胡學遠 ， 遲 良 ， 姜 帆 ， 王天琦 ， 劉志鵬 ， 劉煥奇

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 山東 青島 266109 ； 2.青島海關(guān)技術(shù)中心 ， 山東 青島 266002)

脂質(zhì)是人體內(nèi)最主要的能量儲備物質(zhì)之一，其代謝與動物和人類健康息息相關(guān)。研究顯示，脂肪酸代謝紊亂與多種疾病有關(guān)，如2型糖尿病、肥胖癥、高酮血癥和心血管疾病等[1]。在能量攝取充足的情況下，哺乳動物主要依靠燃燒碳水化合物來產(chǎn)生能量，供給生命活動。而在葡萄糖不足以供給機體能量時，存儲在脂肪組織中的甘油三酯則會被動員水解為脂肪酸，通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運至肝臟，并主要通過肝細胞線粒體進行β氧化。脂肪酸完全氧化會生成α-酮戊二酸進入三羧酸循環(huán)，直接提供能量或進入生糖途徑，但是當β氧化途徑飽和時則會進行不完全氧化產(chǎn)生丙酮等。非酯化脂肪酸(Non-esterified fatty acid,NEFA)又稱為游離脂肪酸，是體內(nèi)中性脂肪分解的物質(zhì)，主要在肝臟內(nèi)通過β氧化代謝。生理條件下，NEFA在血液中的含量較低，但在某些應激或病理因素刺激下導致甘油三酯升高時，往往伴隨NEFA升高。過多的NFEA進入肝臟會導致其不能被完全氧化，而是通過不完全氧化酯化成丙酮，導致人類或動物的高酮血癥。NEFA還可以抑制葡萄糖的氧化和轉(zhuǎn)運，引起胰島素抵抗[2]。NEFA也是導致氧化應激的主要物質(zhì)之一，NEFA經(jīng)過線粒體氧化，產(chǎn)生大量的自由基，可以通過多條途徑產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，進而導致組織細胞氧化應激損傷，最終引起細胞凋亡。NEFA還可以減少細胞內(nèi)谷胱甘肽含量，損傷內(nèi)源性的抗氧化防御系統(tǒng)[3-4]。

輔酶Q(CoQ)是NADH氧化酶(復合物I)和琥珀酸氧化酶(復合物II)的重要輔酶，對維持線粒體功能穩(wěn)定具有重要作用，如心力衰竭和心肌炎等病人在飲食攝取CoQ10后，可以維持細胞氧化磷酸化和線粒體ATP生成能力[5]。CoQ具有強大的抗氧化和清除自由基功能，當細胞膜暴露于氧化條件下時，CoQ是首先被消耗的抗氧化劑，充當細胞抗氧化的先鋒部隊起到抗氧化功能[6]。動物試驗證實，補充CoQ可以減輕因缺氧或紫外線照射等外部刺激引起的氧化應激和ROS增加[7]。臨床試驗也顯示，CoQ10作為一種抗氧化劑，在治療慢性疾病，如心血管疾病、腎臟疾病和非酒精性脂肪肝等疾病方面具有臨床意義[8]。然而，CoQ10在NEFA誘發(fā)的肝臟氧化應激損傷中的作用尚不明確。因此，本試驗利用NEFA誘導小鼠肝細胞AML12損傷模型，探究CoQ10是否對NEFA誘導的氧化應激損傷具有保護作用，為將來治療NEFA誘導的脂質(zhì)代謝紊亂提供新的思路和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，購自美國Cytiva公司；胎牛血清(FBS)，購自美國Gibco公司；CoQ10粉末，購自美國Sigma公司；氧化應激試劑盒：活性氧(ROS)測定試劑盒(化學熒光法)、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)，均購自南京建成生物工程有限公司；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒和增強型線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)，均購自江蘇碧云天生物有限公司。

