姜煥煥，張嘉敏，何洪活，李麗梅，吳倩盈，黃 曉，王 通，

（1.肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100）

熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）是一類植物受不良環(huán)境脅迫后，大量表達(dá)以減輕逆境脅迫損傷的保護(hù)性蛋白.按照分子量大小可分為5類：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP20.其中HSP20分子量在12~42 kDa之間，是一類受逆境脅迫后迅速合成的小分子熱激蛋白，以基因家族的形式存在于植物染色體中[1-2].HSP20基因家族分析已在多種作物中展開研究.擬南芥中鑒定出19個HSP20基因家族成員[3]，白菜中有27個HSP20基因家族成員[4]，辣椒中有35個HSP20基因家族成員[5]，在小麥和大麥中共發(fā)現(xiàn)40個HSP20基因家族成員[6].根據(jù)基因的細(xì)胞位置，序列同源性和基因功能分為多個亞家族.其中擬南芥HSP20基因家族分為12個亞族，分別為：CI、CII、CIII、CIV、CV、CVI、CVII定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核；MI、MII定位在線粒體；P定位于質(zhì)體；PO定位于過氧化物酶體；ER定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[7].此外，關(guān)于HSP20基因家族的表達(dá)模式在多種作物中展開了研究.張寧等人[8]對番茄HSP20基因家族研究表明，其存在多個順式作用元件，參與番茄逆境脅迫響應(yīng).孫宇棟等人[9]研究核桃的HSP20基因?qū)囟让{迫響應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)理，結(jié)果表明核桃JrHSP20-1基因能夠顯著提升轉(zhuǎn)基因酵母對高溫和低溫的耐受能力.郭猛[10]對辣椒CaHSP20基因家族的研究，表明其受逆境脅迫響應(yīng)上調(diào)表達(dá).植物HSP20基因沒有單一表達(dá)模式，同一HSP20基因亞家族的成員也沒有相同的表達(dá)模式.多種生物及非生物（高溫、低溫、干旱）脅迫能夠誘導(dǎo)HSP20基因表達(dá).

花生是我國重要的油料作物之一，其生長及品質(zhì)受逆境脅迫影響.與栽培種相比，野生種花生具有較強(qiáng)的抗逆性.因此，全面鑒定和分析野生種花生HSP20基因家族結(jié)構(gòu)與功能，對揭示其在花生生長發(fā)育過程及逆境脅迫響應(yīng)的分子機(jī)理方面具有重要意義.野生種花生A.duranensis和A.ipaensis的全基因測序已完成，使得在全基因組水平挖掘和鑒定HSP20基因家族成員成為可能[11].本研究基于此基礎(chǔ)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對野生花生全基因組序列進(jìn)行挖掘，鑒定全部HSP20基因家族成員，并對其染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性進(jìn)行分析，為研究花生HSP20基因家族的功能和抗脅迫反應(yīng)機(jī)理提供了支持.

1 材料與方法

1.1 花生HSP 20基因的檢索與鑒定

從Pfam（http:∕∕pfam.xfam.org∕）數(shù)據(jù)庫中獲得HSP20基因家族隱馬爾可夫模型文件，再利用HMMER3.0軟件對野生花生A.duranensis（Aradu.V14167.a1.M1）和A.ipaensis（Araip.K30076.a1.M1）的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索.將搜索到的HSP20基因序列提交到在線工具NCBI（Conserved Domain Search）和Pfam數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)一步鑒定是否含有HSP20蛋白結(jié)構(gòu)域.從花生基因組數(shù)據(jù)庫（http:∕∕peanutbase.org∕）上獲得基因信息.利用在線網(wǎng)站ProtParam（http:∕∕www.expasy.org∕）分析HSP20蛋白的理化性質(zhì).

