張 斌，梁苗苗，譚政委，孫俊聰，郭妍宏，薛哲勇＊＊

（1. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/植物天然活性物質(zhì)的生物合成與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150040；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心 鄭州 450002；3. 中國科學(xué)院植物研究所 北京 100093）

三萜是一類結(jié)構(gòu)多樣的天然產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等生理活性，也是許多植物中藥的活性成分[1-8]。三萜類化合物都先經(jīng)歷2,3-氧化鯊烯（2,3-oxidosqualene）環(huán)化反應(yīng)生成三萜骨架，催化這一關(guān)鍵步驟-環(huán)化反應(yīng)的酶被稱為2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶（OSC）。目前從植物中通過分離提取已鑒定到超過120 種三萜骨架，通過酵母、煙草異源表達(dá)體系鑒定超過150 種OSCs，但只覆蓋了其中51 種三萜骨架，仍有大量植物三萜類成分的OSCs尚未鑒定[7]。

目前,模式植物擬南芥和水稻中的OSC 已有較全面的研究，已有研究報(bào)道了擬南芥基因組中挖掘到13個(gè)OSC 基因[9]，異源表達(dá)鑒定了多個(gè)三萜產(chǎn)物，包括環(huán)阿屯醇（cycloartenol），羊毛甾醇（lanosterol），β-香樹素（β-amyrin），marneral，thalianol 以及arabidiol 等[9]。水稻中有12個(gè)OSC基因[10]，異源表達(dá)分析其產(chǎn)物包括β-香樹素（β-amyrin），帕克醇（parkeol），異喬木萜醇（isoarborinol）等[9]。OSC 酶的功能鑒定主要以釀酒酵母和本氏煙草為異源表達(dá)體系，結(jié)合GC-MS 或LCMS以及NMR 對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。基于晶體結(jié)構(gòu)解析、同源建模、定點(diǎn)突變對(duì)OSC 的催化機(jī)制和活性改造有了深入的研究[11]。隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展，越來越多植物OSCs 將被發(fā)掘，以AlphaFold 為代表的AI技術(shù)對(duì)OSCs 結(jié)構(gòu)進(jìn)行更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)[12-13]，對(duì)催化機(jī)制解析和新功能突變體酶的發(fā)現(xiàn)有指導(dǎo)意義。

1 植物OSC異源表達(dá)體系

1.1 酵母體系異源表達(dá)植物OSC

利用酵母體系異源表達(dá)植物OSC 具有多種優(yōu)勢(shì)，比如酵母作為生物學(xué)研究的模式生物，轉(zhuǎn)基因操作相對(duì)容易，且酵母生長(zhǎng)迅速，實(shí)驗(yàn)周期較短，此外，酵母本身能夠產(chǎn)生OSC 的底物—2,3-氧化鯊烯[11]。用羊毛甾醇缺陷型的酵母（Gil77）進(jìn)行蛋白表達(dá)，該酶利用酵母內(nèi)源的2,3-氧化鯊烯可以合成目的產(chǎn)物，并用薄層層析（TLC）方法分析環(huán)化產(chǎn)物。這其中的典型例子是模式植物擬南芥，通過全基因組的分析，擬南芥中共有13個(gè)OSCs基因，其中大多數(shù)為多功能酶，比較典型的是At4g15370/BARS1/PEN2基因，它編碼baruol 合酶，在酵母異源表達(dá)體系中催化產(chǎn)生90%的baruol 及22 種含量極低的副產(chǎn)物[22]。畢赤酵母（Pichia pastoris）在完全培養(yǎng)基YPD 生長(zhǎng)，該體系已經(jīng)被用來成功地分析來自Euphorbia tirucallia的β-香樹素合酶的功能[23]。同樣的酵母體系成功地分析了水稻OsPS和OsISO的功能，并顯示出它們分別能產(chǎn)生的帕克醇和異喬木萜醇三萜化合物[24]。