NEFA貯存液(52.6 mmol/L)配方參考本課題組已發(fā)表的文章[9]，主要包括硬脂酸、油酸、亞油酸、棕櫚酸和棕櫚油酸；CoQ10貯存液配方(20 mmol/L)：取863.36 mg CoQ10粉末加入49 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，再加入1 mL DMSO助溶，完全溶解后于-20 ℃保存。

1.2 細胞株與細胞培養(yǎng) 小鼠肝細胞系A(chǔ)ML12，來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。細胞使用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞分組及處理 AML12細胞生長至對數(shù)期后，進行消化重懸，按5.0×105個/mL細胞接種于96孔板中，加入總體積為200 μL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至細胞密度達80%～90%后進行細胞毒性和細胞增殖檢測。將細胞消化重懸后，按5.0×104個/mL接種于6孔板中，并分別用含終濃度為0.2 mmol/L(根據(jù)預試驗和先前研究結(jié)果[10]得出)CoQ10(CoQ10組)、1.2 mmol/L(根據(jù)細胞毒性結(jié)果篩選得出)NEFA(NEFA組)和1.2 mmol/L NEFA+0.2 mmol/L CoQ10(CoQ10+NEFA組)的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞生長至密度為80%～90%，進行氧化應激相關(guān)指標檢測和線粒體膜電位檢測。對照組(Control組)加入等體積的DMEM/F12細胞培養(yǎng)液，其余處理步驟均與其他組一致。

1.3.2 細胞毒性與細胞增殖檢測 細胞毒性測定：細胞經(jīng)PBS清洗后，每孔分別重新添加含終濃度為0(對照組)、0.6、1.2、1.8 mmol/L和2.4 mmol/L NEFA的培養(yǎng)液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；之后每孔加入10 μL MTT溶液，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。最后吸去孔中所有溶液終止培養(yǎng)，再加入150 μL MTT溶解液，于搖床低速振蕩10 min，使孔底結(jié)晶充分溶解。溶解后將96孔板放入酶標儀中，在490 nm處測定每孔吸光度。細胞增殖測定：按照1.3.1將細胞分為Control組、CoQ10組、NEFA組和CoQ10+NEFA組，之后按照細胞毒性檢測步驟使用酶標儀檢測細胞增殖情況。細胞毒性和細胞增殖試驗每孔均設立5個重復。

1.3.3 氧化應激相關(guān)指標測定 MDA含量和T-SOD活性檢測：6孔板中細胞生長至密度為80%～90%時進行消化，于1 200 g離心10 min，棄上清收集細胞沉淀。在沉淀中加入0.5 mL PBS重懸，充分混勻，置于超聲細胞破碎儀中充分破碎細胞，得到細胞勻漿，之后根據(jù)試劑盒說明書體系和步驟檢測MDA含量和T-SOD活性。ROS含量檢測：向生長至對數(shù)期的細胞中添加10 μmol/L二氯雙氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針，充分混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)完成后按上述步驟將細胞重懸，轉(zhuǎn)移至新的6孔板中，避光轉(zhuǎn)移至熒光顯微鏡下進行檢測。

1.3.4 線粒體膜電位測定 細胞長至密度達80%～90%時，用PBS清洗2次，隨后加入含50%(v/v)JC-1工作液的培養(yǎng)基，孵育20 min。孵育完成后，棄全部培養(yǎng)液，并加入預冷的JC-1染色緩沖液2 mL充分洗滌3 min，重復2次。最后棄去全部JC-1染色緩沖液，并添加2 mL新鮮培養(yǎng)液，避光轉(zhuǎn)移至熒光顯微鏡下，根據(jù)線粒體膜電位試劑盒說明書步驟及波長，在30 min內(nèi)完成檢測。

