陳延武,崔錦濤,康武林,袁普衛(wèi),王占魁△

(1.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

腰椎間盤退變(Lumbar intervertebral disc degenera-tion，LIDD)是誘發(fā)包括下腰痛(Low back pain，LBP)在內(nèi)的一系列椎間盤相關(guān)疾病的最常見(jiàn)原因[1-3]。在一份報(bào)告中顯示，成人慢性腰背疼痛的發(fā)生率達(dá)到了38.9%[4]，LBP已經(jīng)是致使成人喪失勞動(dòng)力的主要元兇之一[5-7]。

諸多研究認(rèn)為，電針對(duì)腰椎間盤退變性疾病具有良好的治療作用。單衍麗采用電針療法對(duì)比藥物治療腰椎間盤突出癥發(fā)現(xiàn)，電針可大幅改善腰椎間盤突出后癥狀并且優(yōu)于藥物治療[8]。Carolyn E等學(xué)者也認(rèn)為針刺對(duì)于腰痛的治療是安全有效的，尤其在藥物治療不佳時(shí)，針刺治療具有很好的替代性[9]。然而，針刺具體是通過(guò)何種途徑治療下腰痛、抑制椎間盤退變的，其具體作用機(jī)制目前相關(guān)研究尚不明確。線粒體自噬對(duì)于微環(huán)境的調(diào)控有重要的意義，它是通過(guò)細(xì)胞自噬的方式選擇性地清除受損或者多余的線粒體，從而維持相對(duì)穩(wěn)態(tài)。本研究筆者通過(guò)電針誘導(dǎo)腰椎間盤髓核細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬，分析其抑制LIDD的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g[恩斯維爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK(陜)2018-001]。在陜西中醫(yī)藥大學(xué)南校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)，每籠5只，自由進(jìn)食飲水，室溫控制19～24 ℃，濕度45%～55%，待SD大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后即可開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、電針組與假電針組，每組15只。

1.2 主要儀器設(shè)備、試劑與耗材

1.2.1 儀器設(shè)備 電子針療儀(華佗牌電針儀，SDZ-Ⅱ型)；Micro-CT[布魯克(北京)科技有限公司，SKYSCAN1276]；脫水機(jī)、包埋機(jī)和凍臺(tái)(武漢俊杰電子，JJ-12J)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器，RM2016)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康，NIKON ECLIPSE CI)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室，Bio-Rad)；凝膠成像儀(上海勤翔儀器，Clinx)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)艾本德，Eppendorf)等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材 中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蘇木素-伊紅染液、RIPA裂解液(中)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PMSF(UBI)；Cox2一抗(AF7003)；異氟烷(國(guó)藥準(zhǔn)字H19980141)；頭孢呋辛鈉(國(guó)藥準(zhǔn)字H20065708)；針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，0.3 mm×25 mm)等。

1.3 動(dòng)物模型的建立及治療方案

1.3.1 動(dòng)物模型的建立 所有大鼠術(shù)前8 h禁食，4 h禁飲。根據(jù)付方達(dá)等[10]報(bào)道的方法復(fù)制LIDD大鼠動(dòng)物模型：采用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，待麻醉起效后剃除目標(biāo)節(jié)段脊柱區(qū)毛發(fā)，判別施術(shù)部位，分別用碘伏、酒精棉球消毒術(shù)區(qū)皮膚，確認(rèn)手術(shù)部位后沿脊柱縱行向下銳性切開(kāi)皮膚，鈍性剝離筋膜，使大鼠的豎脊肌充分顯露，并將兩側(cè)豎脊肌軸向鈍性分離(必要時(shí)可切斷部分豎脊肌)，完全顯露大鼠腰椎棘突，以大鼠髂前上棘正對(duì)L5～6椎間隙進(jìn)行定位，判別無(wú)誤后徹底剪斷腰L3～5節(jié)段的棘突、棘上及棘間韌帶等組織結(jié)構(gòu)，檢查臟器無(wú)出血、腹膜完整后，碘伏徹底消毒，在傷口處涂抹適量頭孢呋辛鈉預(yù)防感染，將肌肉、筋膜和皮膚等創(chuàng)口逐層關(guān)閉。假手術(shù)組：僅行豎脊肌鈍性分離，不咬除棘突及棘上及棘間韌帶等結(jié)構(gòu)，其余操作技術(shù)及手術(shù)方式同造模各組。

