆科技有限公司）；萬(wàn)分之一電子天平SQP（德國(guó)Sartorius公司）；超聲波清洗機(jī)SB-5200DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司）；PB-10 型pH 計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）。

重樓皂苷VI標(biāo)準(zhǔn)品（成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司）；蝸牛酶（BBI生命科學(xué)有限公司）；色譜甲醇、乙腈（德國(guó)Merck公司）；其余試劑為分析純。

1.2 蝸牛酶轉(zhuǎn)化重樓皂苷VI反應(yīng)體系構(gòu)建

稱取重樓皂苷VI 20.0 mg，與適量蝸牛酶加入20.0 mL 乙酸鈉緩沖液中，適宜溫度下反應(yīng)一定時(shí)間后，加入等量體積的甲醇終止反應(yīng)，在真空離心濃縮儀中干燥。反應(yīng)沉淀用色譜甲醇溶解濃縮，0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液通過(guò)高效液相色譜分離獲得偏諾皂苷元。色譜條件：Hypersil GOLD C18 液相色譜柱（250×10 mm，5 μm）；流動(dòng)相為高純水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0-2 min，30-40% B；2-6 min，40-80% B；6-7 min，80-100% B；7-13 min，100% B；13-15 min，100-30% B）；流速5.0 mL·min-1，柱溫30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，進(jìn)樣量100 μL。

1.3 偏諾皂苷元轉(zhuǎn)化率測(cè)定

色譜條件：HypersilGOLD C18 液相色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為高純水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0-3 min，50% B；3-5 min，50-80% B；5-10 min，80-100% B；10-13 min，100% B；13-14 min，100-50%B；14-15 min，50% B）；流速1.0 mL·min-1，柱溫30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，進(jìn)樣量10 μL。轉(zhuǎn)化率=SHPLC(偏諾皂苷元)/SHPLC(偏諾皂苷元)+SHPLC(重樓皂苷VI)。

1.4 重樓皂苷VI和偏諾皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取重樓皂苷VI 標(biāo)準(zhǔn)品以及分離獲得的偏諾皂苷元，加色譜甲醇分別稀釋成100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、15 μg·mL-1、5 μg·mL-1溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，通過(guò)線性化獲得重樓皂苷VI與偏諾皂苷元的回歸方程，。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置酶用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH 值四個(gè)因素實(shí)驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)中重樓皂苷VI 用量為100 μg，反應(yīng)體積300 μL。其中，反應(yīng)時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)固定酶用量為0.5 mg，反應(yīng)溫度37°C，pH = 5.0，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為12 h、24 h、36 h、48 h、72 h；酶用量梯度實(shí)驗(yàn)固定反應(yīng)時(shí)間為24 h，反應(yīng)溫度37°C，pH 5.0，酶用量分別為0.1 mg、0.2 mg、0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg；反應(yīng)溫度梯度實(shí)驗(yàn)固定反應(yīng)時(shí)間為24 h，酶用量為0.5 mg，pH=5.0，反應(yīng)溫度分別為20°C、28°C、37°C、50°C、60°C；反應(yīng)pH 梯度實(shí)驗(yàn)設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為24 h，酶用量為0.5 mg，反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。

1.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)三水平四因素的正交實(shí)驗(yàn)（表1）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

以單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為輸入數(shù)據(jù)，利用python statsmodels v0.13.1庫(kù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，遞增degree 值，計(jì)算相應(yīng)的R-squared 值，選擇首個(gè)R-squared 極大值對(duì)應(yīng)的模型作為擬合結(jié)果；以單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為輸入數(shù)據(jù)，利用Design Expert 12 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過(guò)多次擬合下每個(gè)因素對(duì)應(yīng)的pvalue值確定模型的最終結(jié)果，并求解最優(yōu)反應(yīng)條件及轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果

