賈坤平，孫忠人，劉關平，裴思穎，蔡國鋒，伊思銳,劉 源,梁 群

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

膿毒癥是一種由宿主對感染的反應失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，可導致組織損傷和器官功能障礙[1]，甚至是死亡率極高的多器官功能障礙綜合征(MODS)[2]，其發(fā)病率已達535人/10萬人，住院死亡率高達25%～30%，是世界各地仍需攻克的一項艱巨任務[3]。膿毒癥的病情發(fā)展較快、預后較差和病死率較高，是重癥醫(yī)學難題之一。根據(jù)《膿毒癥全球負擔報告》，每年有4 900萬人受到感染，導致1 100萬人死亡，最常見的感染部位為肺部、尿路、腹腔和循環(huán)系統(tǒng)的原發(fā)感染[4]。中國是膿毒癥發(fā)生率與死亡率較高的地區(qū)，2018年流行病學數(shù)據(jù)顯示，中國膿毒癥患者每年3 238萬人，死亡率為66.7%[5]，高出全球平均水平。2020年《Lancet》最新數(shù)據(jù)顯示，全球因膿毒癥死亡人數(shù)占全球死亡總數(shù)的19.7%。膿毒癥成為威脅人類生命健康的重要病癥之一[6]。盡管膿毒癥的研究已日趨深化，臨床上不斷有更新?lián)Q代的抗生素投入使用，但至今膿毒癥的死亡率仍未見顯著下降。因此，中醫(yī)藥多靶點的治療優(yōu)勢在膿毒癥的治療中日漸凸顯。本研究通過梳理和分析關于miRNA-膿毒癥、膿毒癥-針灸等相關理論和臨床研究，從微小RNA(MicroRNA,miRNA)視角出發(fā)為針灸治療膿毒癥提供新的治療靶點，為中醫(yī)針灸在急危重癥的臨床推廣和應用提供理論依據(jù)。

1 miRNA在膿毒癥診治中的作用

膿毒癥不僅是一個全身炎癥反應或免疫紊亂的過程，更涉及到體內(nèi)多個器官功能的改變。如圖1[7]所示，在細胞和分子水平，膿毒癥的發(fā)病機制非常復雜，包括炎癥反應失衡、免疫功能紊亂、線粒體損傷、凝血機制受損、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)、自噬和其他病理生理過程，并最終導致器官功能障礙[7]，而miRNA在膿毒癥細胞信號轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)免疫應答中發(fā)揮重要作用[8]。

miRNA是非編碼的短RNA，進化上高度保守，廣泛存在于動植物中，其主要功能是特異性結(jié)合靶mRNA，抑制靶mRNA表達，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達進行調(diào)控，在炎癥、免疫和不同的肺損傷中具有多種生物學功能。miRNA可多效性地面向100～1 000個基因，并在細胞或器官中以特異性的方式發(fā)揮作用。一種miRNA可以調(diào)節(jié)患者體內(nèi)的幾種生物通路。由于其敏感性、特異性和可及性，miRNA被認為是一種理想的生物標志物。有研究已經(jīng)對miRNA在膿毒癥中的作用進行了研究，并證實了膿毒癥患者中特定miRNA及其靶點的改變[9]。許多研究表明[10]，多種miRNAs直接靶向腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)通路，這是膿毒癥中促炎過程的主要調(diào)節(jié)因子；此外，miRNAs通過靶向toll樣受體(TLR)/核因子-κB(Nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB)信號通路在膿毒癥調(diào)控中發(fā)揮功能作用。其中，TLR4被細菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)激活。因此，被認為與膿毒癥最相關,見圖2；同時，miRNA調(diào)控了膿毒癥相關基因的表達，如白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、TNF等，并被這些因子調(diào)控自身的表達,見圖3[10]，凸顯了miRNA在膿毒癥病理生理中的深度整合。既往研究也證實了miRNA表達水平與膿毒癥患者死亡率之間的相關性[11]。尚有研究報道m(xù)iRNA可用于表明病理的存在，及其分期、進展和不同疾病發(fā)病機制的遺傳聯(lián)系[12-15]。此外，miRNA水平的改變可以區(qū)分膿毒癥的不同病理階段[16]；尚可對處于不同病理生理階段的病人提供新穎有效的治療策略[17-19]。