1.2 花生HSP 20基因家族進(jìn)化分析

從擬南芥數(shù)據(jù)庫中下載HSP20基因組序列.將檢索到的A.duranensis和A.ipaensis的HSP20基因組序列保存為FASTA格式，用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對，MEGA7.0軟件鄰接法（Neighbor-Joining Joining）進(jìn)行系統(tǒng)化樹的構(gòu)建.

1.3 花生HSP 20基因染色體定位分析

從Peanutbase（http:∕∕peanutbase.org∕）數(shù)據(jù)庫中查找花生HSP20基因位置及各條染色體長度，利用軟件MapInspect繪制染色體定位圖.

1.4 花生HSP 20基因結(jié)構(gòu)和保守基序預(yù)測

從Peanutbase（http:∕∕peanutbase.org∕）數(shù)據(jù)庫下載AdHSP20基因和AiHSP20基因的編碼區(qū)序列（CDS）和基因組序列，利用在線網(wǎng)站GSDS繪制蛋白結(jié)構(gòu)圖.采用MEME（http:∕∕meme-suite.org∕）在線工具對該基因家族的基序（Motif）進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)基序最多值設(shè)置為5，其余不做改動.

1.5 花生HSP 20基因家族表達(dá)特性分析

從花生基因組數(shù)據(jù)庫中下載野生種花生RNA-Seq測序的基因表達(dá)數(shù)據(jù)（https:∕∕www.peanutbase.org∕gene_expression）.利用hemI軟件將對HSP20基因家族在花生不同組織器官的表達(dá)模式進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖.

1.6 花生HSP 20基因家族上游調(diào)控序列分析

在Peanutbase數(shù)據(jù)庫中獲得HSP20基因的NCBI編號，將NCBI編號逐一提交到NCBI在線軟件中，找出并下載每個基因的上游2 000 bp序列，利用軟件plantcare（http:∕∕bioinformatics.psb.ugent.be∕webtools∕plantcare∕html∕）進(jìn)行順式作用元件分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 花生HSP 20家族基因的鑒定及特性分析

通過HMMER軟件搜索花生基因組數(shù)據(jù)庫和進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)域確認(rèn)，共鑒定出AdHSP20基因和AiHSP20基因各27個.根據(jù)染色體定位信息分別命名為AdHSP20-1～AdHSP20-27和AiHSP20-1～AiHSP20-27.在PeanutBase數(shù)據(jù)庫中獲得HSP20基因的基本信息，并利用ProtParam分析HSP20蛋白的等電點和分子量，結(jié)果如表1和表2所示.AdHSP20基因長度差異很大，最短的是AdHSP20-4（438 bp），最長的是AdHSP20-5（7 896 bp）；其中，13個AdHSP20家族成員的等電點在4.77～6.93，14個AdHSP20家族成員的等電點在7.74～9.74；其分子量為14 194.11～74 147.53 D.AiHSP20基因家族基因長度為946 bp~1 103 bp.AiHSP20蛋白組成大多數(shù)為酸性氨基酸，氨基酸長度在110~2 062 Aa之間.其分子量的最小值35 791.87 Da（AiHSP20-8），最大值是1 230 785 Da（AiHSP20-23）.

表1 野生種花生A.duranensis的HSP 20基因信息

表2 野生種花生A.paensis的HSP 20基因信息

2.2 花生HSP 20基因家族進(jìn)化分析

下載擬南芥HSP20基因序列并和野生花生HSP20基因家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖1）.結(jié)果可以看出，花生HSP20的基因家族成員與擬南芥HSP20基因同源性程度較高.27個AdHSP20基因家族分為4個亞家族，每個亞家族數(shù)量不等.其中20個AdHSP20基因（74.07%）定位在細(xì)胞核（C），4個AdHSP20基因（14.81%)定位于線粒體（M），2個AdHSP20基因（7.41%）定位于過氧化物酶體（PO），1個AdHSP20基因（3.70%）定位在質(zhì)體（P），沒有定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中的基因.AiHSP20基因家族分為11個亞族，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）有1個基因，質(zhì)體（P）有2個基因，線粒體（MII）有1個基因，線粒體（MI）有2個基因，除了細(xì)胞核（CII）含有2個基因外，CIII、CVI、CVII分別含有1個基因，而CI有6個基因.