但酵母作為異源表達(dá)植物OSC 體系亦存在不足，密碼子偏好性問題便是其一。Sun 等[14]在研究水稻OsOSC6時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因在水稻多組織表達(dá)，但直接克隆轉(zhuǎn)化到酵母后，并沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)化酵母的產(chǎn)物有改變，之后Sun 等利用基因全合成的方法合成了蛋白序列與OsOSC6一致，而密碼子偏好酵母的SnOsOSC6，克隆轉(zhuǎn)化酵母后，證實(shí)其有能夠合成β-香樹素和α-香樹素。

1.2 煙草體系異源表達(dá)植物OSC

近年來利用本氏煙草體系研究OSC 催化功能得到了迅速地發(fā)展，煙草體系對(duì)于多數(shù)植物源OSC 都可以驗(yàn)證功能，無需密碼子優(yōu)化，且煙草可內(nèi)源合成OSC底物——2,3-氧化鯊烯，無需外源添加。

利用該異源表達(dá)體系成功鑒定了蘋果（Malus domestica）中一個(gè)編碼α-amyrin 為主要產(chǎn)物的不尋常的三萜合酶[16]。隨后，來自蘋果MdOSC4和MdOSC5用本氏煙草瞬時(shí)表達(dá)表明均是多功能的OSC 酶，MdOSC4合成germanicol，β-香樹素和羽扇豆醇，MdOSC5合成羽扇豆醇和β-香樹素[17]。歐洲山芥（Barbarea Vulgaris）兩個(gè)OSC 酶BvLUP2和BvLUP5分別合成羽扇豆醇、α-香樹素和β-香樹素的混合物[18]。本氏煙草體系在研究新的OSC 酶功能方面也得到了驗(yàn)證，OsONS1催化2,3;22,23-二氧化鯊烯產(chǎn)生αonocerin[19]，與在Gil77 酵母中產(chǎn)物一致。以上研究表明，本氏煙草的瞬時(shí)體系在OSC 酶功能鑒定方面和傳統(tǒng)的酵母體系一樣有效，并且更加便捷[9]。

對(duì)三萜下游代謝途徑進(jìn)行解析需組合不同的候選OSC、細(xì)胞色素P450酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等，將多個(gè)候選基因組合整合到一個(gè)載體上費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而煙草體系可以混合不同的農(nóng)桿菌同時(shí)侵染煙草葉片，無需構(gòu)建多元載體，極大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作[15]。

2 OSC序列克隆和功能鑒定

最先是從豌豆（Pisum sativum）中純化得到的β-香樹素合酶和環(huán)阿屯醇合酶，他們的分子量大小分別是35KD 和55KD[20]，但所獲得的酶量不足以用于氨基酸序列的分析，人們只能測(cè)定其首尾序列。用反向遺傳學(xué)的方法，可從真菌和動(dòng)物中獲得羊毛甾醇合酶的cDNA，例如用這種方法已獲得鼠的羊毛甾醇合酶cDNA[21]。將擬南芥的cDNA 轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，經(jīng)過產(chǎn)物的分析，鑒定了植物中的第一個(gè)環(huán)阿屯醇合成酶基因[22]。隨后的研究者根據(jù)其保守序列，利用PCR 的方法克隆了大量的植物OSC基因。

Kushiro 等利用同源克隆的方法從人參根中克隆出來β-香樹素合酶編碼基因，β-香樹素是重要的中藥活性物質(zhì)齊墩果烷型人參皂苷的合成前體[23]，隨后在其他雙子葉植物中β-香樹素合酶基因也相繼被克隆出來[24-33]，這是迄今為止發(fā)現(xiàn)植物中最大的一類三萜合酶基因（圖1）；在單子葉植物中燕麥和水稻中也克隆到了β-香樹素合酶基因[14,34]，但進(jìn)化樹分析表明，單子葉和雙子葉植物中的β-香樹素合酶基因進(jìn)化起源不同。在燕麥中，β-香樹素合酶是燕麥根中積累的抑菌類物質(zhì)燕麥苷合成途徑中的關(guān)鍵酶，它與燕麥苷合成途徑中至少有三個(gè)不同功能的基因形成一個(gè)基因簇，這種不具有序列同源性、對(duì)最終產(chǎn)物有不同作用的基因形成基因簇在植物次生代謝特別是三萜類化合物的形成途徑中的報(bào)道越來越多，關(guān)于基因簇的形成和調(diào)控機(jī)制近幾年來也成了研究的熱點(diǎn)[33,37-42]。

