張海霞 ， 雷 蕾,2 ， 張振彪 ， 代禾根 , 李 蕾 ， 宋 昱 ， 夏兆飛

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 浙江 杭州 311300)

偽中間葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)是由Devriese等于2005年命名的一種凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌[1]。作為一種共生條件致病菌，偽中間葡萄球菌可導(dǎo)致患貓發(fā)生外耳炎、膀胱炎、膿腫、創(chuàng)傷和皮膚感染等[2-4]。目前，已有大量關(guān)于寵物源(尤其是犬源)耐甲氧西林偽中間葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcuspseudintermedius,MRSP)的研究[2,5-8]。但國(guó)內(nèi)外單獨(dú)關(guān)于貓?jiān)磦沃虚g葡萄球菌的耐藥性調(diào)查均較少。國(guó)內(nèi)外有關(guān)貓?jiān)碝RSP的相關(guān)報(bào)道更為罕見[4,9]。本試驗(yàn)旨在調(diào)查貓?jiān)磁R床樣本中偽中間葡萄球菌的耐藥情況，為貓?jiān)磦沃虚g葡萄球菌的耐藥性監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和細(xì)菌分離 2017年11月—2019年4月收集1 990份送檢至中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院檢驗(yàn)科和第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)的貓?jiān)磁R床樣本，接種于5%綿羊血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和甘露醇氯化鈉瓊脂平板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征，初步篩選出葡萄球菌。

1.2 16S rDNA基因測(cè)序和mecA基因檢測(cè) 使用Magen HiPure Bacterial DNA試劑盒提取制備細(xì)菌DNA模板，貯存于-20 ℃?zhèn)溆?。使?6S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所獲得的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，鑒定細(xì)菌種屬(同源性>99%)。使用合成的特異性引物[10]擴(kuò)增mecA基因，檢測(cè)出mecA基因的菌株為耐甲氧西林偽中間葡萄球菌[11]。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn) 依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)和臨床常用藥物選用10類共14種抗菌藥。苯唑西林、青霉素、萬古霉素、克林霉素、阿米卡星、慶大霉素、利福平、多西環(huán)素、氯霉素和阿奇霉素，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；氟苯尼考、恩諾沙星和環(huán)丙沙星，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；利奈唑胺，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。采用瓊脂稀釋法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，測(cè)定最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration,MIC)。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213。藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI VET08和CLSI 2018 M100。對(duì)3類及3類以上藥物產(chǎn)生耐藥定義為多重耐藥[12]。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用R 4.0.2軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 偽中間葡萄球菌分離鑒定 經(jīng)甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基篩選葡萄球菌后，16S rDNA引物擴(kuò)增電泳獲得目的條帶為1 465 bp的PCR產(chǎn)物(圖1)。將PCR產(chǎn)物測(cè)序拼接后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與偽中間葡萄球菌的序列同源性達(dá)99%～100%。本試驗(yàn)共采集來自臨床患貓的樣本1 990份，分離鑒定獲得偽中間葡萄球菌49株(分離率為2.5%，95%CI：1.8～3.2，n=49/1 990)。

2.2 細(xì)菌來源mecA基因檢測(cè)結(jié)果顯示，34株(69.4%，n=34/49)為MRSP，15株(30.6%，n=15/49)為甲氧西林敏感偽中間葡萄球菌(Methicillin-susceptibleStaphylococcuspseudintermedius,MSSP)。MRSP和MSSP的總體分離率分別為1.7%(95%CI：1.2～2.4，n=34/1 990)和0.8%(95%CI：0.4～1.2，n=15/1 990)。49株偽中間葡萄球菌的來源分布見圖2，包括尿液(57.14%，n=28)、耳道(16.33%，n=8)、鼻腔(6.12%，n=3)、膿腫(6.12%，n=3)、骨骼(4.08%，n=2)、創(chuàng)口(4.08%，n=2)、皮膚(2.04%，n=1)、口腔(2.04%，n=1)和體腔液(2.04%，n=1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在細(xì)菌來源方面，MRSP和MSSP之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同感染部位分離偽中間葡萄球菌的數(shù)量Fig.2 Number of Staphylococcus pseudintermedius isolates from different infection sites