1.3.2 治療方案 電針組大鼠選取雙側(cè)的夾脊穴L3～5，采用0.3 mm×25 mm毫針直刺0.5～0.7 cm(避免傷及脊髓),快速捻轉(zhuǎn)刺入腧穴，針下有沉澀感后，針柄連接電針儀，同對(duì)電極應(yīng)連接同節(jié)段椎體的腧穴，儀器參數(shù)設(shè)置：疏密波，2 Hz/15 Hz，強(qiáng)度1～2 mA，連續(xù)干預(yù)4周，20 min/次，1次/2 d。假電針組大鼠針刺治療同電針組，但是針柄不連接電針儀。假手術(shù)組與模型組在假電針組與電針組進(jìn)行治療時(shí)，均施加同等時(shí)間及強(qiáng)度的約束，確保外在刺激的一致性。

1.4 取材方案

末次治療結(jié)束24 h內(nèi)，采用異氟烷過(guò)量吸入麻醉后處死，解剖脊柱區(qū)，8只大鼠取下椎體組織及椎間盤組織，用于病理學(xué)檢測(cè)和Micro-CT掃描，放置于足量的4%多聚甲醛固定液中，常溫下保存；7只大鼠的椎間盤組織，用于檢測(cè)髓核細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平，放入-80 ℃冰箱中備用。

1.5 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.5.1 椎體間隙高度變化 使用Micro-CT對(duì)椎間盤組織進(jìn)行掃描并重建，重建后沿正中矢狀線進(jìn)行斷層處理，保存并導(dǎo)出圖片。

1.5.2 病理學(xué)染色 將固定、脫鈣后的椎間盤組織包埋并切片，然后常規(guī)HE染色，在光鏡進(jìn)行觀察。

1.5.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量 使用Western blot法檢測(cè)各組大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin的蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Micro-CT觀察L3～4與L4～5椎體間隙高度變化

CT掃描完成后，將每個(gè)椎間隙均分五等份，使用ImageJ軟件分別測(cè)量各組大鼠L3～4與L4～5椎間隙高度備用。通過(guò)測(cè)量發(fā)現(xiàn)咬除棘突及相關(guān)韌帶的各組大鼠椎間隙明顯減小，較假手術(shù)組差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而通過(guò)針刺治療后，電針組與假電針組的椎間隙高度部分恢復(fù)，較模型組差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針組與假電針組相比較，發(fā)現(xiàn)電針組椎間隙高度明顯大于假電針組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

表1 各組椎間隙高度變化情況比較

2.2 腰椎間盤組織病理學(xué)染色比較

各組病理切片HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組髓核細(xì)胞位置居中，排布均勻，形態(tài)大而圓，纖維環(huán)排列整齊規(guī)則；模型組明顯可見(jiàn)髓核細(xì)胞皺縮，形態(tài)各異，多似纖維條索狀，纖維環(huán)排布紊亂呈橢圓形；電針組髓核細(xì)胞位置居中，排布大致均勻，形態(tài)較大、似橢圓形，纖維環(huán)排布大體正常；假電針組髓核細(xì)胞位置基本居中，排布呈中心聚集形態(tài)，周邊部分呈條索狀，纖維環(huán)排布基本正常，稍向側(cè)方突起。見(jiàn)圖2。

2.3 腰椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬情況

根據(jù)蛋白檢測(cè)所得的WB條帶，使用ImageJ軟件測(cè)得相應(yīng)的灰度值。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)復(fù)制LIDD模型的各組大鼠椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin的表達(dá)均下調(diào)，與假手術(shù)組比較差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而電針組與假電針組經(jīng)過(guò)治療后，大鼠椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，與模型組結(jié)果比較差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且電針組與假電針組之間比較，電針組要明顯優(yōu)于假電針組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3和表2。

表2 電針對(duì)LIDD大鼠椎間盤髓核組織中PINK1/Parkin蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