植物中另一類重要的OSCs 是羽扇豆醇合酶（lupeol synthases）（圖1）催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成五環(huán)三萜羽扇豆醇，最早從橄欖（Olea europaea）和（Taraxacum officinale）中克隆得到[43]；在其他植物白樺樹（Betula platyphylla）、甘草（Glycyrrhiza glabra）、百脈根 （Lotusjaponicus）和木欖（Bruguiera gymnorrhiza）[30,44-45]也相繼克隆到了羽扇豆醇合酶基因，在這些植物中克隆到的羽扇豆醇合酶都是單功能酶，只生成單一的產(chǎn)物羽扇豆醇；同源性在74-81%之間[46]；而在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和蓖麻（Ricinus communis）中克隆到了產(chǎn)物以羽扇豆醇為主并有其他含量較少的副產(chǎn)物的多功能羽扇豆醇合酶[47-51]。迄今為止，大多數(shù)植物中的的OSCs 基因是通過同源克隆得到的，總數(shù)超過150 個(gè)[9]，主要是β-香樹素合酶和羽扇豆醇合酶基因。

圖1 2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶（OSC）進(jìn)化分析

3 植物OSC基因的進(jìn)化

在真核生物中，甾醇（Steriods）如膽固醇作為細(xì)胞膜的組成成分，在穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性等方面起著重要作用；而在原核生物中，藿烷類（hopanoid）三萜作為細(xì)胞膜的組成成分在改善細(xì)胞膜的強(qiáng)度和剛度上起著重要作用[52-53]。藿烷類三萜和甾醇的合成都起始于前體鯊烯（Squlene），鯊烯何伯烯環(huán)化酶（SHC）能夠?qū)Ⅴ徬┉h(huán)化成何帕烯（hopene）進(jìn)而經(jīng)過反應(yīng)生成hopanoid，而在動(dòng)植物和真菌中不同的OSCs 催化生成各種甾醇前體。Bode 等從可以產(chǎn)生甾醇的粘細(xì)菌Stigmatella aurantiaca克隆到第一個(gè)細(xì)菌環(huán)阿屯醇合酶基因，同時(shí)他們對(duì)Nannocystis excedens的化合物分析中也檢測(cè)到了羊毛甾醇的存在，序列分析結(jié)構(gòu)顯示細(xì)菌中環(huán)阿屯醇合酶（CAS）的氨基酸序列與植物中的CAS 有37%-44%的相似性，與細(xì)菌SHC有26%的相似性，據(jù)此推測(cè)該細(xì)菌中CAS 可能由SHC進(jìn)化而來，繼而進(jìn)化成高等植物中的CAS[54]。Lamb 等人從甲烷利用菌Methylococcus capsulatus中同時(shí)克隆了鯊烯單加氧酶（squalene monooxygenase）基因和羊毛甾醇合成酶基因（LSS），并利用大腸桿菌異源表達(dá)體系對(duì)這兩個(gè)酶的功能進(jìn)行了體外驗(yàn)證[55]。但已有的研究表明，在少數(shù)高等植物和一部分蕨類植物、少數(shù)苔蘚類和真菌中有也hopanoid類三萜的存在[53,56]，這表明某些植物基因組中中也許同時(shí)有羊毛甾醇和藿烷類三萜合成酶基因的的存在，Shinozaki 等[57]首次從蕨類植物Adiantum capillus-veneris中克隆了鯊烯合酶同源基因ACH（22-hydroxyhopane synthase）和氧化鯊烯合酶同源基因ACX（cycloartenol synthase），氨基酸序列進(jìn)化樹分析也表明ACH 與細(xì)菌的SHC 聚為一類，而ACX 與高等植物的CAS 聚為一類[57]，該研究進(jìn)一步表明植物中的OSC有可能由細(xì)菌中的SHC進(jìn)化而來。