1.1 miRNA在膿毒癥急性肺損傷中的作用

膿毒癥引起的急性肺損傷是膿毒癥最為嚴重的一種癥狀。研究表明過表達miR-574可抗凋亡活性，抑制炎癥反應，抑制ERS作用；上調(diào)miR-574以減輕膿毒癥急性肺損傷可能是通過促進補體C3下調(diào)和減輕ERS實現(xiàn)的[20]。膿毒癥時，循環(huán)中大量細胞受到刺激，如血小板、血管內(nèi)皮細胞與白細胞等，隨后可分泌微泡(Microvesicles，MVs)，其中內(nèi)皮細胞MVs(Endothelial MVs,EMVs)通過轉(zhuǎn)運功能性miR-23b在膿毒癥時肺血管滲漏和肺損傷中發(fā)揮重要作用，通過拮抗EMVs及其miR-23b的分泌，可減輕血管滲漏和肺損傷[21]。Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導膿毒癥小鼠的miR-181a上調(diào)，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuin 1,SIRT1)下調(diào)，并產(chǎn)生強烈的炎癥反應，抑制核轉(zhuǎn)錄因子E2相關因子2的表達，激活NF-κB通路；抑制miR-181a可減輕LPS誘導的炎癥反應和凋亡，這可能是通過上調(diào)其靶點SIRT1表達實現(xiàn)的。尚有研究表明環(huán)狀RNA circC3P1過表達可通過下調(diào)miR-21降低細胞凋亡和促炎細胞因子水平治療膿毒癥急性肺損傷[23]。

1.2 miRNA在膿毒癥急性心肌損傷中的作用

膿毒癥急性心肌損傷是導致膿毒癥死亡的主要原因，其發(fā)生機制可能與心肌細胞凋亡、線粒體功能障礙和細胞外炎癥浸潤等有關。研究發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-132-3p通過抑制髓樣分化蛋白88/NF-κB通路實現(xiàn)抗膿毒癥心肌損傷的作用[24]。

1.3 miRNA在膿毒癥急性腎損傷中的作用

急性腎損傷作為膿毒癥常見合并癥之一，會加重膿毒癥病情，甚至增加病死率，而腎小管上皮細胞損傷被認為是引起膿毒癥急性腎損傷的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a通過靶向信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)減輕膿毒癥腎小管上皮細胞炎癥反應及凋亡[25]。此外，1項162例膿毒癥并發(fā)急性腎損傷患者的隨機對照觀察顯示，miR-146a與病情的嚴重程度及預后相關，對預測該類患者的28 d死亡率有較高價值[26]。此外，miR-15a-5p、miR-192-5p、miR-155-5p、miR-486-5p和miR-423-5p均被證實是膿毒癥急性腎損傷的生物標志物或治療靶點[27]。

1.4 miRNA在膿毒癥肝損傷中的作用

膿毒癥并發(fā)肝損傷是膿毒癥患者死亡的獨立危險因素，其機制可能為微循環(huán)低灌注、缺血缺氧性損傷和肝竇內(nèi)皮細胞功能紊亂等[28]。miR-122a參與膿毒癥肝損傷患者的損傷過程，是評估膿毒癥肝損傷預后和死亡的敏感指標之一[29]。

2 針灸治療膿毒癥的研究進展

針灸療法在膿毒癥的治療中具有積極作用，該作用并不在于直接殺菌、滅毒，而在于對炎癥反應及免疫功能的調(diào)節(jié)和對多器官功能的保護。研究表明[30]，神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的相互協(xié)調(diào)對于炎癥反應的調(diào)節(jié)十分重要，而對“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)系統(tǒng)”的積極調(diào)節(jié)作用是針灸抗炎的關鍵生物學基礎。炎性反應信息由迷走神經(jīng)傳入中樞(相關腦區(qū)主要有迷走背核、孤束核等)，加工整合后，再下行至植物神經(jīng)系統(tǒng)及下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)，進一步調(diào)節(jié)和控制炎性反應。此外，針灸還具有雙向良性調(diào)節(jié)、飽和調(diào)節(jié)和多靶點調(diào)節(jié)的特點，但這些優(yōu)勢又受到機體自穩(wěn)態(tài)機制對針灸干預的整合與利用的影響[31]。

