劉 暢 ， 楊琳燕 ， 張 偉 ， 宋翠平 ， 趙思俊 ， 李道穩(wěn) ， 李留安 ， 王宏宇 ， 李 存

(1. 天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 天津 西青 300392 ；2. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 ， 山東 青島 266032)

恩諾沙星屬于氟喹諾酮類(lèi)藥物，是動(dòng)物專(zhuān)用的抗菌藥，環(huán)丙沙星是恩諾沙星的主要代謝產(chǎn)物，二者的結(jié)構(gòu)如圖1所示[1-3]。恩諾沙星的抗菌譜廣，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛[4-5]，但藥物不規(guī)范使用造成的食品、環(huán)境中的藥物殘留可能引起消費(fèi)者的胃腸道反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)或其他毒性作用，而且會(huì)增強(qiáng)病原菌的耐藥性，嚴(yán)重影響動(dòng)物疾病的防治和食品的安全[6-9]。因此，亟需建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的分析食品中恩諾沙星殘留的方法。

圖1 恩諾沙星(A)和環(huán)丙沙星(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)[1-3]Fig.1 Chemical structure of enrofloxacin (A) and ciprofloxacin (B)[1-3]

20世紀(jì)70年代，F(xiàn)aulk等開(kāi)創(chuàng)了膠體金在免疫分析領(lǐng)域應(yīng)用的先河，之后有學(xué)者將此方法應(yīng)用到人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)的檢測(cè)，膠體金免疫層析技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)[10]。近年來(lái)，磁性微球作為一種新型標(biāo)志物受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。磁性微球常以Fe3O4作為磁性?xún)?nèi)核，但Fe3O4容易被氧化為Fe2O3，變?yōu)楹稚蚣t棕色。氧化程度不同的磁性微球，其顏色存在差異。磁性微球具有理想標(biāo)志物應(yīng)有的許多特征，能夠通過(guò)簡(jiǎn)單的手段與生物分子形成穩(wěn)定的結(jié)合物，適用于多種待測(cè)物的分析檢測(cè)，并且存在技術(shù)上的潛在革新。修飾后的磁性微球?qū)Υ郎y(cè)物表現(xiàn)出良好的吸附性能，能夠滿(mǎn)足待測(cè)物的檢測(cè)需要[11-12]。陳璐萍等[12]建立了一種磁性免疫層析試紙條，通過(guò)單純的肉眼觀察即可實(shí)現(xiàn)哈維弧菌的檢測(cè)。

因此，本試驗(yàn)旨在以磁性微球?yàn)闃?biāo)志物，以競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，建立一種磁性微球免疫層析試紙，用于快速檢測(cè)牛奶中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 恩諾沙星(98.5%)和環(huán)丙沙星(92.3%)，均購(gòu)自Dr. Ehrensorfer GmbH (Augsburg,Germany); 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、吐溫-20和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(中國(guó)，北京)；抗喹諾酮類(lèi)單克隆抗體和山羊抗小鼠IgG，均購(gòu)自北京維德維康生物科技有限公司(中國(guó)，北京)；羧基化的磁性微球，購(gòu)自佰邁格生物技術(shù)有限公司(中國(guó)，無(wú)錫)。

NC膜(Vivid 90)、共軛墊(GL-0194)、樣品墊(GL-b02)、吸水墊和聚氯乙烯(Polyvinyl chloride，PVC)底板，均購(gòu)自上海杰一生物科技有限公司(中國(guó)，上海)；噴金劃膜儀(HGS510)和可編程切條機(jī)(HGS201)，均購(gòu)自杭州峰航科技有限公司(中國(guó)，杭州)。

1.2 磁性微球標(biāo)記抗體的制備 本試驗(yàn)選擇了表面含有羧基的磁性微球，參照參考文獻(xiàn)[13-14]中的方法用EDC活化并偶聯(lián)抗體。分別使用10、20、40 μg和60 μg的抗體進(jìn)行偶聯(lián)，對(duì)抗體的用量進(jìn)行優(yōu)化。首先，取400 μL 磁性微球，用2-(N-嗎啉)乙磺酸[2-(N-morpholine) ethanesulfonic acid，MES] 緩沖液洗滌3次，在外磁場(chǎng)的作用下分離，棄去上清液。加入5 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS，在30 ℃ 180 r/min的條件下活化25 min?；罨瓿珊螅昧姿徕c溶液(0.15 mol/L，pH 7.2)洗滌2次，去除未反應(yīng)的EDC和NHS。隨后快速加入一定量的單抗，在30 ℃ 180 r/min的條件下反應(yīng)，使抗體與磁性微球偶聯(lián)。反應(yīng)2～4 h后，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中用于計(jì)算偶聯(lián)率，用終濃度2%的BSA封閉30 min，PBST(0.01 mol/L，pH 7.2，含0.05%吐溫-20)洗滌3次，最后用PBS(0.01 mol/L，含0.3% BSA和0.01% NaN3)復(fù)溶，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肂CA蛋白濃度測(cè)定試劑盒分別測(cè)定偶聯(lián)前后單抗溶液的濃度，按公式(1)計(jì)算偶聯(lián)率，從而確定單抗是否成功地與磁性微球偶聯(lián)，并確定最適的抗體用量。