1.4 統(tǒng)計與分析 使用GraphPad Prism 8.04軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖，使用Image J軟件對細胞熒光檢測結(jié)果進行定量分析。各組間差異分析采用單因素方差分析配合Tukey事后檢驗，試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，以P<0.01表示有極顯著性差異，以P<0.05表示有顯著性差異，以P>0.05表示無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CoQ10對NEFA誘導AML12細胞毒性的影響 細胞毒性檢測結(jié)果如圖1A所示，AML12細胞存活率隨NEFA濃度升高而降低。與對照組(0 mmol/L)相比，當NEFA濃度在1.2、1.8 mmol/L和2.4 mmol/L時細胞活力均極顯著下降(P<0.01)，表明高濃度NEFA具有明顯細胞毒性。因此，選取1.2 mmol/L NEFA進行后續(xù)試驗。細胞增殖檢測結(jié)果如圖1B所示，單獨添加CoQ10(CoQ10組)對細胞活力無顯著影響(P>0.05)，而CoQ10+NEFA組的細胞活力較NEFA組顯著提高(P<0.05)，表明CoQ10對NEFA誘導的細胞毒性有保護作用。

圖1 CoQ10對NEFA誘導細胞毒性和細胞活力的影響Fig.1 Effects of CoQ10 on NEFA-induced cytotoxicity and cell viabilityA：不同濃度NEFA對AML12細胞毒性的影響； B：CoQ10對NEFA誘導AML12細胞毒性的影響與對照組比較，*：P<0.05，** ：P<0.01； 與CoQ10組比較，#：P<0.05，##：P<0.01； 與NEFA組比較，?：P<0.05；下圖同A:Effect of different concentrations of NEFA on AML12 cytotoxicity; B:Effect of CoQ10 on NEFA-induced AML12 cytotoxicity Compared with the control group,*:P<0.05,** :P<0.01; Compared with the CoQ10 group，#:P<0.05,##:P<0.01; Compared with the NEFA group,?:P<0.05. The same as below

2.2 CoQ10對NEFA誘導AML12細胞氧化應激損傷的影響 MDA檢測結(jié)果如圖2A所示,與對照組相比，CoQ10組肝細胞MDA含量無顯著變化(P>0.05)，而NEFA組MDA含量極顯著升高(P<0.01)；雖然CoQ10+NEFA組中MDA含量較對照組也顯著升高(P<0.05)，但較NEFA組顯著下降(P<0.05)。T-SOD活性檢測結(jié)果如圖2B所示，與對照組相比，CoQ10組細胞T-SOD活性無顯著變化(P>0.05)，但NEFA組T-SOD活性極顯著降低(P<0.01)，而CoQ10+NEFA組細胞T-SOD活性顯著高于NEFA組(P<0.05)。以上結(jié)果表明，NEFA可誘發(fā)AML12細胞氧化應激損傷，CoQ10對NEFA誘導的細胞氧化應激損傷具有保護作用。

圖2 CoQ10對NEFA誘導AML12細胞MDA含量(A)和T-SOD活性(B)的影響Fig.2 Effect of CoQ10 on NEFA-induced MDA level (A) and T-SOD vitality (B) in AML12 cells

為了進一步驗證CoQ10對NEFA誘導AML12細胞氧化應激損傷的保護作用，本試驗又對細胞ROS釋放情況進行了檢測。結(jié)果如圖3所示，與對照組(圖3A)相比，CoQ10組(圖3B)細胞熒光強度無顯著變化，而NEFA組(圖3C)熒光強度顯著升高，但CoQ10+NEFA組(圖3D)熒光強度較NEFA組顯著降低。定量分析結(jié)果如圖4所示，CoQ10+NEFA組ROS水平顯著低于NEFA組(P<0.05)，但依然極顯著高于對照組和CoQ10組(P<0.01)。表明NEFA可誘導細胞產(chǎn)生大量ROS，導致細胞氧化應激損傷，CoQ10可以通過下調(diào)ROS，減輕NEFA引起的細胞氧化應激損傷。