2.1 偏諾皂苷元的制備與鑒定

經(jīng)過(guò)液相色譜檢測(cè)，重樓皂苷VI標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為7 min。蝸牛酶將重樓皂苷VI酶解后，在10.5 min出現(xiàn)了新的產(chǎn)物峰（圖1）。收集足量的產(chǎn)物后，通過(guò)核磁分析，與報(bào)道的數(shù)據(jù)比對(duì)，確認(rèn)酶解后的產(chǎn)物為偏諾皂苷元。核磁結(jié)果如下，偏諾皂苷元：白色粉末;1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δH0.81 (3H, d,J= 6.0 Hz,H-27), 0.85 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, d,J= 7.5 Hz, H-21), 1.05 (3H, s, H-19), 3.50 (1H, m, H-3), 4.02 (1H,dd,J= 7.5 Hz, 6.5 Hz, H-16), 5.36 (1H, m, H-6);13CNMR (125MHz, CD3OD)δC38.5 (C-1), 33.2 (C-2), 72.4(C-3), 43.0 (C-4), 142.3 (C-5), 122.2 (C-6), 32.3 (C-7),32.9 (C-8), 51.4 (C-9), 37.8 (C-10), 21.7 (C-11), 32.5(C-12), 45.5 (C-13), 53.9 (C-14), 31.3 (C-15), 90.6 (C-16), 91.3 (C-17), 17.49 (C-18), 19.9 (C-19), 45.8 (C-20), 9.1 (C-21), 110.9 (C-22), 32.1 (C-23), 29.4 (C-24),33.3(C-25),67.7(C-26),17.52(C-27)。

圖1 高效液相分離重樓皂苷VI與蝸牛酶的酶解產(chǎn)物

2.2 偏諾皂苷元轉(zhuǎn)化率單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)偏諾皂苷元轉(zhuǎn)化率的影響

控制酶解反應(yīng)溫度為37°C、酶用量為0.5 mg（每100 μg 底物），反應(yīng)pH 5.0，轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的變化如圖2A 所示。回歸模型的degree 值設(shè)為2，模型Rsquared 值約為0.99，表明回歸模型較好的擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。模型顯示在此條件下，酶解反應(yīng)時(shí)間在12 h到40 h 的區(qū)間中，轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化近似一次函數(shù)，此時(shí)若繼續(xù)增加酶用量或提高酶效率反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加快；60 h 后反應(yīng)幾乎達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)酶量已經(jīng)不是制約轉(zhuǎn)化率的因素。根據(jù)此結(jié)果，后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為24 h、48 h和72 h三個(gè)水平。

2.2.2 酶用量對(duì)偏諾皂苷元轉(zhuǎn)化率的影響

控制酶解反應(yīng)溫度為37°C、反應(yīng)時(shí)間為24 h，反應(yīng)pH 5.0，轉(zhuǎn)化率隨酶用量的變化如圖2B所示。回歸模型的degree 值設(shè)為3，模型R-squared 值約為0.99，表明回歸模型較好的擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。模型顯示在此條件下，酶用量在0.1 mg至0.5 mg的區(qū)間中，轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化近似一次函數(shù)，此時(shí)若繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間或提高酶效率，轉(zhuǎn)化率會(huì)進(jìn)一步上升；酶用量在1.5 mg左右反應(yīng)幾乎達(dá)到平衡，此時(shí)即使增加反應(yīng)時(shí)間轉(zhuǎn)化率也不會(huì)有大的增加。根據(jù)此結(jié)果，后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)反應(yīng)酶用量設(shè)置為0.5 mg（每100 μg 底物）、1.0 mg（每100 μg底物）和1.5 mg（每100 μg底物）三個(gè)水平。