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1.3 磁性微球免疫層析試紙的構(gòu)建和條件優(yōu)化 首先，對(duì)抗原的包被濃度進(jìn)行優(yōu)化。NC膜上羊抗鼠IgG的包被濃度固定為0.8 mg/mL，抗原的濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL，以1 μL/cm的速度分別劃線(xiàn)，45 ℃鼓風(fēng)干燥2 h。磁性微球標(biāo)記抗體用BS緩沖液(0.05 mol/L，pH 9.0，含10%蔗糖、5%海藻糖、0.1%PVP、1%吐溫-20和2%NaCl)稀釋后分配到共軛墊上，25 ℃干燥30 min。樣品墊用PB緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4，含0.1%PVP和4%吐溫-20)浸泡處理1 h，37 ℃環(huán)境下干燥[15-18]。之后將NC膜、共軛墊、樣品墊和吸水紙按照次序依次組裝到PVC底板上。切成3 mm寬的條狀，密封保存，備用。

隨后，對(duì)羊抗鼠IgG的包被濃度進(jìn)行優(yōu)化。在最適的抗原包被濃度下，將羊抗鼠IgG的包被濃度分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL，以1 μL/cm的速度分別劃線(xiàn)，45 ℃干燥2 h。磁性微球標(biāo)記抗體用BS緩沖液(0.05 mol/L，pH 9.0，含10%蔗糖、5%海藻糖、0.1%PVP、1%吐溫-20和2%NaCl)稀釋后分配到共軛墊上，25 ℃干燥30 min。樣品墊用PB緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4，含0.1%PVP和4%吐溫-20)浸泡處理1 h，37 ℃環(huán)境下干燥。之后將NC膜、共軛墊、樣品墊和吸水紙按照次序依次組裝到PVC底板上。切成3 mm寬的條狀，密封保存，備用。通過(guò)上述方法選擇最適的抗原和羊抗鼠IgG包被濃度，構(gòu)建磁性微球免疫層析試紙并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 方法性能分析

1.4.1 靈敏度和基質(zhì)耐受性分析 用0.02 mol/L PB緩沖液(pH 7.4)和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液驗(yàn)證該方法的靈敏度和基質(zhì)耐受性[19]。取10 mg的恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，分別配成100 μg/mL的高濃度儲(chǔ)備液，置于4 ℃保存。分析前用0.02 mol/L PB緩沖液(pH 7.4)將高濃度儲(chǔ)備液依次稀釋至0.5、1、2、5、10、20 ng/mL和50 ng/mL的工作濃度。

牛奶樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校?jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)分析不含待測(cè)物。牛奶用4 mL酸化乙腈提取，8 000 g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入4 mL正己烷除脂。50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，少量乙腈復(fù)溶，用0.02 mol/L PB緩沖液(pH 7.4)稀釋10倍[20]。在處理后的牛奶樣品中分別添加終濃度為0.5、1、2、5、10、20 ng/mL和50 ng/mL的待測(cè)藥物。

用磁性微球免疫層析試紙對(duì)上述2種溶液進(jìn)行測(cè)定，用Image J軟件(Version 1.52v)分析試紙顏色強(qiáng)度的變化，記錄檢測(cè)線(xiàn)(Test line,T線(xiàn))和質(zhì)控線(xiàn)(Control line,C線(xiàn))的顏色強(qiáng)度的比值隨待測(cè)藥物濃度的變化趨勢(shì)，并以T/C值為縱坐標(biāo)，藥物濃度的log函數(shù)為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到對(duì)應(yīng)的線(xiàn)性方程[21]。計(jì)算陰性樣本T/C信號(hào)的平均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)應(yīng)的目標(biāo)分析物的濃度，將該濃度定義為本方法的檢測(cè)限[16]。