席卷全球的新型冠狀病毒肺炎患者繼發(fā)全身性炎性反應，出現(xiàn)膿毒癥休克是新型冠狀病毒重癥肺炎的重癥并發(fā)癥。2020年2月8日，中國針灸學會發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎針灸干預的指導意見》，推薦疑似病例、輕癥和普通型患者以及恢復期患者使用灸法治療[32]。此外，有大量的循證醫(yī)學證據(jù)表明針灸可以治療炎性反應性疾病，許多動物實驗及隨機對照試驗亦驗證了針灸治療膿毒癥的確切療效。而且已經(jīng)證實，針灸尤其是電針治療膿毒癥的作用機制是激發(fā)迷走抗炎途徑及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[33]。

2.1 針灸對炎癥反應的影響

針灸療法對膿毒癥患者的炎性因子具有調(diào)節(jié)作用。電針足三里穴可降低膿毒癥患者急性生理與慢性健康評分(Acute physiology and chronic health evaluationⅡ, APACHEⅡ)、C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)、降鈣素原(Procalcitonin,PCT)和血清乳酸，升高CD4+、CD8+含量，可調(diào)節(jié)體內(nèi)抗炎與促炎反應趨向平衡，從而降低MODS的發(fā)生率和病死率，改善膿毒癥預后，其機制可能與電針足三里減少體內(nèi)促炎和抗炎介質(zhì)釋放有關[34]。1項108例的大樣本隨機對照試驗(Randomized controlled trial,RCT)發(fā)現(xiàn)在常規(guī)治療基礎上，接受針刺足三里3 d治療的膿毒癥患者，炎性反應因子血清PCT、血乳酸、APACHEⅡ評分及全身性感染相關器官功能衰竭評分(SOFA)等相關指標均顯著降低[35]。結(jié)合筆者及團隊的前期臨床研究表明，電針可降低氣管切開插管患者臨床肺部感染評分，促進肺部感染的恢復[36]，改善肺部的換氣功能[37]；前期實驗研究表明[38]，電針可降低基底節(jié)腦出血動物模型的白細胞計數(shù)，改善肺部的組織病理形態(tài)，均說明電針具有一定的抗炎作用。

2.2 針灸對免疫功能的調(diào)節(jié)

膿毒癥的致病機制復雜，其中免疫調(diào)節(jié)失衡是其重要原因。因此，及時改善免疫抑制是膿毒癥的治療重點。針灸療法能夠明顯改善膿毒癥患者的免疫功能，升高CD3+、CD4+、CD8+、IgG、IgA及IgM含量，縮短ICU住院時間，降低再次住院率及28 d病死率[39]。

2.3 針灸對多器官功能的保護

針灸療法對于膿毒癥患者的胃腸功能具有積極的保護作用，可改善腹腔內(nèi)壓、胃殘余量[40]。2019年的1項大樣本RCT試驗比較了118例膿毒癥胃腸功能障礙患者接受針刺治療的療效差異，發(fā)現(xiàn)在第6天和第10天針刺組胃腸功能障礙評分、炎性反應指標計數(shù)均明顯低于對照組，針刺治療可明顯改善腸道通透性及血液循環(huán)，有助于早期實現(xiàn)目標喂養(yǎng)[41]。

此外，電針能顯著抑制膿毒癥大鼠心肌炎性反應促炎因子的水平發(fā)揮心肌保護作用[42]。電針百會、水溝穴能有效改善膿毒癥相關性腦病患者的腦損傷，提高臨床療效[43]。

電針還可以通過激活PI3K/Akt/Nrf2信號通路，上調(diào)血紅素加氧酶的表達，從而抑制促炎因子的釋放、減少中性粒細胞的聚集，來減輕內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷時的炎性反應，達到肺保護的作用[44]。電針雙側(cè)內(nèi)關、足三里穴可通過Janus蛋白酪氨酸激酶1/STAT3通路減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷，抑制膿毒癥大鼠炎性介質(zhì)的釋放及細胞凋亡[45]。