2.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)偏諾皂苷元轉(zhuǎn)化率的影響

控制酶解反應(yīng)時(shí)間為24 h，酶用量為0.5 mg（每100 μg 底物），反應(yīng)pH 5.0，轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)溫度的變化如圖2C 所示?；貧w模型的degree 值設(shè)為4，模型Rsquared 約為0.99，表明回歸模型較好的擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。模型顯示在此條件下轉(zhuǎn)化率在20°C 到35°C 的區(qū)間中上升，在35°C 至40°C 間有最大的轉(zhuǎn)化率，40°C 后開(kāi)始下降，并在60°C 附近趨于平穩(wěn)。根據(jù)此結(jié)果，可以確定此條件下轉(zhuǎn)化率峰值出現(xiàn)在30°C 至50°C 之間，據(jù)此，后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)置反應(yīng)溫度為28°C、37°C和50°C三個(gè)水平。

2.2.4 反應(yīng)pH值對(duì)偏諾皂苷元轉(zhuǎn)化率影響

控制酶解反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為24 h，酶用量為0.5 mg（每100μg 底物），轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)pH 值的變化如圖2D 所示?；貧w模型的degree 值設(shè)為3，模型R-squared約為0.99，表明回歸模型較好的擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。模型顯示在此條件下，反應(yīng)pH 值在4.0 至5.0 的區(qū)間中，轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)pH 快速上升，反應(yīng)pH 值在6.0至8.0 的區(qū)間中轉(zhuǎn)化率隨pH 值下降。值得一提的是，相較前三個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)，即使在條件設(shè)置完全相同的實(shí)驗(yàn)下，此梯度實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)化率也有近3倍提升（補(bǔ)充表1-表4），我們通過(guò)測(cè)定的重樓皂苷VI 和偏諾皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算了各梯度實(shí)驗(yàn)上樣溶液理論初始重樓皂苷VI 含量，在另外3 組實(shí)驗(yàn)中，這個(gè)值穩(wěn)定在4.5-5.5 μg·μL-1，而在pH 梯度實(shí)驗(yàn)中則在6.0-15.0 μg·μL-1波動(dòng)（補(bǔ)充表1-表4），這可能源于加樣量誤差導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)體系波動(dòng)，故在之后的模型建立中刪除此部分?jǐn)?shù)據(jù)。此結(jié)果雖然不能真實(shí)的反映pH 值和轉(zhuǎn)化率的關(guān)系，但結(jié)合以往的報(bào)道，此條件下轉(zhuǎn)化率的峰值應(yīng)出現(xiàn)在pH 值為5.0 至6.0 的區(qū)間中，依此，設(shè)置后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)反應(yīng)pH值為4.5、5、6三個(gè)水平。

圖2 單因素考察蝸牛酶轉(zhuǎn)化重樓皂苷VI的轉(zhuǎn)化率

2.3 偏諾皂苷元轉(zhuǎn)化率正交實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置與產(chǎn)率見(jiàn)表1。將正交實(shí)驗(yàn)與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果合并（剔除可能因?qū)嶒?yàn)操作帶入誤差的pH梯度實(shí)驗(yàn)），使用Design Expert 12 進(jìn)行響應(yīng)面分析，根據(jù)每次回歸模型每個(gè)因素及其交叉項(xiàng)的置信度（pvalue＜=0.05）迭代模型以確定最終模型。模型擬合概要如表2所示，擬合結(jié)果表明，二次方程擬合具有最高的置信度和最大的R-squerd，可以很好的解釋實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。簡(jiǎn)化二次模型方差分析如表3 所示，模型和參與模型的每一項(xiàng)因素的p-value 均小于0.05，且lack of fit大于0.1，表明由這些因素構(gòu)建的模型可以較好的擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，設(shè)pH 值為A，酶用量為B，溫度為C，時(shí)間為D，轉(zhuǎn) 化 率 為Y×100%，則 模 型 為Y = -4.42669 +1.35859A + 0.676821B + 0.029450C + 0.013159D -0.003588BD-0.127014A2-0.181855B2-0.000406C2-0.000071D2。該模型表明，酶用量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響不是獨(dú)立的（圖3），其他條件一定，更少的酶用量則需要更多的時(shí)間來(lái)達(dá)到反應(yīng)平衡態(tài)；反應(yīng)溫度和pH 對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響是獨(dú)立的。依此模型，計(jì)算使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大的最優(yōu)因素水平約為：反應(yīng)酶用量1.26 mg（每100μg底物），反應(yīng)時(shí)間60.7 h，反應(yīng)溫度36.3°C，pH 5.35；預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)化率約為57%。