1.4.2 添加回收率的計(jì)算 在牛奶樣品中分別添加一定量的恩諾沙星和環(huán)丙沙星，之后按照1.4.1中的方法，用酸化乙腈和正己烷進(jìn)行預(yù)處理，并使稀釋后恩諾沙星和環(huán)丙沙星的終濃度分別為2、5 ng/mL和10 ng/mL。用磁性微球免疫層析試紙進(jìn)行分析，計(jì)算添加回收率。

1.4.3 交叉反應(yīng)性分析 對(duì)氟甲喹、諾氟沙星、沙拉沙星進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)該方法對(duì)其他藥物的交叉反應(yīng)性。取上述藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.02 mol/L PB緩沖液稀釋至0.5、1、2、5、10、20 ng/mL和50 ng/mL，用磁性微球免疫層析試紙進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)顏色強(qiáng)度和濃度的關(guān)系，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算各個(gè)藥物的半抑制濃度(Half-inhibitory concentration，IC50),按公式(2)計(jì)算交叉反應(yīng)率(Cross reactivity，CR)。

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2 結(jié)果

2.1 磁性微球標(biāo)記抗體的鑒定與抗體用量的優(yōu)化 用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒分別測(cè)定偶聯(lián)前和偶聯(lián)后單抗溶液的濃度，采用OriginPro 2017軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與偶聯(lián)前相比，偶聯(lián)后的溶液中單抗含量顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明單抗已經(jīng)偶聯(lián)到磁性微球表面。

為了確定磁性微球與抗體的最佳投料比，本試驗(yàn)對(duì)比了抗體的用量為10、20、40 μg和60 μg時(shí)對(duì)應(yīng)的偶聯(lián)率和實(shí)際參與偶聯(lián)的抗體的量，結(jié)果見(jiàn)圖2。偶聯(lián)率隨單抗?jié)舛鹊脑黾佣陆?；偶?lián)到磁性微球表面的單抗的量在40 μg時(shí)達(dá)到最大，為24.73 μg，單抗的添加量增加至60 μg時(shí)，偶聯(lián)到磁性微球表面的抗體反而減少，為19.97 μg。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中，添加40 μg抗體與磁性微球偶聯(lián)。

圖2 單抗在磁性微球表面的偶聯(lián)率與偶聯(lián)抗體量的關(guān)系Fig.2 Relationship between quantity and coupling rate of monoclonal antibody to magnetic microspheres

2.2 磁性微球免疫層析試紙的構(gòu)建和條件優(yōu)化 NC膜上不同包被濃度的抗原對(duì)結(jié)果的影響見(jiàn)圖3A?？乖瓭舛容^低時(shí)，隨著抗原濃度的增大，T線(xiàn)顏色逐漸加深，到0.8 mg/mL時(shí)T線(xiàn)顏色最深；繼續(xù)增大抗原濃度至1 mg/mL，T線(xiàn)顏色不再加深。因此，確定0.8 mg/mL為最適的抗原包被濃度。

羊抗鼠IgG的包被濃度對(duì)結(jié)果的影響見(jiàn)圖3B。隨著羊抗鼠IgG濃度的增大，C線(xiàn)顏色逐漸加深，在0.8 mg/mL時(shí)C線(xiàn)與T線(xiàn)的顏色強(qiáng)度相當(dāng)。如果C線(xiàn)上羊抗鼠IgG的包被濃度偏高，會(huì)抑制T線(xiàn)的顯色。因此，確定0.8 mg/mL為最適的羊抗鼠IgG包被濃度。

圖3 免疫層析試紙條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of magnetic microsphere immunochromatography test strip conditionA：T線(xiàn)上抗原包被濃度的優(yōu)化； B：C線(xiàn)上羊抗鼠IgG包被濃度的優(yōu)化A: Optimization of antigen coating concentration on T line; B: Optimization of goat-anti-mouse coating concentration IgG on C line

2.3 方法性能分析

2.3.1 靈敏度和基質(zhì)耐受性分析 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的T/C值隨濃度的變化趨勢(shì)如圖4A和圖4B所示，曲線(xiàn)呈倒S形，T/C值隨濃度的升高而降低。在0.5～20 ng/mL范圍內(nèi)，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的T/C值與濃度的log函數(shù)之間表現(xiàn)出相關(guān)性，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖4C，其中恩諾沙星的線(xiàn)性方程為y=1.122 9-0.791 1×log(c恩諾沙星+1)，R2=0.998 2，環(huán)丙沙星的線(xiàn)性方程為y=1.135 1-0.883 0×log(c環(huán)丙沙星+1)，R2=0.958 9。本試驗(yàn)將陰性樣本T/C信號(hào)的平均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)應(yīng)的目標(biāo)分析物的濃度定義為方法的檢測(cè)限。計(jì)算出恩諾沙星的檢測(cè)限為0.37 ng/mL，環(huán)丙沙星的檢測(cè)限為0.23 ng/mL。