對(duì)植物基因組分析發(fā)現(xiàn)，低等植物如萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）及 蕨 類 植 物 如Adiantum capillus-veneris和Polypodiodes niponica只有一個(gè)OSC 基因，編碼環(huán)阿屯醇合酶催化產(chǎn)生環(huán)阿屯醇，是植物生長(zhǎng)所必需的[58]。而高等植物基因組中往往含有多個(gè)OSC 基因，對(duì)植物中OSCs 基因的進(jìn)化分析表明，植物中OSCs 基因可能來自于同一個(gè)祖先CAS 基因[17,46]。Xue 等人利用已知的所有植物OSCs 共101 個(gè)基因進(jìn)行了系統(tǒng)性進(jìn)化分析，結(jié)果表明高等植物中的OSCs基因起源于一個(gè)CAS祖先，OSCs基因家族在進(jìn)化過程中發(fā)生了兩次古老的復(fù)制事件，一次是在單子葉和雙子葉植物分化之前，經(jīng)過基因復(fù)制形成了兩個(gè)原始的OSC 基因：原環(huán)阿屯醇合酶（ancestral cycloartenol synthase，ACS）基因和原類羊毛甾醇合酶（ancestral lanosterol synthase-like，ALSL）基因，在單子葉植物從雙子葉植物分化出來之后，ACS 基因經(jīng)過多次復(fù)制擴(kuò)張形成了現(xiàn)在單子葉植物中OSCs 基因，另一次古老的復(fù)制事件是ALSL 基因在單子葉和雙子葉植物分化之前又發(fā)生了一次復(fù)制，原始的LSS基因在多數(shù)雙子葉植物中保留了下來但在單子葉植物中丟失，而復(fù)制的ALSL 基因拷貝進(jìn)化形成了現(xiàn)在雙子葉植物中的OSCs 基因。同時(shí)對(duì)進(jìn)化樹的不同分支進(jìn)行選擇壓力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同分支的OSCs基因在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力明顯不同，CAS 和LSS 和LUS 基因受到了凈化選擇的作用，而其中大多數(shù)OSCs 基因受到了正向選擇的作用，這加快了重復(fù)基因獲得新功能的速度。因此，OSCs基因家族的擴(kuò)增及功能多樣性由全基因組倍增、局部串聯(lián)復(fù)制等形成的多拷貝基因在不同選擇壓力下獲得不同功能的結(jié)果[24]。

4 OSC 酶結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的研究進(jìn)展

4.1 OSC基因結(jié)構(gòu)和酶結(jié)構(gòu)

一直以來，科學(xué)家們比較感興趣的是為什么數(shù)量不多的OSCs 能催化產(chǎn)生結(jié)構(gòu)如此豐富多樣的產(chǎn)物，其中一種假設(shè)是這些OSCs 基因的序列差異會(huì)很大，核酸序列分析表明，目前發(fā)現(xiàn)的OSCs 基因外顯子數(shù)量差別不大，大多數(shù)包含18 個(gè)外顯子，除了第一個(gè)和最后一個(gè)外顯子序列差異大，其它相對(duì)應(yīng)位置的外顯子大小比較一致，序列也高度保守，但內(nèi)含子序列變化 很 大 。 目 前 嗜 熱 球 菌（Alicyclobacillus acidocaldarius） 的 鯊 烯 環(huán) 化 酶（Squalenehopenecyclase，AaSHC）[59]和人類（Homo sapiens）的羊毛甾醇合成酶（hLSS）[50]的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析。但是植物OSC 屬于膜蛋白且分子量較大，難以獲得晶體結(jié)構(gòu)，到現(xiàn)在為止，仍沒有植物OSC 晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道。OSC是一類較為保守的酶家族，蛋白序列相似度高，目前對(duì)植物OSC 的研究主要通過同源建模及點(diǎn)突變對(duì)催化機(jī)制進(jìn)行研究[59-60]（圖2）。