圖3 酶用量與反應(yīng)時(shí)間相互作用對(duì)偏諾皂苷元產(chǎn)率的影響

表2 模型擬合概要

表3 簡(jiǎn)化二次模型方差分析

2.4 模型性能驗(yàn)證

在實(shí)際應(yīng)用中，往往希望在轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)時(shí)間兩者中尋找一個(gè)平衡點(diǎn)，即在較短的時(shí)間內(nèi)獲得較高的轉(zhuǎn)化率，我們?cè)O(shè)置了3組反應(yīng)，即限制反應(yīng)時(shí)間分別在24 h、36 h、48 h 內(nèi)，計(jì)算這3 個(gè)條件下的最高轉(zhuǎn)化率。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間設(shè)置在24 h 內(nèi)，模型最優(yōu)條件為：反應(yīng)pH=5.348、酶用量為1.624 mg（每100 μg 底物）、溫度為36.261°C、反應(yīng)時(shí)間為24 h，理論產(chǎn)率為49.5%；為方便實(shí)驗(yàn)操作，我們使用反應(yīng)pH 為5.35，酶用量為1.6 mg（每100μg底物），反應(yīng)溫度為37°C進(jìn)行驗(yàn)證，求得平均產(chǎn)率為47.0%，與理論產(chǎn)率誤差為5%。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間設(shè)為36 h 內(nèi)，模型最優(yōu)條件為：反應(yīng)pH = 5.348，酶用量1.512 mg（每100 μg底物），反應(yīng)溫度為36.260°C，反應(yīng)時(shí)間為36 h，理論產(chǎn)率為53.4%；為方便實(shí)驗(yàn)操作，我們使用反應(yīng)pH = 5.35，酶用量為1.5 mg（每100 μg 底物），反應(yīng)溫度為37°C 進(jìn)行驗(yàn)證，求得平均產(chǎn)率為51.5%，與理論產(chǎn)率誤差為3.5%。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間設(shè)為48 h 以內(nèi)，模型最優(yōu)條件為：反應(yīng)pH = 5.348，酶用量為1.388 mg（每100 μg底物），反應(yīng)溫度為36.265°C、反應(yīng)時(shí)間為48 h，理論產(chǎn)率為55.8%；為方便實(shí)驗(yàn)操作，我們使用反應(yīng)pH = 5.35，酶用量為1.4 mg（每100 μg底物），反應(yīng)溫度為37°C 進(jìn)行驗(yàn)證，求得平均產(chǎn)率為53.8%，與理論產(chǎn)率誤差為3.6%。三次驗(yàn)證的實(shí)際產(chǎn)率和理論產(chǎn)率的誤差都在5%以內(nèi)，證明了我們模型的準(zhǔn)確性。