圖4 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的T/C值隨濃度的變化曲線(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Tendency of T/C values with concentration and standard curves of enrofloxacin and ciprofloxacin

基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與PB緩沖液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)性分析見(jiàn)圖5，二者具有較好的相關(guān)性(恩諾沙星和環(huán)丙沙星對(duì)應(yīng)的R2分別為0.995 1和0.999 9)，說(shuō)明該方法對(duì)基質(zhì)的耐受性較好。

圖5 PB緩沖液和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液分析恩諾沙星(A)和環(huán)丙沙星(B)的相關(guān)性Fig.5 Correlation between PB buffer and matrix spiked standard solution of enrofloxacin (A) and ciprofloxacin (B)

2.3.2 添加回收率的計(jì)算 牛奶樣品中成分復(fù)雜，有必要在檢測(cè)前對(duì)牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理。分析前對(duì)樣品進(jìn)行恰當(dāng)?shù)念A(yù)處理能幫助除去樣品基質(zhì)中的待測(cè)物，降低復(fù)雜成分對(duì)結(jié)果的干擾。本方法依次對(duì)低、中、高3個(gè)水平的藥物進(jìn)行了分析，添加回收率見(jiàn)表1。該方法對(duì)恩諾沙星的回收率為14.63%～30.56%，對(duì)環(huán)丙沙星的回收率在19.65%～49.81%。

表1 磁性微球免疫層析試紙對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的添加回收率Table 1 Spiked recovery of enrofloxacin and ciprofloxacin by magnetic immunochromatography test strip

2.3.3 交叉反應(yīng)性分析 幾種喹諾酮類(lèi)藥物的IC50和CR見(jiàn)表2。磁性微球免疫層析試紙對(duì)氟甲喹和諾氟沙星的IC50分別為3.03 ng/mL和3.33 ng/mL，CR分別為141.13%和128.66%。對(duì)于沙拉沙星的反應(yīng)交叉率較低，僅為23.21%。

表2 磁性微球免疫層析試紙對(duì)幾種喹諾酮類(lèi)藥物的交叉反應(yīng)率Table 2 Cross reactivity of magnetic microsphere immunochromatographic test strip for several quinolones

3 討論

本試驗(yàn)基于間接競(jìng)爭(zhēng)的原理，將藥物分子與NC膜上的包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記抗體，因此NC膜上的信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)物含量成反比，通過(guò)記錄NC膜表面的顏色強(qiáng)度并進(jìn)行灰度分析，對(duì)溶液中的恩諾沙星或環(huán)丙沙星進(jìn)行定量檢測(cè)。這種方法比肉眼觀察更靈敏，結(jié)果更客觀，但基于可見(jiàn)光的分析方法一般只能采集NC膜表面(約10 μm厚)的信號(hào)。另一方面，該磁性微球免疫層析試紙還可以根據(jù)磁信號(hào)進(jìn)行分析，磁信號(hào)屬于穿透信號(hào)，磁信號(hào)分析設(shè)備可以處理整個(gè)NC膜厚度的磁信號(hào)[19]，能夠滿(mǎn)足高靈敏度和定量檢測(cè)的需求。但目前商品化的磁信號(hào)分析設(shè)備仍不普遍，磁信號(hào)分析設(shè)備的便攜性和成本限制了定量設(shè)備的推廣和應(yīng)用；而且免疫層析方法的變異系數(shù)較大，這也給定量分析增加了難度。

本試驗(yàn)用磁性微球作為信號(hào)標(biāo)志物構(gòu)建了一種免疫層析快速檢測(cè)試紙，該試紙能夠?qū)︵Z酮類(lèi)藥物進(jìn)行定性，或者對(duì)某種已知的喹諾酮類(lèi)藥物進(jìn)行定量分析。該方法對(duì)于牛奶中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測(cè)限分別為0.37 ng/mL和0.23 ng/mL。同時(shí)該方法表現(xiàn)出較好的基質(zhì)耐受性，基質(zhì)添加溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液具有較高的相關(guān)性，添加回收率的范圍在14.63%～49.81%。該磁性微球免疫層析試紙可推廣到動(dòng)物性食品中其他獸藥、毒素或致病菌的測(cè)定，為食品質(zhì)量安全提供有力的技術(shù)支撐。