圖2 hLSS的三維結(jié)構(gòu)和催化的基本過程

來自于嗜熱球菌的AaSHC，催化角鯊烯環(huán)化為何帕烯，將其基因在大腸桿菌表達(dá)（Escherichia coli）后，通過陰離子交換色譜和凝膠過濾法純化蛋白，最終得到分辨率為2.9? 的蛋白晶體，AaSHC 為同源二聚體蛋白，為膜單側(cè)結(jié)合蛋白，但并不穿透膜雙分子層，每個(gè)單體的長(zhǎng)度為631 個(gè)氨基酸，有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，形似“啞鈴狀”，分別用Domain1和Domain2表示，Domain1是一個(gè)由兩個(gè)α6-α6 組成的同心環(huán)狀螺旋組成的桶狀結(jié)構(gòu)域，Domain2是一個(gè)α-α螺旋桶狀結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)由loop 環(huán)連接形成一個(gè)β 結(jié)構(gòu)的空腔，在這兩個(gè)桶裝螺旋結(jié)構(gòu)域外有8 個(gè)QW 基序，它們具有堆疊的Gln和Trp 側(cè)鏈，其中有7 個(gè)具有幾乎相同的構(gòu)象，通過氫鍵作用將外部的螺旋結(jié)構(gòu)連接起來起到穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用，同時(shí)還有一個(gè)非極性的通道便于底物細(xì)胞膜進(jìn)入到β 結(jié)構(gòu)的空腔中的催化活性中心區(qū)域進(jìn)行反應(yīng)。

將人類的羊毛甾醇合酶（hLSS）基因在酵母（Pichia pastoris）中表達(dá)，通過金屬螯合色譜和凝膠過濾法純化蛋白，最終獲得了分辨率為2.1? 的蛋白晶體。晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，hLSS的結(jié)構(gòu)與AaSHC的非常相似，也都是有兩個(gè)α-α 螺旋桶裝結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域也由loop 環(huán)連接形成一個(gè)β 結(jié)構(gòu)的空腔，但在桶狀螺旋外圍只有5 個(gè)保守的與AaSHC 中構(gòu)象相同的QW 基序，但同樣起著穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用，另外，hLSS 的N 端區(qū)域多了一個(gè)填充于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域，這段區(qū)域在維持蛋白構(gòu)象和方向上起著重要作用，hLSS 最大的活性位點(diǎn)口袋位于Domain1 和Domain2 之間，hLSS 是一類膜單側(cè)結(jié)合蛋白，通過Domain2中的部分區(qū)域附著于膜的一側(cè)，Domain2與膜結(jié)合部分含有一個(gè)直徑為25? 的平面及底物進(jìn)入活性位點(diǎn)的通道，該通道允許底物2,3-氧化鯊烯進(jìn)入疏水活性位點(diǎn)，但該通道與活性口袋之間被一收縮位點(diǎn)嚴(yán)格分開[59]，通過改變Tyr237、Cys233 和Ile524 等氨基酸側(cè)鏈的構(gòu)象或者對(duì)516-524 及697-699 兩個(gè)loop 環(huán)重排可以形成底物通道。根據(jù)OSC 和0.8%n-辛基-D-β-葡萄糖苷（β-OG）膜重結(jié)晶衍射分析，β-OG 的葡萄糖頭部基團(tuán)和OSC 的膜結(jié)構(gòu)域平行排列，而β-OG 的辛基和雙分子層的脂肪酸平行。例如OSC/LAS的疏水活性中心，Asp455、Cys456 和Cys533 等殘基提供了極性帽子，有利于羊毛甾醇3 位氫鍵的形成，在A、B 環(huán)形成之后，Phe44、Tyr503 和Trp581 等殘基通過陽離子-π 相互作用穩(wěn)定C6 和C10 的陽離子。OSC 中的保守基序DCTAE決定了底物特異性，如果把鯊烯環(huán)化酶SC（squalene-hopene cyclase）保守基序DDTAV 變?yōu)镈CTAE，SC也可以結(jié)合2,3-氧化鯊烯。