3 討論

本研究通過(guò)高效液相分離和核磁分析，制備并鑒定了偏諾皂苷元。相比天然提取與化學(xué)法合成偏諾皂苷元，蝸牛酶水解重樓皂苷VI制備偏諾皂苷元具有廉價(jià)，反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高，位點(diǎn)特異性強(qiáng)，污染率低等優(yōu)勢(shì)，適合實(shí)驗(yàn)室制備，且可能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。但受限于實(shí)驗(yàn)條件，我們無(wú)法進(jìn)行中試以確定其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的潛力。本研究比較了反應(yīng)時(shí)間、酶用量，反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH 值對(duì)蝸牛酶水解重樓皂苷VI 轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果表明這4 個(gè)因素在一定取值范圍內(nèi)都與反應(yīng)效率有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)。其中，隨著反應(yīng)時(shí)間和酶用量的升高，轉(zhuǎn)化率首先升高，繼而維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平；而隨著反應(yīng)溫度和pH 的升高，轉(zhuǎn)化率則經(jīng)歷一個(gè)先升后降的過(guò)程，表明過(guò)高或過(guò)低的溫度和pH 會(huì)降低蝸牛酶的活性，同時(shí)也會(huì)影響酶反應(yīng)本身的平衡態(tài)。在4 個(gè)因素中，反應(yīng)時(shí)間和酶用量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響是交互的，這是因?yàn)闀r(shí)間和酶用量本身并不影響最終反應(yīng)平衡態(tài)，如果將反應(yīng)達(dá)到平衡理解為反應(yīng)完成，則它們對(duì)產(chǎn)率的影響實(shí)則是對(duì)該條件下時(shí)間節(jié)點(diǎn)此反應(yīng)完成到什么程度的影響，而時(shí)間和酶用量的變化本質(zhì)上是在這個(gè)樣本空間下有多少底物與酶接觸這一潛在因子。而溫度和pH 則更直接地改變酶本身的性質(zhì)和反應(yīng)的平衡態(tài)。對(duì)于溫度，較高時(shí)酶分子內(nèi)較弱的相互作用，如范德華力、氫鍵等被破壞，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響酶催化活性，而水解反應(yīng)本身是吸熱反應(yīng)，溫度較低時(shí)反應(yīng)更難發(fā)生，同時(shí)酶活也下降。對(duì)于pH，過(guò)堿的pH 不利于糖苷酶從溶劑中獲取質(zhì)子，過(guò)酸的條件不利于糖苷酶釋放質(zhì)子攻擊糖苷[18]，他們從不同層面影響反應(yīng)速率的同時(shí)還影響反應(yīng)的平衡狀態(tài)，但究竟是一者不會(huì)響應(yīng)另一者改變，還是二者對(duì)酶與反應(yīng)平衡的影響復(fù)雜且微妙而難以捕獲尚不明確。此外，目前有研究顯示一些金屬離子可以促進(jìn)部分β-葡萄糖苷酶的活性[21]，但在蝸牛酶相關(guān)的β-葡萄糖苷酶報(bào)道中，金屬離子普遍被認(rèn)為抑制酶的水解活性[15,22]。我們尚未從蝸牛酶中分離出催化重樓皂苷VI水解的純酶，但若能基于明確的酶分子結(jié)構(gòu)，研究酶與金屬離子間分子上的互作與酶活力的關(guān)系將有助于提升反應(yīng)產(chǎn)率，揭示激活抑制作用機(jī)制，從而為后續(xù)放大實(shí)驗(yàn)以及工業(yè)化提供理論指導(dǎo)。

蝸牛酶是一種含有β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶的粗糖苷酶。劉欣等從蝸牛酶中分離純化出對(duì)人參皂苷Rbl具有較高水解活性的β-葡萄糖苷酶[19]，因此我們推測(cè)蝸牛酶中主要起到水解作用的成分是葡萄糖苷酶。目前，有研究表明蝸牛酶能水解蘆?。╮utin）末端的葡萄糖苷鍵，直接生成槲皮素（quercetin），而沒(méi)有鼠李糖苷斷裂的中間產(chǎn)物異槲皮苷（isoquercetin）形成[20]。同時(shí)，未見(jiàn)蝸牛酶成分中有鼠李糖苷酶的相關(guān)報(bào)道，在液相色譜檢測(cè)時(shí)也未發(fā)現(xiàn)中間產(chǎn)物偏諾皂苷元-3-O-葡萄糖苷的積累。因此我們認(rèn)為蝸牛酶不具備水解鼠李糖苷鍵的能力。我們推測(cè)，重樓皂苷VI 經(jīng)過(guò)蝸牛酶中的β-葡萄糖苷酶作用，斷裂C-3 位末端的葡萄糖苷鍵，脫掉二糖生成偏諾皂苷元（圖4）。因此。為方便轉(zhuǎn)化率的計(jì)算，我們使用：