在椎間盤組織逐步發(fā)生退變的過(guò)程中，局部產(chǎn)生的微物質(zhì)能夠激活多種炎性介質(zhì)，而引發(fā)下游炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11-12]，這是發(fā)生LIDD的重要病理基礎(chǔ)。椎間盤組織主要是由中央的膠凍樣髓核、包繞在周圍的纖維環(huán)及上和下面貼附的軟骨終板等組織構(gòu)成，它相當(dāng)于人體縱軸上的“緩沖器”，承接和吸收外界作用在機(jī)體的強(qiáng)大應(yīng)力。隨著年齡增長(zhǎng)或感受異常應(yīng)力后，終板軟骨血供被破壞，組織營(yíng)養(yǎng)供給減少，局部出現(xiàn)鈣化；同時(shí)髓核細(xì)胞的含水量逐漸降低，纖維環(huán)被壓縮變薄，椎間盤彈性降低，椎間隙也逐漸變窄[13-14]；影像學(xué)檢查可以顯示椎間盤組織表現(xiàn)為膨出、突出甚至脫出[15]，整個(gè)脊柱的相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)平衡被打破，臨床上就會(huì)出現(xiàn)腰背部肌肉緊張、疼痛及LBP等[16]一系列不適癥狀。

在LIDD的過(guò)程中，線粒體自噬機(jī)制起著重要的作用[17-18]。線粒體受損之后，會(huì)產(chǎn)生大量的線粒體DNA及活性氧等并釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活PINK1/Parkin通路的自噬信號(hào)，消除受損的線粒體[19]，這是發(fā)生LIDD疾病后機(jī)體細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)作用。通過(guò)siRNA敲除Parkin，促進(jìn)了髓核細(xì)胞的變性和凋亡，并上調(diào)腫瘤壞死因子α等炎性因子的表達(dá)，紅景天苷可以上調(diào)Parkin的表達(dá)，抑制髓核細(xì)胞的凋亡，并消除線粒體受損，促進(jìn)髓核細(xì)胞的存活[20]。MitoQ可以有效改善線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，清除受損的線粒體，增強(qiáng)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)活性，增加髓核細(xì)胞的存活率[21]。Batlevi Y等[22]發(fā)現(xiàn)在小鼠的浦肯野細(xì)胞變性后，線粒體自噬的改變可能引起小腦中神經(jīng)元細(xì)胞死亡。Zhou J等[23]在研究心肌細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，芪藶強(qiáng)心方通過(guò)上調(diào)Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，可降低心肌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)其活性，改善心臟的功能。低水平的胎牛血清可以上調(diào)caspase-9、caspase-3、DNA修復(fù)酶及細(xì)胞色素c等表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞程序性凋亡[24]。有實(shí)驗(yàn)研究[25]證實(shí)，亞精胺通過(guò)激活機(jī)體的自噬反應(yīng)，降低了叔丁基過(guò)氧化氫在髓核細(xì)胞中的凋亡作用，同時(shí)增加Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的合成，降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和軟骨蛋白聚糖抗體(ADAMTS)的分解；此外MRI結(jié)果顯示，大鼠的椎間盤組織學(xué)變性程度降低，說(shuō)明通過(guò)激活自噬，有助于改善椎間盤的功能并延緩其退變。

現(xiàn)代解剖學(xué)證實(shí)，夾脊穴大致位于脊神經(jīng)后支，分布于背部體表及脊柱兩側(cè)深層的肌肉，多與血管伴行穿過(guò)骨纖維孔、棘肌及筋膜等組織[26]。各種因素導(dǎo)致各椎體之間發(fā)生擠壓、移位等情況，引起通行血管、神經(jīng)的孔道被迫變形變窄，誘發(fā)出現(xiàn)腰背部肌肉痙攣、僵直和LBP等一系列臨床癥狀。有研究證實(shí)，電針能夠有效減輕非急性疼痛患者術(shù)后的疼痛癥狀[27-28]。Shan YL[29]通過(guò)電針夾脊穴配伍膀胱經(jīng)穴治療腰椎間盤突出癥患者，腰背疼痛癥狀明顯減輕，治療的有效率84.4%，優(yōu)于藥物組的65.0%。Arriaga-Pizano L等[30]認(rèn)為電針能夠誘導(dǎo)腎上腺素分泌，減少了TNF-α等因子的產(chǎn)生，能夠有效緩解疼痛癥狀，但其作用與藥物治療無(wú)明顯差異；這對(duì)于部分不適合服藥的患者或是很好的替代療法。電針配合小劑量鹽酸氟西丁可以激活疼痛控制系統(tǒng)，改善血液流動(dòng)，緩解疼痛，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，對(duì)軀體疼痛障礙患者療效明顯[31]。有研究[32]使用電針夾脊穴治療以麻木為主要癥狀的椎間盤突出患者，通過(guò)電針規(guī)律性地收縮和舒張運(yùn)動(dòng)刺激局部的肌肉，使緊張的肌肉和筋膜組織得以放松，加快組織的新陳代謝和氣血循行，減輕患者的不適癥狀。電針還能通過(guò)抑制相關(guān)炎性介質(zhì)表達(dá)水平的上調(diào)[33]，并刺激神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，延緩疼痛感覺(jué)的傳遞，改善局部的血供，促進(jìn)椎間盤組織的修復(fù)，緩解腰背部疼痛及放射痛癥狀[34]。