4.2 OSCs催化基本過程的推測(cè)

化學(xué)家們以O(shè)SC 催化產(chǎn)物的空間構(gòu)象和化學(xué)反應(yīng)基本原理為依據(jù)推測(cè)其催化的基本過程：①酶與底物的結(jié)合，底物的預(yù)折疊；②底物環(huán)氧基團(tuán)質(zhì)子化，環(huán)化反應(yīng)起始；③各個(gè)環(huán)的形成；④在環(huán)骨架上發(fā)生一系列質(zhì)子轉(zhuǎn)移和甲基重排反應(yīng)；⑤去質(zhì)子化或捕獲一個(gè)水分子形成最終產(chǎn)物[61]（圖2）。底物的預(yù)折疊對(duì)環(huán)化反應(yīng)的起始至關(guān)重要，同時(shí)決定了環(huán)化產(chǎn)物是CC-C 還是C-B-C 構(gòu)型。OSC 產(chǎn)物多樣性主要是由反應(yīng)過程中一系列具有嚴(yán)格構(gòu)象的部分環(huán)化的中間陽離子分子與酶催化活性中心的蛋白結(jié)構(gòu)之間的相互作用決定的。

4.3 OSCs催化功能的關(guān)鍵氨基酸

目前對(duì)于LSS 的催化反應(yīng)路徑研究得較為透徹，為了研究羊毛甾醇形成的環(huán)化機(jī)制，研究者進(jìn)行了許多針對(duì)LSS 活性中心氨基酸的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)。Tyr510Ala 突變后可以生成羊毛甾醇，而Tyr510Lys 和Tyr510Trp 突變后不能生成羊毛甾醇，說明Tyr510 參與單環(huán)到四環(huán)產(chǎn)物的生成[40,62]。有實(shí)驗(yàn)證明His234 和Tyr510之間的氫鍵相互作用能夠穩(wěn)定三環(huán)C14陽離子和C20 陽離子[63-64]；Phe445 能夠穩(wěn)定C14 陽離子，影響去質(zhì)子化[65]；Trp232 對(duì)D 環(huán)形成起重要作用[66]；Tyr99有穩(wěn)定B 環(huán)構(gòu)象和C14 陽離子、形成C 環(huán)的作用[67]；Phe699 穩(wěn)定C17 陽離子之間產(chǎn)物[68]；Cys703 不僅穩(wěn)定C-B 構(gòu)象C8 陽離子，還可以與Phe699 相互作用[69]；Ile705 影響羊毛甾醇C 環(huán)和D 環(huán)形成[70]；Tyr707可能影響C-B 構(gòu)象C8 陽離子和lanosteryl C8/C9 陽離子的穩(wěn)定[58]。

環(huán)阿屯醇和羊毛甾醇有相似的結(jié)構(gòu)且都是C-BC 構(gòu)型，許多環(huán)阿屯醇合酶（CAS）的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)也證明突變后的CAS 可以生成羊毛甾醇[29,71-74]，為L(zhǎng)SS 從CAS 進(jìn)化而來的觀點(diǎn)提供了依據(jù)[75]。在β-香樹素合酶中Phe728 影響D 環(huán)和E 環(huán)形成，Phe474 通過π 電子相互作用和空間位阻效應(yīng)影響底物折疊[76-77]。Salmon等發(fā)現(xiàn)燕麥中的β-香樹素合酶Ser728Phe突變會(huì)導(dǎo)致催化產(chǎn)物由五環(huán)β-香樹素變?yōu)樗沫h(huán)達(dá)瑪烯二醇II（Dammarenediol-Ⅱ），且突變后的β-香樹素合酶的底物特異性發(fā)生了變化，能夠同時(shí)催化2,3-氧化鯊烯和2,3;22,23-二氧化鯊烯[78]。Banta 等使用大腸桿菌異源甾醇表達(dá)系統(tǒng)證明了細(xì)菌羊毛甾醇合酶中的四個(gè)氨基酸殘基的取代使得除了四環(huán)甾醇之外還能合成五環(huán)脂肪醇[79]。