圖4 蝸牛酶水解重樓皂苷VI生成偏諾皂苷元

在一定范圍內(nèi)，重樓皂苷VI和偏諾皂苷元色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線是一次的，令S表示峰面積、m表示質(zhì)量、k表示標(biāo)準(zhǔn)曲線一次項(xiàng)系數(shù)、c表示常數(shù)項(xiàng)系數(shù)，1和2分別表示（終止反應(yīng)時(shí)色譜體系中）重樓皂苷VI 和偏諾皂苷元，則有S1 = k1m1 + c1、S2 = k2m2 + c2。令t 表示體系中初始重樓皂苷質(zhì)量，m3 表示發(fā)生轉(zhuǎn)化的重樓皂苷VI，Mr表示相對(duì)分子質(zhì)量，則有：

轉(zhuǎn)化率=，即轉(zhuǎn)化率是隨體系中轉(zhuǎn)化的重樓皂苷VI 增加的單調(diào)函數(shù)。令轉(zhuǎn)化率為α即α=，則有，對(duì)其求導(dǎo)并化簡(jiǎn)，得K2tC - K2tc2+k1tc2，其中K2= k2，C=c1+ c2+ k1t，帶入得k2tc1+k1k2t2+ k1tc2；其中，k1，k2表示標(biāo)準(zhǔn)曲線一次項(xiàng)系數(shù)，所以k1＞0，k2＞0；t 為體系中初始重樓皂苷VI 質(zhì)量，即t＞0；c1，c2分別表示標(biāo)準(zhǔn)曲線常數(shù)項(xiàng)系數(shù)，其實(shí)際含義應(yīng)為測(cè)量?jī)x器對(duì)重樓皂苷VI和偏諾皂苷元的底噪，理想條件下應(yīng)當(dāng)大于等于0，在我們實(shí)際實(shí)驗(yàn)測(cè)量下，分 別 為0.0041 和0.0733（見(jiàn)補(bǔ)充表5-表8）；則的導(dǎo)數(shù)在我們實(shí)驗(yàn)的條件下恒大于0，即其在轉(zhuǎn)化率α在區(qū)間（0，1）中是單調(diào)遞增的，因此是轉(zhuǎn)化率α 在區(qū)間（0，1）上的單調(diào)遞增函數(shù)，通過(guò)來(lái)替代轉(zhuǎn)化率α 以簡(jiǎn)化計(jì)算是科學(xué)的，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

最后，本研究建立的模型預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)化率和實(shí)際轉(zhuǎn)化率誤差在5%以內(nèi)，說(shuō)明模型對(duì)提高蝸牛酶轉(zhuǎn)化重樓皂苷VI 的效率有指導(dǎo)意義。單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)中重樓皂苷VI 的轉(zhuǎn)化率最高為48.6%，在模型預(yù)測(cè)的優(yōu)化條件下，反應(yīng)36 h轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到51.5%，在節(jié)省四分之一時(shí)間的同時(shí)產(chǎn)率提高了3%。反應(yīng)優(yōu)化后的偏諾皂苷元得率高，耗時(shí)短，成本低，可能對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有指導(dǎo)作用。

補(bǔ)充表1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果（pH梯度實(shí)驗(yàn)）

補(bǔ)充表2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果（反應(yīng)溫度梯度實(shí)驗(yàn)）

補(bǔ)充表3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果（酶用量梯度實(shí)驗(yàn)）

補(bǔ)充表4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果（反應(yīng)時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)）

續(xù)表

補(bǔ)充表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線（偏諾皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線）

補(bǔ)充表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線（重樓皂苷VI標(biāo)準(zhǔn)曲線）

補(bǔ)充表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

補(bǔ)充表8 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)