圖3 CoQ10對NEFA誘導AML12細胞ROS含量的影響Fig.3 Effect of CoQ10 on NEFA-induced ROS levels in AML12 cellsA：Control組； B：CoQ10組； C：NEFA組； D：CoQ10+NEFA組A:Control group; B:CoQ10 group; C:NEFA group; D:CoQ10+NEFA group

圖4 定量分析CoQ10對NEFA誘導AML12細胞ROS的影響Fig.4 Quantitative analysis the effect of CoQ10 on NEFA-induced ROS levels in AML12 cells

2.3 CoQ10對NEFA誘導AML12細胞線粒體膜電位變化的影響 線粒體是ROS生成的主要部位，因此有必要檢測CoQ10對線粒體功能的影響。本試驗對細胞膜電位的檢測結(jié)果如圖5所示，與對照組和CoQ10組相比,NEFA組中高線粒體膜電位(紅色熒光)明顯減少，而低線粒體膜電位(綠色熒光)明顯增強，表明NEFA可導致線粒體膜電位下降。但與NEFA組比較，CoQ10+NEFA組高線粒體膜電位明顯提高，且低線粒體膜電位明顯減弱。

圖5 CoQ10對NEFA誘導AML12細胞線粒體膜電位的影響 (100×)Fig.5 Effect of CoQ10 on NEFA-induced mitochondrial membrane potential changes in AML12 cells (100×)

將熒光圖像進行相對定量分析，得到紅色/綠色平均熒光強度比值，結(jié)果如圖6所示，與對照組和CoQ10組相比，NEFA組紅色/綠色平均熒光強度比率極顯著降低(P<0.01)，而CoQ10+NEFA組紅色/綠色平均熒光強度比率顯著高于NEFA組(P<0.05)，表明CoQ10可以減輕NEFA誘導的線粒體膜電位降低。

圖6 定量分析CoQ10對NEFA誘導AML12細胞線粒體膜電位的影響Fig.6 Quantitative analysis the effect of CoQ10 on NEFA-induced mitochondrial membrane potential changes in AML12 cells

3 討論

氧化應激可以誘導線粒體功能紊亂，啟動細胞凋亡、炎癥反應等信號傳導。例如，游離脂肪酸(棕櫚酸)可以通過增加ROS的產(chǎn)生來激活半胱天冬酶級聯(lián)反應，誘導線粒體紊亂，從而誘導凋亡[11-12]。高脂飲食等原因引起的血清中NEFA升高可以誘發(fā)人類和動物胰腺、肝臟和骨關(guān)節(jié)等多種組織和細胞的氧應激損傷，并且與糖尿病、高酮血癥等發(fā)病機制密切相關(guān)[13-16]。此外，NEFA也被作為診斷奶牛酮病的有效標志之一，在酮病的致病機理中發(fā)揮重要作用[17-18]。體外試驗證實，高NEFA可誘發(fā)奶牛肝細胞氧化應激損傷，造成線粒體功能紊亂[19]。體內(nèi)試驗也證實，酮病奶牛體內(nèi)NEFA濃度與過氧化氫(H2O2)和MDA等促氧化應激指標呈正相關(guān)，而與SOD和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶(GSH-Px)活性呈負相關(guān)[20]，由此可知，NEFA誘導的氧化應激損傷可能是導致人類和動物高酮血癥和糖尿病的重要原因。CoQ是一種具有還原性質(zhì)的重要輔酶，已被證實具有抗氧化和清除自由基的作用，但其對NEFA造成的氧化應激損傷是否有保護作用未見報道。因此，本試驗通過復制小鼠肝細胞(AML12)NEFA暴露模型，探究CoQ10在NEFA誘導細胞氧化應激損傷中的作用。