圖1 花生HSP 20基因家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

2.3 HSP 20基因家族染色體定位分析

分析HSP20基因家族染色體定位信息，繪制染色體定位圖（圖2）.從圖中可以看出，27個AdHSP20基因隨機(jī)分布在1到9號染色體上，其中，5號染色體上只有1個AdHSP20成員，1、4、9和10號染色體上各有2個AdHSP20成員，2和3號染色體上存在3個AdHSP20成員，8號染色體上有5個成員，7號染色體上分布最多，為7個AdHSP20成員.存在4對串聯(lián)重復(fù)序列（AdHSP20-14∕AdHSP20-15，AdHSP20-14∕AdHSP20-15∕AdHSP20-16，AdHSP20-17∕AdHSP20-18，AdHSP20-19∕AdHSP20-20）.AiHSP20基因家族成員分布在9條染色體的不同位置上.7號染色體包含9個基因，5號染色體包含1個基因，1號和4號染色體包含3個基因，2、6、9和10號染色體各包含2個基因.存在2對串聯(lián)的重復(fù)序列（AiHSP20-21∕AiHSP20-22∕AiHSP20-23，AiHSP20-26∕AiHSP20-27）.

圖2 HSP 20基因家族染色體定位分析

2.4 花生HSP 20基因家族結(jié)構(gòu)及保守基序分析

HSP20基因家族的內(nèi)含子-外顯子及其保守基序分析如圖3所示.在27個AdHSP20基因中，6個基因不含內(nèi)含子，15個基因含有1個內(nèi)含子，其余基因家族成員含有2~10個內(nèi)含子.AdHSP20基因家族含有的外顯子數(shù)目差距比較大，只含有1個外顯子的基因家族成員有6個，含有2個外顯子（CDS）的成員最多，多達(dá)15個，6個成員的外顯子數(shù)在3~11之間.花生AiHSP20基因家族外顯子的數(shù)量通常為2個，而AiHSP20-8基因僅包含1個外顯子；其余基因包含有3至7個；AiHSP20-5和AiHSP20-21基因含有12個外顯子；AiHSP20-25為17個.保守基序結(jié)果顯示，在27個AdHSP20基因家族成員中，除了AdHSP20-14和AdHSP20-23這2個家族成員無Motif外，其他都有1至4個Motif，其中4個AdHSP20家族成員只有1個Motif，12個AdHSP20基因家族成員有2個Motif，7個AdHSP20基因家族成員有3個Motif，2個AdHSP20基因家族成員有4個Motif.Motif1和Motif2存在于大部分AiHSP20基因中，只有AiHSP20-18、AiHSP20-19和AiHSP20-20存在Motif3、Motif4和Motif5；AiHSP20-3、AiHSP20-5、AiHSP20-10只存在Motif1而AiHSP20-4、AiHSP20-14沒有基序.從圖中還可以看出有21個AdHSP20基因家族成員同時含有Motif1和Motif2，通過對比可以發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系越相近的基因家族成員，其Motif分布的數(shù)量和位置也越相同.這些結(jié)果表明這27個AdHSP20基因家族成員可能具有相對較高的保守性.