LIDD多因外傷暴力、筋傷骨折；邪氣外侵或外傷失治誤治；腎虧體虛、腰脊失養(yǎng)等引起。中醫(yī)學(xué)中雖未見(jiàn)LIDD的命名，但在一些散見(jiàn)的著作條文對(duì)LIDD很早就有一定的描述及認(rèn)知。《素問(wèn)》曰：“解脈令人腰痛如引帶，常如折腰狀”“痹在于骨則重……在于筋則屈不伸”“骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”；《備急千金要方》云：“腰背痛者，皆是腎氣虛弱，臥冷濕當(dāng)風(fēng)得之”；危亦林也提到:“針決膝腰勾畫(huà)中青赤絡(luò)脈，出血便瘥。腰痛不得俯仰者，令患人正立”。這些著作中的條文論述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中LIDD的臨床特征基本是相同的。電針療法是在針刺的基礎(chǔ)上，配合特制的電針儀，加強(qiáng)局部針感，使針刺作用集中于局部，改善組織的微循環(huán)，以達(dá)到治療疾病的效果。楊繼洲在治療腰痛疾患時(shí)，注重十二正經(jīng)的取穴，選穴少而精，強(qiáng)調(diào)辨證論治在針灸學(xué)中應(yīng)用的同時(shí)，側(cè)重于針刺、灸法和藥物三者的有機(jī)結(jié)合[35]，這一理論在臨床應(yīng)用中得到廣泛認(rèn)可。孫陽(yáng)等[36]對(duì)32例急性腰扭傷患者以電針承山穴進(jìn)行治療，使患者腰部的自主活動(dòng)逐步恢復(fù)，局部的椎小關(guān)節(jié)得以復(fù)位，放松肌肉、筋膜和韌帶等軟組織，使炎性物質(zhì)釋放減少，腰背部疼痛癥狀逐漸緩解；有研究結(jié)果[37]顯示，電針夾脊穴可以有效減輕慢性腰痛患者的疼痛癥狀，還能改善患者焦慮、疲勞的狀態(tài)。Heo I等[38]對(duì)54例背部術(shù)后非急性疼痛的研究證實(shí)，電針能夠有效減輕非急性LBP、改善患者腰背部屈伸不利的癥狀。針刺通過(guò)調(diào)控炎性因子的釋放、局部微環(huán)境的變化和中樞敏感度的強(qiáng)弱等方面[39]，達(dá)到鎮(zhèn)痛效果，但是電針對(duì)LIDD所引起的一系列LBP等癥狀的治療機(jī)制尚未有明確的論述，還需進(jìn)一步探索[40]。

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)脊柱失穩(wěn)原理成功復(fù)制大鼠LIDD模型，通過(guò)對(duì)退變的椎間盤組織進(jìn)行病理學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞皺縮，形態(tài)各異，多似纖維條索狀，纖維環(huán)排布雜亂無(wú)序；使用電針干預(yù)4周后，腰椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin蛋白水平的表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明通過(guò)電針夾脊穴促進(jìn)了髓核細(xì)胞的線粒體自噬，抑制了髓核細(xì)胞的凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的分解，改善了椎間盤的局部微環(huán)境，可能有益于抑制椎間盤內(nèi)炎性因子的釋放，延緩LIDD的進(jìn)程。此外，椎間隙高度的丟失亦是引起LIDD的原因之一，通過(guò)Micro-CT掃描并三維重建及ImageJ測(cè)量椎間隙高度變化證實(shí)，電針刺激夾脊穴能有效恢復(fù)大鼠的腰椎間盤高度，對(duì)緩解LIDD有重要的意義。本研究說(shuō)明了通過(guò)電針刺激夾脊穴是改善腰椎間盤退變的可能機(jī)制，為臨床治療LIDD提供理論依據(jù)。但對(duì)電針調(diào)控線粒體自噬對(duì)上下游炎性因子的影響以及電針的劑量對(duì)線粒體自噬的影響程度大小等情況還需要進(jìn)一步深入研究。