3 miRNA在針灸治療膿毒癥中的作用機制

研究表明，電針可通過降低miRNA-133a改善膿毒癥心肌損傷患者APACHEⅡ評分、肌鈣蛋白，調(diào)節(jié)抗凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子caspase-3、TNF-α及IL-6，提高左心室射血分數(shù)(LVEF)，起到保護心肌損傷作用[46]。電針尚可通過上調(diào)miR-146a激活膽堿能抗炎通路，降低促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及高遷移率族蛋白-1水平，從而提升膿毒癥小鼠生存率，減輕全身炎癥反應和臟器損傷[47]，效果顯著。

4 小結(jié)

膿毒癥隸屬于中醫(yī)外感發(fā)熱范疇[48]，因熱毒邪入營血，瘀滯于脈，侵襲臟腑，氣血津液不足，不能濡養(yǎng)臟腑及四肢百骸，致臟腑精氣虛衰。針灸這一傳統(tǒng)治療手段在膿毒癥中的運用不僅是對中華傳統(tǒng)醫(yī)學的繼承與發(fā)揚，更為膿毒癥的治療開辟了新的方向。

針灸對機體生理、病理過程具有多系統(tǒng)、多臟器與多靶點的整體綜合性干預特點，在體內(nèi)可引起包括基因、蛋白與代謝等多個層面的反應，是預防和治療膿毒癥的方法之一，而大量研究表明miRNA通過調(diào)控靶基因表達影響膿毒癥相關信號通路，在膿毒癥的不同病理階段發(fā)揮重要生物學作用，是基因表達調(diào)控網(wǎng)絡中的關鍵一員，也是目前很有前景的一類新的生物學標志物，可作為判斷膿毒癥預后的新靶點，因此基于miRNA研究針灸在膿毒癥中的治療作用可能是闡明針灸治療膿毒癥作用機制的有效手段，借助基因組學的相關方法和技術，將有助于進一步深入、系統(tǒng)地揭示針灸治療膿毒癥的分子生物學機制。

然而，目前從miRNA角度觀察針灸治療膿毒癥的報道不多。很多miRNAs均能在膿毒癥的診治中發(fā)揮作用，今后的研究可以多從這些方面入手，以針灸為干預手段觀察不同miRNA在膿毒癥中的變化，從而從基因水平為針灸領域的研究提供更多證據(jù)，以期進一步明確針灸的作用機制。但仍有一些問題尚待解決。目前基于miRNA-膿毒癥的文獻研究發(fā)現(xiàn)體外細胞培養(yǎng)較多、實驗動物的在體實驗較少，而研究針灸的作用機制勢必要在活體動物上進行操作，有關miRNA的抑制劑或生物類似物的體內(nèi)注入并沒有統(tǒng)一公認的劑量規(guī)范，亦缺乏對miRNA的抑制劑或生物類似物的作用時效研究，對其死亡率及成功率尚未有明確的循證醫(yī)學證據(jù)。此外，基于針灸的一些基礎科學問題，比如針灸的干預方式、刺激量、穴位特異性、腧穴配伍及穴位敏化研究等，仍需進行多中心、大樣本的隨機雙盲臨床觀察及動物實驗研究，增加可比性、可重復性，通過miRNA表達調(diào)控的研究等，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面更深入加強對針灸作用規(guī)律和物質(zhì)基礎的認知，進一步挖掘針灸的調(diào)控機制并發(fā)現(xiàn)治療膿毒癥的新靶點。

此外，膿毒癥不同的病理進程及不同器官的功能損傷其介導的miRNA可能不盡相同，所采用的針灸干預方式及腧穴配伍選擇亦會有所差異，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的針灸治療膿毒癥的評判標準，仍需借助基因數(shù)據(jù)庫等生物信息技術篩選并驗證符合該病理階段及該器官功能的特征miRNA，并制定出特質(zhì)化的優(yōu)化方案，全程、動態(tài)和全方位地把握針灸治療膿毒癥在不同時期、不同臟器的效應規(guī)律和機制，并盡可能探索其內(nèi)在的相互作用關系，為針灸治療膿毒癥的臨床應用及推廣提供堅實可靠的科學依據(jù)。