Xue[80]鑒定出粳稻OsPS 合成C-B-C 構(gòu)象的四環(huán)三萜帕克醇，秈稻和野生稻OsOS 合成C-sC-C 構(gòu)象的五環(huán)三萜秈稻醇以及12 種副產(chǎn)物。利用分子進(jìn)化分析和蛋白結(jié)構(gòu)模擬等方法從34 個(gè)稻屬植物的46 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中鑒別出3個(gè)影響產(chǎn)物構(gòu)象和結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。而且這三個(gè)氨基酸殘基影響第四個(gè)氨基酸殘基Tyr257 側(cè)鏈的空間方向，從而決定了產(chǎn)物是C-B-C構(gòu)象的四環(huán)三萜帕克醇還是秈稻OsOS合成CsC-C 構(gòu)象的五環(huán)三萜秈稻醇[80]。因此，一些非直接作用氨基酸殘基通過影響直接作用氨基酸殘基的構(gòu)象，可能引起酶功能的轉(zhuǎn)換。

5 小結(jié)與展望

5.1 新穎功能OSC酶的挖掘

雖然通過分離提取植物鑒定到的三萜骨架超過120 種，但目前進(jìn)行過功能驗(yàn)證的OSC 僅覆蓋了其中的51 種三萜骨架[7]，仍有大量三萜骨架不清楚其OSC序列，這限制了三萜的異源生產(chǎn)和更廣泛的應(yīng)用。隨著二代及三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，提高了測(cè)序讀長(zhǎng)和通量，已經(jīng)有數(shù)十個(gè)藥用植物基因組完成了全基因組測(cè)序及組裝工作，未來會(huì)有越來越多的藥用植物基因組被報(bào)道。從測(cè)序基因組中挖掘新的三萜合酶，利用酵母和煙草異源表達(dá)體系，將有更多產(chǎn)生新骨架的OSC酶被鑒定。

5.2 OSC酶催化機(jī)制研究

OSC催化線性底物2,3-氧化鯊烯生成多環(huán)三萜產(chǎn)物是自然界中最復(fù)雜的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)之一，2,3-氧化鯊烯經(jīng)過底物預(yù)折疊、環(huán)氧質(zhì)子化、環(huán)形成、D 環(huán)擴(kuò)張、E環(huán)形成、質(zhì)子和甲基轉(zhuǎn)移、脫質(zhì)子或水合生成最終三萜產(chǎn)物[81]。已有研究利用同源建模及定點(diǎn)突變對(duì)人羊毛甾醇及β-香樹素等三萜合酶的環(huán)化機(jī)制進(jìn)行研究，但是其它三萜骨架類型比如大戟烷、甘遂烷、木栓烷等的環(huán)化機(jī)制還少有報(bào)道，可能是因?yàn)橄嚓P(guān)類型三萜合酶還少有發(fā)現(xiàn)。近年來發(fā)展的Alphafold 2基于深度學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)折疊過程從頭預(yù)測(cè)蛋白空間結(jié)構(gòu)，比同源建模預(yù)測(cè)精度更高，未來會(huì)成為酶催化機(jī)制研究的有力工具[12-13]。

5.3 異源表達(dá)體系

酵母是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，但植物源基因在微生物體內(nèi)蛋白表達(dá)普遍較低，可能需要進(jìn)行密碼子優(yōu)化才能在酵母底盤成功表達(dá)。煙草在次生代謝合成途徑和蛋白的翻譯后修飾上與候選基因的來源植物具有更多的相似性，因此在植物蛋白的異源表達(dá)上具有一定的優(yōu)勢(shì)。但由于底盤細(xì)胞自身復(fù)雜的代謝流，需要進(jìn)一步通過優(yōu)化整個(gè)體系，比如在酵母中敲低內(nèi)源性的固醇代謝途徑，在煙草中過表達(dá)上游限速酶—3-羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶，進(jìn)而提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量便于檢測(cè)。