2.3 動(dòng)物特征 49株偽中間葡萄球菌分離自49只患貓的臨床樣本中。其中，29只(59.18%)來自北京市，6只(12.24%)來自廣東省，上海市和遼寧省各3只(6.12%)，山西省、山東省和福建省各2只(4.08%)，江蘇省和天津市各1只(2.04%)；性別分布：雌性13只(26.53%)，雄性35只(71.43%)，性別未知1只(2.04%)；品種分布：英國(guó)短毛貓11只(22.45%)，家養(yǎng)短毛貓13只(26.53%)，美國(guó)短毛貓4只(8.16%)，異國(guó)短毛貓5只(10.20%)，布偶貓和家養(yǎng)長(zhǎng)毛貓各2只(4.08%)，暹羅貓、金吉拉貓、阿比西尼亞貓和蘇格蘭折耳貓各1只(2.04%)，品種未知8只(16.33%)；年齡范圍：除3只年齡未知外，均介于3～192月齡。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在品種和性別方面，MRSP和MSSP之間均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 藥物敏感性試驗(yàn) 49株偽中間葡萄球菌對(duì)青霉素、克林霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、苯唑西林和氯霉素高度耐藥，耐藥率介于53.1%～100.0%；對(duì)氟苯尼考和慶大霉素較敏感；對(duì)利奈唑胺、萬古霉素、阿米卡星和利福平敏感(表1和表2)。MRSP對(duì)青霉素和多西環(huán)素的耐藥率均高達(dá)100.0%。MSSP對(duì)青霉素、克林霉素、阿奇霉素、氯霉素和多西環(huán)素的耐藥率均為60.0%以上。MRSP對(duì)4種抗菌藥物的耐藥率與MSSP呈顯著差異(P<0.05)(表1)。3株MRSP對(duì)苯唑西林敏感，1株MSSP對(duì)苯唑西林耐藥。值得注意的是，49株偽中間葡萄球菌的多重耐藥率高達(dá)100.0%(49/49)，MRSP至少對(duì)4種受試藥物耐藥，MSSP至少對(duì)3種受試藥物耐藥(圖3)。

表1 49株偽中間葡萄球菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥率Table 1 Antimicrobial resistance rates of 49 Staphylococcus pseudintermedius isolates

表2 49株偽中間葡萄球菌分離株的MIC分布Table 2 Distribution of the MIC values of 49 Staphylococcus pseudintermedius isolates

圖3 偽中間葡萄球菌的多重耐藥菌株分布Fig.3 Multidrug resistance distribution of Staphylococcus pseudintermedius isolates

3 討論

本試驗(yàn)中偽中間葡萄球菌的分離率為2.5%，低于馮言言等報(bào)道的華南地區(qū)貓?jiān)磦沃虚g葡萄球菌的分離率[9]；MRSP的總體分離率為1.7%，低于芬蘭和德國(guó)的相關(guān)報(bào)道[2,13]；69.4%的偽中間葡萄球菌為MRSP，高于泰國(guó)的相關(guān)報(bào)道[5]。馮言言等[9]共從采自臨床患貓的樣本中分離到11株偽中間葡萄球菌，來源于耳道、皮膚和尿液。Kadlec等[4]分離到11株來源于臨床患貓的MRSP，涉及的疾病包括敗血癥、尿道感染、腎炎、鼻炎、創(chuàng)口感染和肺炎。Ruscher等[13]分離到6株貓?jiān)碝RSP，來源于創(chuàng)口、泌尿道和耳道。本試驗(yàn)中偽中間葡萄球菌主要來源于尿液和耳道，而馮言言等[9]從尿液中僅分離到1株偽中間葡萄球菌(僅采集到1份尿液樣本)。國(guó)內(nèi)不同研究中出現(xiàn)的樣本來源的不一致性，可能與獸醫(yī)送檢樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的意識(shí)增強(qiáng)相關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，偽中間葡萄球菌對(duì)青霉素、克林霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、苯唑西林和氯霉素高度耐藥；對(duì)氟苯尼考和慶大霉素較敏感。Saputra等[14]報(bào)道13株貓?jiān)磦沃虚g葡萄球菌對(duì)氯霉素和克林霉素耐藥，而對(duì)氟喹諾酮類藥物敏感。Kadlec等[4]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)MRSP分離株對(duì)β內(nèi)酰胺類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、氨基糖苷類藥物、氟喹諾酮類藥物、四環(huán)素類藥物和氯霉素類藥物耐藥。Wegener等[6]的研究中有3株MRSP未表現(xiàn)出苯唑西林耐藥，耐藥表型和耐藥基因不一致的情況還需要進(jìn)一步探索。尤其值得注意的是，本試驗(yàn)中MRSP和MSSP均出現(xiàn)了多重耐藥性，而在犬源偽中間葡萄球菌的相關(guān)報(bào)道中[15]，MRSP的多重耐藥率是MSSP的2～3倍。因此，本試驗(yàn)結(jié)果表明貓?jiān)葱詡沃虚g葡萄球菌存在更為嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，應(yīng)進(jìn)一步探究背后的原因。

偽中間葡萄球菌的耐藥性，尤其是MRSP的耐藥性，已經(jīng)引起了獸醫(yī)領(lǐng)域研究人員的廣泛關(guān)注。而貓?jiān)磦沃虚g葡萄球菌的相關(guān)研究則相對(duì)少見。國(guó)內(nèi)貓?jiān)磦沃虚g葡萄球菌的分離率高于國(guó)外，且MRSP和MSSP均存在多重耐藥性的現(xiàn)狀，給臨床獸醫(yī)敲響了警鐘，提醒臨床獸醫(yī)在工作中應(yīng)合理選擇抗生素，使用抗菌藥物之前盡可能采樣進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(yàn)，致力于減緩細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，維護(hù)公共衛(wèi)生安全。