本試驗結(jié)果顯示，AML12細胞經(jīng)1.2 mmol/L NEFA刺激后細胞活力顯著下降，說明此濃度NEFA可引起明顯的細胞毒性。史曉霞等[21]在評估NEFA對體外培養(yǎng)犢牛原代肝細胞炎性因子表達的影響時也發(fā)現(xiàn)，1.2 mmol/L NEFA能顯著提高牛肝細胞腫瘤壞死因子α和白介素1β的表達，但對白介素6影響較小。雷林[22]使用1.8 mmol/L NEFA刺激體外培養(yǎng)犢牛肝細胞，證實NEFA可以顯著激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路。董記紅等[19]的研究顯示，用1.2 mmol/L NEFA處理原代培養(yǎng)的犢牛肝細胞時，細胞中MDA水平顯著升高，而抗氧化酶SOD活性顯著下降，與本試驗結(jié)果相似。綜合以上文獻基礎(chǔ)與細胞毒性試驗結(jié)果，本試驗最終選取了1.2 mmol/L NEFA進行后續(xù)試驗。氧化應激相關(guān)指標檢測結(jié)果顯示，NEFA能顯著上調(diào)小鼠肝細胞MDA水平，而添加CoQ10后細胞MDA含量明顯降低，推測CoQ10對NEFA誘導的細胞氧化損傷有一定的保護效果。細胞中抗氧化酶SOD活性是反映氧化應激狀態(tài)的重要指標，通常會與細胞中MDA含量聯(lián)合檢測，更準確地反映細胞氧化應激狀態(tài)。本試驗發(fā)現(xiàn)，NEFA可以顯著降低細胞SOD活力，表明NEFA導致了O·的產(chǎn)生，并超出了SOD的清除能力。而在加入CoQ10干預后，細胞SOD活力較NEFA單獨處理顯著升高，說明CoQ10能抑制細胞O·產(chǎn)生或激活細胞抗氧化酶活化的相關(guān)通路，起到減輕氧化應激的能力，但仍需進一步試驗驗證。

線粒體是能量產(chǎn)生的主要場所，細胞呼吸產(chǎn)能時會釋放ROS，因此，線粒體是ROS產(chǎn)生的主要部位。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度NEFA也可激活人單核細胞還原型輔酶II產(chǎn)生大量ROS，促使單核細胞發(fā)生氧化應激損傷，表明NEFA可通過誘導線粒體產(chǎn)生大量ROS，導致細胞氧化損傷。本試驗對ROS的檢測和定量分析結(jié)果顯示，對照組和CoQ10組中僅有少量的綠色熒光，說明氧化還原處于較為平衡狀態(tài)，但NEFA組中ROS的平均熒光強度較對照組顯著增加，表示NEFA誘導產(chǎn)生大量的ROS，而CoQ10+NEFA組細胞ROS熒光強度較NEFA組明顯降低，提示CoQ10可以通過減少ROS產(chǎn)生，進而降低NEFA誘導的細胞氧化損傷。綜合ROS、SOD活性和MDA含量的變化，說明CoQ10對NEFA誘導的細胞氧化應激損傷有一定保護作用。線粒體跨膜孔通透性和線粒體膜電位與線粒體超微結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[23]。線粒體的生理超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，會導致ROS、凋亡相關(guān)蛋白Cyt-C、Apaf-1、Caspase-3和Caspase-9等的釋放，最終導致細胞凋亡。本試驗從熒光強度及定量分析發(fā)現(xiàn)，NEFA處理肝細胞后，線粒體膜電位明顯降低，說明NEFA造成線粒體功能紊亂，而添加CoQ10能穩(wěn)定線粒體膜電位，減少NEFA導致的線粒體功能紊亂。

綜上所述，本試驗采用小鼠肝細胞系A(chǔ)ML12作為研究對象，通過檢測氧化應激指標、ROS活性和線粒體膜電位，證實CoQ10能通過穩(wěn)定線粒體膜電位、減少ROS釋放、提高細胞SOD活性來減弱NEFA誘導的肝細胞氧化應激損傷。本試驗為進一步闡述CoQ10對NEFA誘導的氧化應激損傷保護作用機理相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)支持，為深入探究人類糖尿病、高酮血癥和奶牛酮病等與NEFA相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。