圖3 花生HSP 20基因家族結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析

2.5 花生HSP 20基因家族組織表達(dá)特性

以花生野生種22個組織中基因表達(dá)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，提取HSP20基因相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)行組織表達(dá)模式分析，結(jié)果如圖4所示.可以看出，HSP20基因家族在花生的22個組織中表達(dá)情況不同.大部分基因在花及種子的不同發(fā)育時期表達(dá)量低.Aradu.EM2UC，Araip.KV8CW，Araip.SBC75，Aradu.BGMOC，Araip.96WUD，Aradu.VOJK3，Aradu.4G8YD，Aradu.L4J2W，Araip.J4RXP，Aradu.BJ6ZM，Arai p GC3C4，Araip.9ZW22，Aradu.Z42XR，Araip.E6U9Y，Aradu.SJ2KY，Aradu WLIAY在22個組織中表達(dá)量低.其中，Araip.WTB7G僅在根中低表達(dá)，Aradu.BJ6ZM僅在雌蕊中表達(dá)，Araip.IW5F0基因在所有組織中都無表達(dá).2個野生種花生中各有5個基因在22個組中高表達(dá).其中，A.duranensis中高表達(dá)基因為AdHSP20-7（Aradu.XVU7P），AdHSP20-8（Aradu.XQ3RE），AdHSP20-17（Aradu.RYN4L），AdHSP20-20（Aradu.WH8HR），AdHSP20-24（Aradu.65PX4）；A.ipaensis中在各組織表達(dá)量較高的基因分別為AiHSP20-6（Araip.PRK60），AiHSP20-7（Araip.E15FG），AiHSP20-15（Araip.VGJ9R），AiHSP20-16（Araip.T9454），AiHSP20-25（Araip.KY2NA）.

圖4 HSP 20基因家族的組織表達(dá)情況分析

2.6 花生HSP 20基因家族成員上游調(diào)控序列分析

研究分別對27個AdHSP20和AiHSP20基因的啟動子區(qū)進(jìn)行檢索，查找其存在的參與脅迫基因的順式作用元件，結(jié)果如表3和表4所示.由表中可以看出，不同HSP20基因家族成員的順式作用元件種類和數(shù)目存在差異.主要有激素應(yīng)答元件和逆境脅迫應(yīng)答元件這2大類.激素應(yīng)答元件有ABA應(yīng)答元件（ABRE）、生長素應(yīng)答元件（AuxRR-cor∕TGA-element）、乙烯應(yīng)答元件（ERE）、赤霉素應(yīng)答元件（GARE-motif∕P-box∕TATC-box）、水楊酸應(yīng)答元件（TCA-element）和茉莉酸甲酯應(yīng)答元件（CGTCA-motif∕TGACG-motif）這6種.其中，22個AdHSP20因含有ABA應(yīng)答元件，17個AdHSP20基因含有1至4個生長素順式作用元件.逆境脅迫應(yīng)答有LTR（低溫脅迫應(yīng)答元件）、MBS（干旱脅迫應(yīng)答元件，WUN motif（傷害應(yīng)答元件）和TC-rich repeats（防御與脅迫應(yīng)答元件）這4種.其中，13個AdHSP20基因家族成員含有低溫脅迫應(yīng)答元件和干旱脅迫應(yīng)答元件，7個AiHSP20基因具有低溫脅迫元件（LTR），20個AiHSP20基因具有干旱脅迫應(yīng)答元件（MBS），其中AiHSP20-4含有最多MBS元件（3個）；7個AiHSP20基因具有WUN-motif（7個），12個AiHSP20基因具有TC-rich repeats，其中AiHSP20-2含有2個.說明HSP20在花生生長發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫中起到了重要作用.

表3 AdHSP 20基因啟動子區(qū)順式作用元件種類及個數(shù)

表4 AiHSP 20基因家族啟動子區(qū)順式作用元件分析

3 討論

HSP20是一類廣泛存在于植物中的小分子熱激蛋白，在植物受到不良環(huán)境，比如低溫、高溫、干旱、鹽、氧化等脅迫后迅速大量合成.野生花生具有較強(qiáng)的抗逆性和抗病性，但其HSP20基因家族分析還未見報道.本研究利用生物信息學(xué)方法對2個野生種花生HSP20基因家族進(jìn)行挖掘鑒定，發(fā)現(xiàn)2個野生種各有27個HSP20基因家族成員.比擬南芥（19個），白菜（27個），辣椒（35個）中的基因家族成員多[3-5].花生HSP20蛋白多數(shù)為酸性氨基酸，與壇紫菜HSP20蛋白的分析結(jié)果一致[12].這些基因多數(shù)定位于細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)中，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體、過氧化物酶體的HSP20基因成員只有少數(shù)，這與張寧等人[8]對番茄HSP20基因家族成員分析結(jié)果一致.Scharf等[3]對擬南芥19個HSP20基因家族成員的研究表明，定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中的基因有13個，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體、過氧化物酶體的基因有6個；Sarkar等[13]對水稻的23個HSP20基因家族成員的分析表明，分布在細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)中的有16個基因，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體、過氧化物酶體的有7個基因.說明HSP20家族基因間存在多樣性，這為進(jìn)一步深入研究HSP20基因功能提供了理論基礎(chǔ).

本研究對野生種花生HSP20基因結(jié)構(gòu)，基因位置，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和保守基序研究結(jié)果顯示，基因結(jié)構(gòu)不同，內(nèi)含子個數(shù)多數(shù)為0到1個，且長度比較短.這與Mattick等[14]研究的植物傾向于保留無內(nèi)含子或者長度較短的內(nèi)含子基因一致.何福林等人[15]研究表明，銀杏HSP20基因的每個亞家族中成員均具有相似的分布特征.同時，對其染色體分布研究表明，花生中HSP20基因家族存在著多對串聯(lián)重復(fù)序列.親緣關(guān)系越相近的HSP20基因家族成員，其Motif分布的數(shù)量和位置也越相同.這些結(jié)果表明該基因家族在進(jìn)化進(jìn)程中高度保守.

多種生物及非生物（高溫、低溫、干旱）脅迫能夠誘導(dǎo)HSP20基因上調(diào)表達(dá)，其啟動子上游調(diào)控序列對其表達(dá)水平發(fā)揮著重要作用[16-17].花生在不同生長發(fā)育階段受干旱等逆境脅迫，影響著花生的品質(zhì)和產(chǎn)量.本研究在對HSP20基因啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明，其存在逆境脅迫應(yīng)答元件，大多數(shù)HSP20基因家族成員含有低溫、干旱脅迫應(yīng)答元件、傷害應(yīng)答元件與防御與脅迫應(yīng)答元件.初步推測該基因參與花生抵抗低溫脅迫和干旱脅迫反應(yīng).鄧立新等人[18]克隆雙孢蘑菇的HSP20基因并在擬南芥中表達(dá)，結(jié)果顯示，HSP20基因的表達(dá)增加了擬南芥的耐熱性.周亞東等人[19]研究表明，番茄HSP20基因受高溫脅迫表達(dá)量增加.另外，該基因還存在著大量的激素應(yīng)答元件，表明其參與植物生長發(fā)育過程的調(diào)控.對該基因家族的組織表達(dá)特性分析結(jié)果也表明，HSP20基因家族具有組織表達(dá)特異性，且大部分基因在花生果針入土后開始大量表達(dá).推測這些基因參與植物細(xì)胞內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過程，對調(diào)控花生生長過程發(fā)育起著重要作用.此外，每個基因具有多個響應(yīng)元件，這說明花生中的HSP20基因家族的每個成員同時參與多個信號通路，因此下一步的主要任務(wù)是對HSP20基因的表達(dá)和調(diào)控差異及其調(diào)控機(jī)理的研究.

4 結(jié)論

HSP20是一類廣泛存在于植物中的小分子熱激蛋白，以基因家族的形式存在，在植物受到逆境脅迫后迅速大量合成.本研究利用生物信息學(xué)方法對花生全基因組序列挖掘，共鑒定出54個HSP20基因家族成員，進(jìn)一步分析其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、染色體定位和表達(dá)特性，可初步推測出該基因家族在花生抵抗非生物脅迫（低溫脅迫、干旱脅迫等）及植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，為將來深入研究花生HSP20功能奠定了基礎(chǔ).